Summary
Vi presenterer en metode for å bruke MALDI massespektrometri og reduktive metylering kjemi å kvantifisere endringer i lysin metylering.
Abstract
Nylig har epigenetic regulatorer blitt oppdaget som sentrale aktører i mange ulike sykdommer 1-3. Som et resultat av disse enzymene er førsteklasses mål for lite molekyl studier og legemiddelutvikling 4. Mange epigenetic regulatorer har bare nylig blitt oppdaget og er fortsatt i ferd med å bli klassifisert. Blant disse enzymene er lysin demethylases som fjerner metylgrupper fra lysines på histoner og andre proteiner. På grunn av romanen karakter av denne klassen enzymer, er det få analyser er utviklet for å studere deres aktivitet. Dette har vært en veisperring til både klassifisering og høy gjennomstrømning studie av histone demethylases. Foreløpig svært få demethylase analyser foreligger. De som gjør eksisterer tendens til å være kvalitativ i naturen og kan ikke samtidig skjelne mellom de forskjellige lysin metylering tilstander (un-, mono-, di-og tri-). Massespektrometri er vanlig å bestemme demethylase aktivitet men dagens massespektrometrisk analyser doikke ta om differensielt denaturert peptider ionisere annerledes. Differensiert ionisering av denaturert peptider gjør sammenligne metylering stater vanskelig og slett ikke kvantitativ (figur 1A). Dermed tilgjengelige analysene ikke er optimalisert for omfattende analyse av demethylase aktivitet.
Her beskriver vi en metode som kalles MassSQUIRM (massespektrometrisk kvantifisering ved hjelp av isotoper reduktive metylering) som er basert på reduktive metylering av aminer grupper med deuterert formaldehyd å tvinge alle lysines å være di-denaturert, og dermed gjør dem i hovedsak de samme kjemiske stoffer og derfor ionisere samme (Figur 1B). Den eneste kjemiske forskjellen etter reduktiv metylering er hydrogen og deuterium, som ikke påvirker MALDI ionisering effektivitet. Den MassSQUIRM analysen er spesifikk for demethylase reaksjonsprodukter med un-, mono-eller di-denaturert lysines. Analysen er også aktuelt å lysin methyltransferases gir SAmeg reaksjonsprodukter. Her bruker vi en kombinasjon av reduktiv metylering kjemi og MALDI massespektrometri å måle aktiviteten til LSD1, en lysin demethylase stand til å fjerne di-og mono-metylgrupper, på en syntetisk peptid substrat 5. Denne analysen er enkel og lett mottakelig for noen lab med tilgang til en MALDI massespektrometer i laboratoriet eller gjennom en proteomikk anlegget. Analysen har ~ 8-fold dynamisk rekkevidde og er lett skalerbar til plate-format fem.
Protocol
Denne protokollen er endret fra Blair et al. 6.
1. LSD1 demetylering Assay
- I en endelig volum på 20 mL, kombinere 125 ng rekombinant LSD1 med 0,25 mg di-methyl histone H3 peptid (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotin) i demethylase buffer (50 mM Tris-Cl 8,5 pH, 50 mM KCl, 5 mm MgCl 2, 5% glyserol). I tillegg utfører et peptid alene kontroll uten enzym. Kontrollen er for seksjon 3 og trenger ikke reduktiv metylering.
- Inkuber i 2 timer ved 37 ° C.
- Å samle peptider, legge til 8 mL Poros R2 20 mikron perler til hver prøve og agitere for 15 minutter ved romtemperatur. Forbered Poros perler ved å henge en volum av perler med en volum av metanol, og deretter legge til 10 bind av 5% maursyre / 0,2% TFA.
- Tilstand to C 18 ZipTips ved å aspirere 20 mL på 0,1% TFA i spissen, og skyve den ut igjen med en pipettor. Gjør dette to ganger med 0,1% TFA, fire ganger med 70% acetonitril / 0,1% TFA, og fire ganger igjen med 0,1% TFA.
- Legge de to utvalgene (kontroll og demethylase reaksjon) på de betingede C 18 ZipTips ved pipettering perlen slurry bak C 18 harpiksen i ZipTips og presser volumet gjennom med en pipettor.
- Vask ZipTips to ganger med 20 mL på 0,1% TFA.
- Eluer i 40 mL 70% acetonitril / 0,1% TFA.
- Lyophilize hver eluant helt med en SpeedVac konsentrator.
2. Reduktiv Metylering
Denne delen av protokollen er endret fra Blair et al. Og Rayment et al. 6,7.
- Re-suspendere demethylase reaksjonen i 100 mL av 50 mM fosfatbuffer, 7,4 pH.
