Imagerie des cellules vivantes des cellules exprimant des protéines par fluorescence Migration-étiquetés dans une matrice tridimensionnelle
Summary
Processus cellulaires tels que la migration des cellules ont traditionnellement été étudié sur deux dimensions, les surfaces en plastique rigide. Ce rapport décrit une technique pour visualiser directement la localisation des protéines et l'analyse de la dynamique des protéines dans les cellules de migrer dans un plus physiologiquement pertinents, en trois dimensions de la matrice.
Abstract
Traditionnellement, la migration cellulaire a été étudié sur deux dimensions, les surfaces en plastique rigide. Toutefois, au cours des processus biologiques importants tels que la cicatrisation des plaies, la régénération des tissus, et les métastases du cancer, les cellules doivent naviguer à travers complexe, en trois dimensions du tissu extracellulaire. Afin de mieux comprendre les mécanismes derrière ces processus biologiques, il est important d'examiner les rôles des protéines responsables de la conduite de migration cellulaire. Ici, nous présentons un protocole d'étudier les mécanismes de la migration cellulaire en utilisant la lignée cellulaire épithéliale (MDCK), et un en trois dimensions, fibreuse, autopolymérisant matrice comme un système modèle. Cette matrice extracellulaire est optiquement clair facilement s'adapter à des études d'imagerie des cellules vivantes et mieux imite le physiologiques, l'environnement des tissus mous. Ce rapport démontre une technique pour visualiser directement la localisation des protéines et la dynamique, et la déformation de la entourant matrice tridimensionnelle.
Exammination de la localisation des protéines et la dynamique des processus cellulaires au cours donne un aperçu de la clé dans les fonctions des protéines. Génétiquement codés étiquettes fluorescentes offrent une méthode unique pour l'observation de la localisation des protéines et de dynamique. En utilisant cette technique, nous pouvons analyser l'accumulation intracellulaire de la clé, la force génératrice de composants du cytosquelette en temps réel que les manœuvres des cellules à travers la matrice. De plus, en utilisant de multiples balises fluorescentes avec différentes longueurs d'onde, nous pouvons examiner la localisation de protéines multiples simultanément, nous permettant ainsi de tester, par exemple, si différentes protéines ont des rôles similaires ou divergents. Par ailleurs, la dynamique des protéines par fluorescence marqués peuvent être quantifiés à l'aide de récupération fluorescent après photoblanchiment (FRAP) analyse. Cette mesure de la mobilité des dosages des protéines et comment stablement lié les protéines sont sur le réseau du cytosquelette.
En combinant imagerie des cellules vivantes avec le traitement des inhibiteurs de la fonction des protéines,nous pouvons examiner en temps réel l'évolution de la répartition des protéines et la morphologie des cellules migrantes. Par ailleurs, nous aussi combiner imagerie des cellules vivantes avec l'utilisation de particules de traceur fluorescent incorporé dans la matrice pour visualiser la déformation de matrice lors de la migration cellulaire. Ainsi, nous pouvons visualiser comment une cellule migration distribue la force génératrice de protéines, et où les forces de traction sont exercées à la matrice environnante. Grâce à ces techniques, nous pouvons avoir un aperçu précieux sur les rôles des protéines spécifiques et de leurs contributions aux mécanismes de la migration cellulaire.
Protocol
Discussion
Nous décrivons ici une méthode pour utiliser imagerie des cellules vivantes pour étudier les mécanismes de la migration de cellules dans une matrice tridimensionnelle. Le succès de cette technique dépend de l'obtention de "bons" clones exprimant de façon stable la GFP-tagged protéines. Le faible niveau de protéines GFP, il faudra une exposition d'excitation en excès qui compromet la santé des cellules, alors que le niveau trop élevé GFP aura des effets secondaires indésirables sur la cell…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Grant Sumida pour une lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par une bourse de jeune chercheur Beckman (SY), une famille Hellman Faculté nouveau prix (SY), un EUREKA NIH, l'Université de Californie recherche sur le cancer comité de coordination.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Collagen, bovine, Type I | BD Biosciences | 354231 | Stock is about 3 mg/ml |
| 3-aminopropyltrimethoxysilane | Sigma Aldrich | 281778 | Dilute in water |
| glutaraldehyde | Sigma Aldrich | 340855 | Dilute in PBS |
| 1M Hepes | Invitrogen | 15630-080 | |
| Fluospheres polystyrene microspheres 1 µm, red fluorescence (580/605) | Invitrogen | F13083 | |
| Geneticin (G418) | Invitrogen | 11811-031 | |
| Culture media components: | |||
| DMEM | Invitrogen | 31600-034 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S115500 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Kanamycin | Invitrogen | 15160-054 | |
References
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