בניית Hydrogel קולגן עבור משלוח של התא טעון גזע Chitosan microspheres
Summary
המכשול העיקרי בתא טיפולים שוטפים גזע הוא לקבוע את השיטה היעילה ביותר, כדי לספק תאים אלה לרקמות המארחות. כאן אנו מתארים שיטה chitosan מבוסס משלוח יעיל ופשוט של הגישה, תוך מתן אפשרות השומן שמקורם בתאי גזע כדי לשמור על multipotency שלהם.
Abstract
בתאי גזע multipotent הוכחו להיות שימושי ביותר בתחום הרפואה משובי 1-3. עם זאת, כדי להשתמש ביעילות את התאים האלה לשחזור רקמות, מספר משתנים יש לקחת בחשבון. משתנים אלה כוללים: הנפח הכולל ושטח הפנים של אתר ההשתלה, תכונות מכניות של רקמות ואת microenvironment רקמות, הכוללת את כמות כלי הדם ועל מרכיבי מטריקס תאיים. לכן, חומרים בשימוש, כדי לספק את התאים האלה חייבים להיות ביולוגית עם הרכב כימי מוגדר, תוך שמירה על חוזק מכני המחקה רקמת המארח. חומרים אלה חייבים להיות גם החדיר את חמצן וחומרים מזינים לספק microenvironment חיובית על תאים לצרף מתרבים. Chitosan, פוליסכריד קטיוני עם biocompatibility מעולה, ניתן לשנות בקלות כימית ויש לו זיקה גבוהה להיקשר עם in vivo Macromolecules 4-5. Chitosan מחקה חלק glycosaminoglycan של מטריקס תאית, מה שמאפשר לו לתפקד כמו המצע של הגירה הידבקות, תאים ו ההפצה. במחקר זה אנו מנצלים chitosan בצורה של microspheres כדי לספק שומן שמקורם בתאי גזע (ASC) על בסיס קולגן תלת ממדי הפיגום 6. היחס האידיאלי התא אל microsphere נקבע ביחס לזמן הדגירה ואת צפיפות התאים כדי להשיג המספר המרבי של התאים ניתן לטעון. לאחר ASC הם זרע על microspheres chitosan (CSM), הם מוטבעים פיגום קולגן יכול להישמר בתרבות לתקופות ממושכות. לסיכום, מחקר זה מספק שיטה בדיוק לספק בתאי גזע בתוך 3 מימדי ביולוגי הפיגום.
Protocol
1. בידוד הנגזרות שומן גזע תאים (ASC) הערה: כל הנהלים בוצעו בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת. לבודד את השומן עכברוש perirenal ו epididymal ולשטוף עם פתרון שנאגרו האנק של מלח סטרילית (HBSS) ?…
Discussion
המכשול העיקרי בטיפול בתאי גזע מבוסס מפתחת שיטות יעילות עבור משלוח של תאים לאזורים המפורטים לתיקון. בשל השתנות החולה המטופל, סוג הרקמה, גודל ועומק הפציעה, המתודולוגיה של בתאי גזע אספקת צריכה להיקבע על בסיס כל מקרה לגופו. למרות הטבעה בתאי גזע בתוך מטריקס ושולחים אותם ל?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Doz נתמך על ידי מענק הוענק מטעם קרן ז'נבה. SN נתמך על ידי מענק מלגה דוקטורים מן היוזמה הנדסת רקמות פיטסבורג.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Hanks BalancedSalt Solution (HBSS) | Gibco | 14175 | Consumable |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | Consumable |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | C6685 | Consumable |
| 70-μm nylon mesh filter | BD Biosciences | 352350 | Consumable |
| 100-μm nylon mesh filter | BD Biosciences | 352360 | Consumable |
| MesenPRO Growth Medium System | Invitrogen | 12746-012 | Consumable |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | Consumable |
| T75 Tissue Culture Flask | BD Biosciences | 137787 | Consumable |
| Chitosan | Sigma-Aldrich | 448869 | Consumable |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Consumable |
| N-Octanol | Acros Organics | 150630025 | Consumable |
| Sorbitan-Mono-oleate | Sigma-Aldrich | S6760 | Consumable |
| Potassium Hydroxide | Sigma-Aldrich | P1767 | Consumable |
| Acetone | Fisher Scientific | L-4859 | Consumable |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 270741 | Consumable |
| Trinitro Benzenesulfonic Acid | Sigma-Aldrich | P2297 | Consumable |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Consumable |
| Ethyl Ether | Sigma-Aldrich | 472-484 | Consumable |
| 8-μm Tissue Culture Plate Inserts | BD Biosciences | 353097 | Consumable |