- Til demethylase reaksjonen, legger 8 mL av 15 mg / ml Borane dimetylamin. Borane dimetylamin er oppløst i 50 mM fosfatbuffer, 7,4 pH, for å gi 15 mg / ml stamløsning.Dette bør gjøres frisk.
- Til demethylase reaksjonen, legger 16 mL av 250 mm deuterert formaldehyd. Den 250 mm deuterert formaldehyd er utarbeidet ved å fortynne aksjen i H 2 0. Dette bør gjøres frisk.
- Inkuber ved 4 ° C i 2 timer.
- Gjenta trinn 2.2, 2.3 og 2.4.
- Gjenta steg 2.2.
- Inkuber ved 4 ° C i ~ 15 timer.
- Til demethylase prøven, legger 12,5 mL av 1M Tris, pH 7,4 for å slukke den reduktive metylering reaksjonen.
3. MALDI massespektrometri
- Legg Poros R2 20 mikron perler til demethylase reaksjonen, og samle på ZipTips som beskrevet i trinn 1.3-1.6.
Merk: Re-suspendere kontrollen i 100 mL av 50 mM fosfatbuffer, 7,4 pH og behandle som den andre prøven fra punkt 3.1.
- Eluer kontroll og demethylase reaksjon prøver fra ZipTips på en MALDI utvalg plate ved hjelp av to mL 33% mettetd 2,5-dihydroxybenzoic syre. For å forberede 33% 2,5-dihydroxybenzoic syre, lage en mettet løsning av 2,5-dihydroxybenzoic syre i 70% acetonitril / 0,1% TFA og deretter fortynnes til 33% mettet i 70% acetonitril / 0,1% TFA. La eluted prøvene tørke og krystallisere.
- Samle masse spektra ved hjelp av en PerkinElmerSciex MALDI-prOTOF massespektrometer eller tilgjengelig høyoppløselig MALDI massespektrometer 8,9,10.
- Vis spektra og trekke peak områder ved hjelp PerkinElmerSciex TOFworks programvare eller programvare levert av massespektrometer produsenten.
- Kontroller reaksjonsprodukter ved MS 2 med et tilgjengelig massespektrometrisk system som gir tandem massespektrometri evner.
4. Data Analysis
- For å kompensere for de isotop overlapp opprettet ved hjelp av tung formaldehyd (figur 1B), bestemme peak området (A) forholdet mellom 13 C 2 og 13 C 4 isotoper relative til monoisotopic topp for kontrollutvalget, som ikke har gjennomgått reduktive metylering (Fig. 2A).
Eq 1: A 13C2 / A 12C = r 1
Eq 2: En 13C4 / A 12C = r 2
Dette vil gi deg forholdet mellom peptid eksisterende i disse isotoper statene (r 1 & r 2) spesifikke for eksperimentet og massespektrometer. - Bruk R 1 & R 2 verdier i de følgende formler for å kvantifisere den relative mengden peptid som eksisterer i hver modifikasjon tilstand i demethylase reaksjonen prøven (Fig. 2B):
Eq 3: H3K4me2 = A 1
Eq 4: H3K4me = A 2 - r 1 (A 1)
Eq 5: H3K4 = A 3 - r 2 (A 1) - [r 1 (A 2 - r 1 (A 1))]
5. Representative Resultater
Ved hjelp LSD1, viser vi effekten av MassSQUIRM for å kvantifiserelysin demetylering. Som beskrevet i protokollen tekstdelen, utførte vi en demethylase analysen med 125 ng av LSD1 og 0,25 mg di-methyl histone H3 peptid (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotin). Kontrollen og demethylase reaksjon prøvene ble utsatt for reduktiv metylering og MALDI massespektrometri. Kontrollen reaksjon som ikke gjennomgår reduktive metylering viste den typiske isotoper konvolutten for dette peptid og gitt topp områder for likninger 1 og 2 (figur 2a). Massen spektrum for demethylase reaksjonen tilgjengelig Peak områder for likningene 3-5 (figur 2B). Bruke topp områdene fra kontroll og demethylase reaksjon, fant vi ut at LSD1 demetylert peptid å gi denne reaksjonen produkter: 33,7% di-metyl Lys4, 42,3% mono-metyl Lys4, og 24% un-rødsprit Lys 4. Referer til Blair et al. For full analyse av LSD1 demethylase aktivitet samt hemmer studier 6. Oppmerksom på at endring variabler som reaksjonstid, enzymkonsentrasjon og underlaget konsentrasjon vil gi rom for en grundig analyse av aktivitet.
