Summary
We presenteren een methode voor het gebruik van MALDI massaspectrometrie en reductieve methylatie chemie op veranderingen in de lysine-methylatie te kwantificeren.
Abstract
Onlangs hebben epigenetische regelgevende instanties zijn ontdekt als belangrijke spelers in een groot aantal verschillende ziekten 1-3. Als gevolg hiervan, deze enzymen zijn primaire doelen voor kleine molecule studies en de ontwikkeling van geneesmiddelen 4. Veel epigenetische regelgevende instanties hebben pas sinds kort ontdekt en zijn nog steeds in het proces worden gekwalificeerd. Onder deze enzymen lysine demethylases die methylgroepen uit lysines op histonen en andere eiwitten. Door de nieuwe karakter van deze klasse van enzymen, weinig assays ontwikkeld om de activiteit te bestuderen. Dit is een blokkade om zowel de indeling en hoge doorvoer studie van histon demethylases. Op dit moment zeer weinig demethylase testen bestaan. Degenen die wel bestaan, hebben de neiging om kwalitatief van aard en kan niet tegelijkertijd onderscheid maken tussen de verschillende lysine-methylatie staten (un-, mono-, di-en tri-). Massaspectrometrie wordt vaak gebruikt om demethylase activiteit te bepalen, maar de huidige massaspectrometrische analyses te doenniet in op de vraag of differentieel gemethyleerd peptiden anders ioniseren. Differentiële ionisatie van gemethyleerde peptiden maakt het vergelijken van methylatie staten moeilijk en zeker niet kwantitatief (figuur 1a). Zo beschikbare tests zijn niet geoptimaliseerd voor de uitgebreide analyse van demethylase activiteit.
Hier beschrijven een methode MassSQUIRM (massaspectrometrische kwantificering met isotopen reductieve methylering) die is gebaseerd op de reductieve methylering van aminegroepen met gedeutereerde formaldehyde dwingen alle lysines zijn di-gemethyleerde, waardoor zij in wezen dezelfde chemische stof en derhalve de ioniseren zelfde (figuur 1b). Het enige verschil chemische na reductieve methylering waterstof en deuterium, die geen invloed MALDI ionisatie efficiëntie. De MassSQUIRM assay is specifiek voor demethylase reactieprodukten met on-mono-of di-methyl lysines. De test is ook van toepassing op lysine-methyl-geven van de same reactieproducten. Hier wordt een combinatie van reductieve methylering chemie en MALDI massaspectrometrie van de activiteit van LSD1 meten, een lysine demethylase kan verwijderen di-en mono-methyl groepen, een synthetisch peptide substraat 5. Deze test is eenvoudig en lastig om een lab toegang tot een MALDI massaspectrometer lab of via een proteomics faciliteit. De test heeft ~ 8-voudige dynamisch bereik en is gemakkelijk schaalbaar tot plaat-formaat 5.
Protocol
Dit protocol wordt gewijzigd van Blair et al.. 6.
1. LSD1 demethylatie Assay
- In een eindvolume van 20 ul, combineren 125 ng recombinant LSD1 met 0,25 pg di-methyl histoon H3 peptide (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotine) in demethylase buffer (50 mM Tris-Cl pH 8,5, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 5% glycerol). Bovendien voert een peptide alleen controle zonder enzym. De besturing is voor sectie 3 en hoeft niet reductieve methylatie.
- Incubeer 2 uur bij 37 ° C.
- Om de peptiden verzamelen voeg 8 pi POROS R2 20 micron korrels aan elk monster en roeren gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Bereid POROS kralen door de schorsing van 1 volume van kralen met een volume van methanol, en voeg dan 10 volumes van 5% mierenzuur / 0,2% TFA.
- Voorwaarde twee C 18 ZipTips door opzuigen 20 pl van 0,1% TFA in de tip en duwen weer naar buiten met een pipet. Doe dit twee keer met 0,1% TFA, viermaal met 70% acetonitril / 0,1% TFA en vier keer opnieuw met 0,1% TFA.
- Plaats de twee monsters (controle en de demethylase reactie) op de geconditioneerde C 18 ZipTips door pipetteren de kraal slurry achter de C 18 hars in de ZipTips en duwen het volume door met een pipet.
- Tweemaal wassen ZipTips met 20 pi 0,1% TFA.
- Elueren in 40 ul van 70% acetonitril / 0,1% TFA.
- Volledig Lyophilize elk elutiemiddel met SpeedVac concentrator.
2. Reductieve methylering
Dit gedeelte van het protocol wordt gewijzigd van Blair et al.. En Rayment et al.. 6,7.
- Resuspendeer de demethylase reactie in 100 ul 50 mM fosfaatbuffer, pH 7,4.
