Live-Cell-Imaging von wandernden Zellen mit dem Ausdruck Fluoreszenz-markierten Proteinen in einer dreidimensionalen Matrix
Summary
Zellulären Prozessen wie Zellmigration haben sich traditionell auf zweidimensionale, steifen Kunststoff-Oberflächen untersucht. Dieser Bericht beschreibt eine Technik zur direkten Visualisierung von Protein-Lokalisierung und Analyse von Protein-Dynamik in Zellen wandern in eine physiologisch relevante, dreidimensionale Matrix.
Abstract
Traditionell wurde die Zellwanderung auf zweidimensionalen, steife Kunststoff-Oberflächen untersucht. Doch bei wichtigen biologischen Prozessen wie der Wundheilung, Geweberegeneration und Krebs Metastasen, müssen die Zellen durch komplexe, dreidimensionale extrazelluläre Gewebe zu navigieren. Zum besseren Verständnis der Mechanismen hinter diesen biologischen Prozessen ist es wichtig, die Rolle der Proteine verantwortlich für den Antrieb Zellmigration zu untersuchen. Hier skizzieren wir ein Protokoll, um die Mechanismen der Zell-Migration mit der epithelialen Zelllinie (MDCK)-Studie, und eine dreidimensionale, faserig, Selbst-Polymerisation von Matrix als Modellsystem. Diese optisch klare extrazellulären Matrix ist leicht zugänglich live-cell imaging Studien und besser imitiert die physiologische, Weichteil-Umgebung. Dieser Bericht zeigt eine Technik für die direkte Visualisierung von Protein-Lokalisierung und Dynamik, und die Verformung des umgebenden dreidimensionalen Matrix.
PrüfungEliminierung von Protein-Lokalisierung und Dynamik bei zellulären Prozessen bietet wichtige Einblicke in Protein-Funktionen. Genetisch kodierte fluoreszierende Tags bieten eine einzigartige Methode zur Beobachtung Proteinlokalisierung und Dynamik. Mit dieser Technik können wir die subzelluläre Ansammlung von Schlüssel zu analysieren, Kraft generierenden Komponenten des Zytoskeletts in Echtzeit, wie die Zelle Manöver durch die Matrix. Darüber hinaus mit mehreren fluoreszierenden Markierungen mit unterschiedlichen Wellenlängen, können wir die Ortung von mehreren Proteinen gleichzeitig, so dass wir zu testen, zum Beispiel, ob unterschiedliche Proteine ähnliche oder unterschiedliche Rollen haben. Darüber hinaus kann die Dynamik der Fluoreszenz-markierten Proteinen quantifiziert unter Verwendung von fluoreszierenden Recovery After Photobleaching (FRAP) Analyse sein. Diese Messung Assays das Protein Mobilität und wie stabil gebunden werden die Proteine, die Zytoskelett-Netzwerks.
Durch die Kombination von live-cell imaging mit der Behandlung von Protein-Funktion Inhibitoren,Wir können in Echtzeit die Änderungen in der Verteilung der Proteine und die Morphologie der wandernden Zellen zu untersuchen. Darüber hinaus kombinieren wir auch live-cell imaging mit der Verwendung von fluoreszierenden Tracer-Partikel in der Matrix eingebettet werden, um die Matrix Verformung während der Zellmigration zu visualisieren. So können wir visualisieren, wie eine wandernde Zelle krafterzeugenden Proteine verteilt, und wo die Zugkräfte auf die umgebende Matrix ausgeübt. Durch diese Techniken können wir wertvolle Einblicke in die Rolle von spezifischen Proteinen und ihre Beiträge zu den Mechanismen der Zellwanderung zu gewinnen.
Protocol
Discussion
Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Verwendung live-cell imaging, die Mechanismen der Zellwanderung in einer dreidimensionalen Matrix zu studieren. Der Erfolg dieses Verfahrens hängt von den Erhalt "gut" Klone stabil exprimieren GFP-markierten Proteine. Das niedrige Niveau der GFP-Proteine erfordert einen Überschuss Anregung Exposition der Zelle Gesundheit Kompromisse, während ein zu hoher GFP Ebene unerwünschte Nebenwirkungen auf die Zelle haben wird. Somit ist der Vektor Wahl, um Gene in Zellen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Grant Sumida für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch einen Beckman Young Investigator Award (SY), ein Hellman Familie New Faculty Award (SY), ein NIH EUREKA, die University of California Cancer Research Coordinating Committee unterstützt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Collagen, bovine, Type I | BD Biosciences | 354231 | Stock is about 3 mg/ml |
| 3-aminopropyltrimethoxysilane | Sigma Aldrich | 281778 | Dilute in water |
| glutaraldehyde | Sigma Aldrich | 340855 | Dilute in PBS |
| 1M Hepes | Invitrogen | 15630-080 | |
| Fluospheres polystyrene microspheres 1 µm, red fluorescence (580/605) | Invitrogen | F13083 | |
| Geneticin (G418) | Invitrogen | 11811-031 | |
| Culture media components: | |||
| DMEM | Invitrogen | 31600-034 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S115500 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Kanamycin | Invitrogen | 15160-054 | |
References
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