Figur 1. MassSQUIRM oversikt. (A) En N-terminal peptid fra histone H3 vises som un-(grønn), mono-(rød), eller di-(blå) denaturert ved lysin 4. Variasjon i den kjemiske sammensetningen av hver peptid fører til differensial ionisering gjør kvantifisering kompleks. (B) reduktive metylering konverterer alle lysin rester til di-metyl tilstand som fører til at alle peptider å ionisere tilsvarende. Bruken av tunge formaldehyd i reduktiv metylering reaksjonen tillater oppbevaring av identiteten til den opprinnelige metylering. Åpne sirkler indikerer lys metylering mens lukkede sirkler indikerer tung metylering. Modifisert fra Blair et al. 2011 6.
Figure to. MassSQUIRM kan brukes til å kvantifisere ulikt denaturert peptider. (A) En di-rødsprit syntetisk histone H3 peptid (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotin) ble analysert ved hjelp av massespektrometri og topp forhold i forhold til monoisotopic toppen ble registrert som r 1 og r 2 i ligninger 1 og 2. (B) Det samme syntetiske peptid ble inkubert med 125 ng LSD1 i demethylase buffer for to timer ved 37 ° C. Prøvene ble deretter utsatt for MassSQUIRM analyse. En blandet befolkning av overlappende topper representerer tre ulike metylering tilstander som vist på figur 1B. Områder under monoisotopic toppene ble registrert som A 1, A 2 og A 3. Peak områder ble brukt i ligninger 3-5. Åpne sirkler indikerer lys metylering mens lukkede sirkler indikerer tung metylering. Modifisert fra Blair et al. 2011 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MassSQUIRM er en billig og kvantitativ metode for helhetlig analyse av aktiviteten til lysin demethylases involvert i mono-og di-metylering. MassSQUIRM tilbyr kvantifisering ikke bare av produktet av reaksjonen, men også for mellomprodukter. Denne analysen kan brukes som et kraftig verktøy i å studere mekanismen av LSD1 og andre histone demethylases. Det vil også være nyttig for å klassifisere mange nyoppdagede lysin demethylase enzymer som PHF8 og kan brukes til visse metyltransferase enzymer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker UAMS Proteomikk Facility for massespektrometrisk støtte. Midler til dette prosjektet ble gitt av NIH tilskudd P20RR015569, P20RR016460 og R01DA025755.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSD1 | BPS Biosciences | 50100 | |
| H3K4me2-biotin peptide | Prepared in Lab | none | |
| POROS R2 20 micron beads | Applied Biosystems | 1-1129-06 | |
| C18 ZipTip | EMD Millipore | ZTC18M | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 28904 | |
| acetonitrile | Fisher Scientific | A996 | |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 85707 | |
| Borane dimethylamine | Sigma-Aldrich | 180238 | |
| isotopically heavy d2-formaldehyde | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-805-20 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP154 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33 | |
| Formic acid | Fluka | 06440 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452 | |
| Na-phosphate | Fisher Scientific | BP329 | |
| SpeedVac Concentrator | Savant | DNA110 | |
| MALDI-prOTOF mass spectrometer and TOFworks software | PerkinElmer, Inc. | none |
References
- Goldberg, A. D., Allis, C. D., Bernstein, E. Epigenetics: a landscape takes shape. Cell. 128, 635-638 (2007).
- Kouzarides, T.
- Blair, L. P., Cao, J., Zou, M. R., Sayegh, J., Yan, Q. Epigenetic Regulation by Lysine Demethylase 5 (KDM5) Enzymes in Cancer. Cancers (Basel). 3, 1383-1404 (2011).
- Cole, P. A. Chemical probes for histone-modifying enzymes. Nat. Chem. Biol. 4, 590-597 (2008).
- Shi, Y. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell. 119, 941-953 (2004).
- Blair, L. P. MassSQUIRM: An assay for quantitative measurement of lysine demethylase activity. Epigenetics. 6, 490-499 (2011).
- Rayment, I. Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor. Science. 261, 50-508 (1993).
- Collom, S. L., Jamakhandi, A. P., Tackett, A. J., Radominska-Pandya, A., Miller, G. P. CYP2E1 active site residues in substrate recognition sequence 5 identified by photoaffinity labeling and homology modeling. Arch. Biochem. Biophys. 459, 59-69 (2007).
- Gradolatto, A. Saccharomyces cerevisiae Yta7 Regulates Histone Gene Expression. Genetics. 179, 291-304 (2008).
- Taverna, S. D. Yng1 PHD finger binding to histone H3 trimethylated at lysine 4 promotes NuA3 HAT activity at Lysine 14 of H3 and transcripiton at a subset of targeted ORFs. Mol. Cell. 24, 785-796 (2006).