- Om de demethylase reactie voeg 8 pi van 15 mg / ml boraan dimethylamine. Boraan dimethylamine wordt opgelost in 50 mM fosfaatbuffer, pH 7,4, de 15 mg / ml voorraadoplossing geven.Dit moet worden vers gemaakt.
- Om de demethylase reactie, voeg 16 ul van 250 mM gedeutereerde formaldehyde. De 250 mM gedeutereerde formaldehyde wordt bereid door verdunning van de voorraad in H 2 0. Dit moet worden vers gemaakt.
- Incubeer bij 4 ° C gedurende 2 uur.
- Herhaal stap 2.2, 2.3 en 2.4.
- Herhaal stap 2.2.
- Incubeer bij 4 ° C ~ 15 uur.
- Om de demethylase monster, voeg 12,5 ul van 1 M Tris, pH 7,4 op de reductieve methylatie reactie te lessen.
3. MALDI massaspectrometrie
- Voeg POROS R2 20 micron kralen aan de demethylase reactie, en te verzamelen over ZipTips zoals beschreven in stappen 1.3-1.6.
Opmerking: De resuspendeer in 100 pi 50 mM fosfaatbuffer, pH 7,4 en behandelen het andere monster vanaf stap 3.1.
- Elueer de controle en demethylase reactie monsters uit de ZipTips op een MALDI monster plaat met 2 pl van 33% te verzadigend 2,5-dihydroxybenzoëzuur. Om de 33% te bereiden 2,5-dihydroxybenzoëzuur, een verzadigde oplossing van 2,5-dihydroxybenzoëzuur in 70% acetonitril / 0,1% TFA en vervolgens verdunnen tot 33% verzadigd 70% acetonitril / 0,1% TFA. Laat de geëlueerde monsters te drogen en kristalliseren.
- Verzamel massa spectra met een PerkinElmerSciex MALDI-prOTOF massaspectrometer of beschikbaar hoge resolutie MALDI massaspectrometer 8,9,10.
- Bekijk spectra en pak piek gebieden met behulp van PerkinElmerSciex TOFworks software of software die door de massaspectrometer fabrikant.
- Controleer of de reactie producten door MS 2 met een beschikbare massaspectrometrische systeem dat tandem massaspectrometrische mogelijkheden.
4. Data-analyse
- Ter compensatie van de isotopen overlapping die met zware formaldehyde (figuur 1B) bepalen oppervlakte (A) verhouding van 13 C 2 en 13 C 4 isotopen relative de mono-isotopische piek voor de controlemonster die geen behandeling heeft ondergaan reductieve methylering (Fig. 2A).
Eq 1: Een 13C2 / A 12C = r 1
Eq 2: Een 13C4 / A 12C = r 2
Dit geeft je de verhouding van peptide bestaande in deze isotopische staten (r 1 & r 2) specifiek voor uw experiment en massaspectrometer. - Gebruik de r 1 en r 2 waarden in de volgende formules voor het kwantificeren van de relatieve hoeveelheid peptide in elke wijziging staat in de demethylase reactie monster (Fig. 2B):
Eq 3: H3K4me2 = A 1
Eq 4: H3K4me = A 2 - r 1 (A 1)
Eq 5: H3K4 = A 3 - r 2 (A 1) - [r 1 (A 2 - r 1 (A 1))]
5. Representatieve resultaten
Met behulp van LSD1, laten we de effectiviteit van MassSQUIRM voor het kwantificeren vanlysine demethylering. Zoals beschreven in het protocol tekstdeel, voerden we een demethylase assay met 125 ng LSD1 en 0,25 ug di-methyl histoon H3 peptide (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotine). De controle en demethylase reactie monsters werden onderworpen aan reductieve methylering en MALDI massaspectrometrie. De controle reactie die niet onderworpen reductieve methylering vertoonden de typische isotopische middelen voor het peptide en piekoppervlakken voorzien vergelijkingen 1 en 2 (figuur 2A). De massaspectrum voor demethylase reactie waarin piekoppervlakken voor vergelijkingen 3-5 (figuur 2B). De piekoppervlakken van de controle en demethylase reactie we vastgesteld dat LSD1 het peptide gedemethyleerd de volgende reactie producten geven: 33,7% di-methyl Lys4, 42,3% mono-methyl Lys4 en 24% niet-gemethyleerde Lys 4. Zie Blair et al.. Voor de volledige analyse van LSD1 demethylase activiteit evenals remmer studies 6. Merk op dat veranderende variabelen zoals reactietijd, enzymconcentratie en substraat concentratie zal zorgen voor een diepgaande analyse van de activiteit.