| 1.5-ml Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Consumable |
| MTT Reagent | Invitrogen | M6494 | Consumable |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8779 | Consumable |
| Qtracker Cell Labeling Kit (Q tracker 655) | Molecular probes | Q2502PMP | Consumable |
| Type 1 Collagen | Travigen | 3447-020-01 | Consumable |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | Consumable |
| 12-Well Tissue Culture Plates | BD Biosciences | 353043 | Consumable |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | Equipment |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scienctific | C24 | Equipment |
| Humidified Incubator with Air-5% CO2 | Thermo Scientific | Model 370 | Equipment |
| Overhead Stirrer | IKA | Visc6000 | Equipment |
| Magnetic Stirrer | Corning | PC-210 | Equipment |
| Vacuum Desiccator | – | – | Equipment |
| Particle Size Analyzer | Malvern | STP2000 Spraytec | Equipment |
| Water Bath | Fisher Scientific | Isotemp210 | Equipment |
| Spectrophotometer | Beckman | Beckman Coulter DU800UV/Visible Spectrophotometer | Equipment |
| Vortex | Diagger | 3030a | Equipment |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | Equipment |
| Light/Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | Equipment |
| Confocal Microscope | Olympus | FV-500 Laser Scanning Confocal Microscope | Equipment |
| Scanning Electron Microscope | Carl Zeiss MicroImaging | Leo 435 VP | Equipment |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEOL 1230 | Equipment |
References
- Krampera, M. Mesenchymal stem cells for bone, cartilage, tendon and skeletal muscle repair. Bone. 39, 678-683 (2006).
- Patrick, C. W. Tissue engineering strategies for adipose tissue repair. Anat. Rec. 263, 361-366 (2001).
- Pountos, I., Giannoudis, P. V. Biology of mesenchymal stem cells. Injury. 36, S8-S12 (2005).
- Kim, I. Y. Chitosan and its derivatives for tissue engineering applications. Biotechnol. Adv. 26, 1-21 (2008).
- Shi, C. Therapeutic potential of chitosan and its derivatives in regenerative medicine. J. Surg. Res. 133, 185-192 (2006).
- Natesan, S. Adipose-derived stem cell delivery into collagen gels using chitosan microspheres. Tissue Eng. Part. A. 16, 1369-1384 (2010).
- Bubnis, W. A., Ofner, C. M. The determination of epsilon-amino groups in soluble and poorly soluble proteinaceous materials by a spectrophotometric method using trinitrobenzenesulfonic acid. Anal. Biochem. 207, 129-133 (1992).
- Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Lab Invest. 7, 134-137 (1958).
- Benoit, D. S. Integrin-linked kinase production prevents anoikis in human mesenchymal stem cells. J. Biomed. Mater. Res. A. 81, 259-268 (2007).
- Nuttelman, C. R., Tripodi, M. C., Anseth, K. S. Synthetic hydrogel niches that promote hMSC viability. Matrix Biol. 24, 208-218 (2005).
- Shanmuganathan, S. Preparation and characterization of chitosan microspheres for doxycycline delivery. Carbohydr. Polym. 73, 201-211 (2008).
- Haque, T., Chen, H., Ouyang, W., Martoni, C., Lawuyi, B., Urbanska, A., Prakash, S. Investigation of a new microcapsule membrane combining alginate, chitosan, polyethylene glycol and poly-L-lysine for cell transplantation applications. Int. J. Artif. Organs. 28, 631-637 (2005).
- Goren, A., Dahan, N., Goren, E., Baruch, L., Machluf, M. Encapsulated human mesenchymal stem cells: a unique hypoimmunogenic platform for long-term cellular therapy. FASEB J. 24, 22-31 (2010).
