Presentiamo un metodo per utilizzare spettrometria di massa MALDI e chimica metilazione riduttiva per quantificare variazioni di metilazione lisina.
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Articolo metodologico
Applicazione di MassSQUIRM per le misure quantitative delle attività demetilasi lisina
In questo articolo
Sommario
Abstract
Recentemente, i regolatori epigenetici sono stati scoperti come i giocatori chiave per molte diverse malattie 1-3. Come risultato, questi enzimi sono obiettivi primari di studi piccola molecola e sviluppo 4 farmaci. Molti regolatori epigenetici hanno solo recentemente è stato scoperto e sono ancora in fase di classificazione. Tra questi enzimi sono demethylases lisina che rimuovono gruppi metilici da lisine degli istoni ed altre proteine. A causa della natura di questa nuova classe di enzimi, pochi saggi sono stati sviluppati per studiare la loro attività. Questo è stato un blocco stradale sia per la classificazione e lo studio elevato throughput di demethylases istoni. Attualmente, saggi demetilasi esistono pochi. Quelli che esistono tendono ad essere di natura qualitativa e non possono contemporaneamente discernere tra i diversi stati di metilazione della lisina (Nazioni Unite-, mono-, di-e tri-). La spettrometria di massa è comunemente usato per determinare l'attività demetilasi ma gli attuali dosaggi di massa spettrometria di farenon affrontare se peptidi differenzialmente metilati ionizzare in modo diverso. Ionizzazione dei peptidi metilati differenziale rende il confronto stati metilazione difficile e certamente non quantitativa (Figura 1A). Così test disponibili non sono ottimizzati per l'analisi completa delle attività demetilasi.
Qui si descrive un metodo chiamato MassSQUIRM (spettrometria di massa quantificazione utilizzando isotopica metilazione riduttiva) che si basa sulla metilazione riduttiva di gruppi amminici con formaldeide deuterato di costringere tutti lisine essere di-metilato, rendendoli così in sostanza la stessa specie chimiche e quindi ionizzare l' stesso (figura 1B). La differenza chimica soltanto dopo la metilazione riduttiva è idrogeno e deuterio, che non influenza l'efficienza di ionizzazione MALDI. Il dosaggio MassSQUIRM è specifico per i prodotti di reazione demetilasi con un-lisine, mono-o di-metilati. Il saggio è applicabile anche a methyltransferases lisina dando la same prodotti di reazione. Qui, si usa una combinazione chimica di metilazione riduttiva e spettrometria di massa MALDI per misurare l'attività di LSD1, uno demetilasi lisina in grado di rimuovere di-e mono-metil gruppi, su un substrato peptidico sintetico 5. Questa analisi è semplice e facilmente suscettibili di qualsiasi laboratorio con accesso ad uno spettrometro di massa MALDI in laboratorio o attraverso un servizio di proteomica. Il saggio deve ~ 8 volte la gamma dinamica, ed è facilmente scalabile in formato piastra 5.
Protocollo
Questo protocollo è stato modificato da Blair et al. 6.
1. LSD1 demetilazione Assay
- In un volume finale di 20 pl, combinare 125 ng LSD1 ricombinante con 0,25 mg di metil-istone H3 peptide (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotina) in tampone demetilasi (50 mM Tris-Cl pH 8,5, 50 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 5% glicerolo). Inoltre, eseguire un controllo solo peptide senza enzima. Il controllo è per la sezione 3 e non necessita di metilazione riduttiva.
- Incubare per 2 ore a 37 ° C.
- Per raccogliere i peptidi, aggiungere 8 microlitri Poros R2 sfere 20 micron a ciascun campione e agitare per 15 min....
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Discussione
MassSQUIRM è un metodo poco costoso e quantitative per l'analisi complessiva dell'attività di demethylases lisina coinvolti in mono-e di-metilazione. MassSQUIRM quantificazione offre non solo del prodotto della reazione, ma anche per gli intermedi. Questa analisi può essere utilizzato come un potente strumento per studiare il meccanismo di demethylases istone LSD1 e altri. Sarà anche utile per classificare molti enzimi recentemente scoperti demetilasi lisina come PHF8 e potrebbe essere utilizzato per alcuni enzi.......
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Dichiarazioni
Non abbiamo nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Fondo UAMS Proteomics supporto spettrometria di massa. Il finanziamento per questo progetto è stato fornito da sovvenzioni NIH P20RR015569, P20RR016460 e R01DA025755.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reattivo | Azienda | Numero di catalogo | |
| LSD1 | BPS Biosciences | 50100 | |
| H3K4me2-biotina peptide | preparato in-house | nessuno | |
| POROS R2 20 perline micron | Applied Biosystems | 1-1129-06 | |
| C 18 ZipTip | Millipore | ZTC18M | |
| Acido trifluoroacetico (TFA) | Thermo | 28904 | |
| acetonitrile | Pescatore | A996 | |
| 2,5-diidrossibenzoico acido | Sigma | 85707 | |
| Borano dimetilammina | Sigma | 180238 | |
| isotopicamente pesante d 2-formaldeide | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-805-20 | |
| Tris | Pescatore | BP154 | |
| KCl | Pescatore | BP366 | |
| MgCl 2 | Pescatore | BP214 | |
| Glicerina | Pescatore | G33 | |
| Acido formico | Fluka | 06440 | |
| Metanolo | Pescatore | A452 | |
| Na-fosfato | Pescatore | BP329 | |
| SpeedVac Concentrator | Dotto | DNA110 | |
| MALDI-prOTOF Spettrometro di massa e TOFworks software | PerkinElmerSciex | nessuno |
Riferimenti
- Goldberg, A. D., Allis, C. D., Bernstein, E. Epigenetics: a landscape takes shape. Cell. 128, 635-638 (2007).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Blair, L. P., Cao, J., Zou, M. R., Sayegh, J., Yan, Q.
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Ristampe e permessi