Figuur 1. MassSQUIRM overzicht. (A) N-terminale peptide van histoon H3 wordt als niet-(groen), mono-(rood), of di-(blauw) gemethyleerd aan lysine 4. Variatie in de chemische samenstelling van elk peptide leidt tot een verschillende ionisatie maken kwantificering complex. (B) reductieve methylering zet alle lysineresten de di-methyl toestand waardoor alle peptiden op soortgelijke ioniseren. Het gebruik van zware formaldehyde in de reductieve methyleringsreactie kan behoud van de identiteit van de oorspronkelijke methylatie. Open cirkels geven licht methylatie, terwijl gesloten cirkels geven aan zware methylatie. Gewijzigd van Blair et al.. 2011 6.
Figure 2. MassSQUIRM kan worden differentieel gemethyleerd peptiden kwantificeren. (A) een di-gemethyleerde synthetische histoon H3 peptide (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotine) werd geanalyseerd met behulp van massaspectrometrie en piek verhoudingen ten opzichte van de mono-isotopische piek werden waargenomen als R1 en R2 in de vergelijkingen 1 en 2. (B) Dezelfde synthetische peptide geïncubeerd met 125 ng LSD1 in demethylase buffer gedurende twee uur bij 37 ° C. Monsters werden vervolgens onderworpen aan analyse MassSQUIRM. Een gemengde populatie van overlappende pieken betekent drie methylering toestanden zoals in figuur 1B. Werkingssfeer van de mono-isotopische pieken werden genoteerd als A 1, A 2 en A 3. Piekoppervlakken werden vergelijkingen 3-5. Open cirkels geven licht methylatie, terwijl gesloten cirkels geven aan zware methylatie. Gewijzigd van Blair et al.. 2011 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MassSQUIRM is een goedkope en kwantitatieve methode voor een uitgebreide analyse van de activiteit van lysine demethylases betrokken bij de mono-en di-methylatie. MassSQUIRM biedt kwantificering niet alleen van het product van de reactie, maar ook voor de tussenproducten. Deze test kan worden gebruikt als een krachtig middel bestuderen het mechanisme van LSD1 en histon demethylases. Het is ook bruikbaar voor de indeling vele nieuw ontdekte lysine demethylase enzymen zoals PHF8 en kunnen worden gebruikt voor bepaalde methyltransferase enzymen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken de UAMS Proteomics Faciliteit voor massaspectrometrische ondersteuning. De financiering voor dit project werd verzorgd door NIH subsidies P20RR015569, P20RR016460 en R01DA025755.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSD1 | BPS Biosciences | 50100 | |
| H3K4me2-biotin peptide | Prepared in Lab | none | |
| POROS R2 20 micron beads | Applied Biosystems | 1-1129-06 | |
| C18 ZipTip | EMD Millipore | ZTC18M | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 28904 | |
| acetonitrile | Fisher Scientific | A996 | |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 85707 | |
| Borane dimethylamine | Sigma-Aldrich | 180238 | |
| isotopically heavy d2-formaldehyde | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-805-20 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP154 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33 | |
| Formic acid | Fluka | 06440 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452 | |
| Na-phosphate | Fisher Scientific | BP329 | |
| SpeedVac Concentrator | Savant | DNA110 | |
| MALDI-prOTOF mass spectrometer and TOFworks software | PerkinElmer, Inc. | none |
References
- Goldberg, A. D., Allis, C. D., Bernstein, E. Epigenetics: a landscape takes shape. Cell. 128, 635-638 (2007).
- Kouzarides, T.
- Blair, L. P., Cao, J., Zou, M. R., Sayegh, J., Yan, Q. Epigenetic Regulation by Lysine Demethylase 5 (KDM5) Enzymes in Cancer. Cancers (Basel). 3, 1383-1404 (2011).
- Cole, P. A. Chemical probes for histone-modifying enzymes. Nat. Chem. Biol. 4, 590-597 (2008).
- Shi, Y. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell. 119, 941-953 (2004).
- Blair, L. P. MassSQUIRM: An assay for quantitative measurement of lysine demethylase activity. Epigenetics. 6, 490-499 (2011).
- Rayment, I. Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor. Science. 261, 50-508 (1993).
- Collom, S. L., Jamakhandi, A. P., Tackett, A. J., Radominska-Pandya, A., Miller, G. P. CYP2E1 active site residues in substrate recognition sequence 5 identified by photoaffinity labeling and homology modeling. Arch. Biochem. Biophys. 459, 59-69 (2007).
- Gradolatto, A. Saccharomyces cerevisiae Yta7 Regulates Histone Gene Expression. Genetics. 179, 291-304 (2008).
- Taverna, S. D. Yng1 PHD finger binding to histone H3 trimethylated at lysine 4 promotes NuA3 HAT activity at Lysine 14 of H3 and transcripiton at a subset of targeted ORFs. Mol. Cell. 24, 785-796 (2006).