- Zielinski, B. A., Aebischer, P. Chitosan as a matrix for mammalian cell encapsulation. Biomaterials. 15, 1049-1056 (1994).
- Girandon, L., Kregar-Velikonja, N., Božikov, K., Barliç, A. In vitro Models for Adipose Tissue Engineering with Adipose-Derived Stem Cells Using Different Scaffolds of Natural Origin. Folia Biol. (Praha). 57, 47-56 (2011).
- Baruch, L., Machluf, M. Alginate-chitosan complex coacervation for cell encapsulation: effect on mechanical properties and on long-term viability. Biopolymers. 82, 570-579 (2006).
- Wei, Y., Gong, K., Zheng, Z., Wang, A., Ao, Q., Gong, Y., Zhang, X. Chitosan/silk fibroin-based tissue-engineered graft seeded with adipose-derived stem cells enhances nerve regeneration in a rat model. J. Mater. Sci. Mater. Med. , (2011).
- Wang, Q., Jamal, S., Detamore, M. S., Berkland, C. PLGA-chitosan/PLGA-alginate nanoparticle blends as biodegradable colloidal gels for seeding human umbilical cord mesenchymal stem cells. J. Biomed. Mater. Res. A. 96, 520-527 (2011).
- Alves da Silva, M. L., Martins, A., Costa-Pinto, A. R., Correlo, V. M., Sol, P., Bhattacharya, M., Faria, S., Reis, R. L., Neves, N. M. Chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan-based scaffolds using a flow-perfusion bioreactor. J. Tissue Eng. Regen. Med. , (2010).
- Kang, Y. M., Lee, B. N., Ko, J. H., Kim, G. H., Kang, K. N., Kim da, Y., Kim, J. H., Park, Y. H., Chun, H. J., Kim, C. H., Kim, M. S. In vivo biocompatibility study of electrospun chitosan microfiber for tissue engineering. Int. J. Mol. Sci. 11, 4140-4148 (2010).
- Bozkurt, G., Mothe, A. J., Zahir, T., Kim, H., Shoichet, M. S., Tator, C. H. Chitosan channels containing spinal cord-derived stem/progenitor cells for repair of subacute spinal cord injury in the rat. Neurosurgery. 67, 1733-1744 (2010).
- Leipzig, N. D., Wylie, R. G., Kim, H., Shoichet, M. S. Differentiation of neural stem cells in three-dimensional growth factor-immobilized chitosan hydrogel scaffolds. Biomaterials. 32, 57-64 (2011).
- Altman, A. M., Gupta, V., RÃos, C. N., Alt, E. U., Mathur, A. B. Adhesion, migration and mechanics of human adipose-tissue-derived stem cells on silk fibroin-chitosan matrix. Acta Biomater. 6, 1388-1397 (2010).
- Altman, A. M., Yan, Y., Matthias, N., Bai, X., Rios, C., Mathur, A. B., Song, Y. H., Alt, E. U. IFATS collection: Human adipose-derived stem cells seeded on a silk fibroin-chitosan scaffold enhance wound repair in a murine soft tissue injury model. Stem Cells. 27, 250-258 (2009).
- Machado, C. B., Ventura, J. M., Lemos, A. F., Ferreira, J. M., Leite, M. F., Goes, A. M. 3D chitosan-gelatin-chondroitin porous scaffold improves osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Biomed. Mater. 2, 124-131 (2007).
Tags
Collagen HydrogelStem Cell-loaded Chitosan MicrospheresRegenerative MedicineImplantation SiteMechanical PropertiesVascularizationExtracellular MatrixBiocompatible MaterialsChemical CompositionMechanical StrengthPermeabilityOxygen And NutrientsChitosanCationic PolysaccharideChemical ModificationIn Vivo MacromoleculesGlycosaminoglycan PortionSubstrate For Cell AdhesionMigration And ProliferationAdipose-derived Stem Cells (ASC)Three-dimensional Scaffold
Cite This Article
Zamora, D. O., Natesan, S., Christy, R. J. Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres. J. Vis. Exp. (64), e3624, doi:10.3791/3624 (2012).