Summary
Um grande obstáculo em terapias com células-tronco atuais é determinar o método mais eficaz para entregar essas células para tecidos do hospedeiro. Aqui, nós descrevemos um método de entrega de quitosana-base que é eficiente e simples na abordagem, ao mesmo tempo permitindo que as células-tronco adiposas para manter a sua multipotency.
Abstract
As células estaminais multipotenciais têm sido mostrados para ser extremamente útil no campo da medicina regenerativa 1-3. No entanto, a fim de utilizar essas células eficazmente para a regeneração de tecidos, um número de variáveis devem ser tidos em conta. Estas variáveis incluem: o volume total e área de superfície do local de implantação, as propriedades mecânicas do tecido e do microambiente do tecido, que inclui a quantidade de vascularização e os componentes da matriz extracelular. Portanto, os materiais que estão sendo utilizados para entregar estas células deve ser biocompatível com uma composição química definida, mantendo uma força mecânica que imita o tecido hospedeiro. Estes materiais também deve ser permeável ao oxigénio e nutrientes para proporcionar um microambiente favorável para as células para anexar e proliferar. A quitosana, um polissacárido catiónico com excelente biocompatibilidade, pode ser facilmente modificada quimicamente e tem uma elevada afinidade para se ligarem a in vivo macromolecules 4-5. A quitosana imita a porção de glicosaminoglicano da matriz extracelular, permitindo-lhe funcionar como um substrato para a migração de adesão celular, e proliferação. Neste estudo, utilizam quitosano na forma de microesferas para entregar células-tronco adiposas (ASC) em uma base de colagénio tridimensional andaime 6. Uma razão de célula-a-microesfera ideal foi determinada com respeito ao tempo de incubação e densidade celular para atingir o número máximo de células que poderiam ser carregados. Uma vez ASC são semeados no microesferas de quitosano (CSM), eles são incorporados em um andaime de colagénio e pode ser mantido em cultura durante períodos prolongados. Em resumo, este estudo fornece um método para entregar precisamente células-tronco dentro de um andaime tridimensional biomaterial.
Protocol
1. Isolando derivadas de tecido adiposo células-tronco (ASC)
Nota: Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma.
- Isolar adiposo epididimal e perirenal rato e lavar com solução de Hank estéril tamponada de sal (HBSS) contendo 1% de soro fetal bovino (FBS), como descrito anteriormente 6.
- Picar o tecido e transferir 1-2 g em 25 mL de HBSS contendo FBS a 1% para um tubo de 50 mL e centrifugação a 500 g durante 8 minutos à temperatura ambiente.
- Recolher o de flutuação livre camada de tecido adiposo e transferência para 125 mL balão Erlenmeyer e trata-se com 25 mL de colagenase tipo II (200 U / mL) em HBSS durante 45 min a 37 ° C num agitador orbital (125 rpm).
- Cuidadosamente remover a fracção de líquido (abaixo de óleo e da camada adiposo) e filtrar sequencialmente através de um filtro 100-iM e 70 mícrons de nylon de malha. Centrifugar o filtrado a 500 g durante 10 min à temperatura ambiente, aspirar o supernatant, e lavar a pelete duas vezes com 25 ml de HBSS.
- Ressuspender o sedimento de células em 50 mL de meio de crescimento (Meio MesenPRO RS Basal) suplementado com MesenPRO Suplemento de Crescimento RS, antibiótico-antimicótico (100 U / mL de penicilina G, 100 ug / mL de sulfato de estreptomicina, e 0,25 ug / mL Anfotericina B) , e 2 mM de L-glutamina e as células de pipeta em 2 T75 frascos (25 ml balão /).
- Cultura da ASC em um 5% de CO 2 incubadora humidificada a 37 ° C (passagem 2-4 ASC são utilizados para todas as experiências).
2. Preparação de microesferas (CSM)
Nota: Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma.
- CSM são preparados por um processo de emulsificação de água-em-óleo, juntamente com uma técnica de coacervação iónica usando o nosso protocolo anterior 6. Emulsionar uma solução aquosa de quitosano (6 mL de 3% w / v de quitosano em ácido acético 0,5 M) em 100 ml de uma mistura de fase de óleo consistindo de sojaóleo, n-octanol (1:2 v / v) e 5% de sorbitano-mono-oleato de emulsionante (Span 80), utilizando sobrecarga (1700 rpm) e agitação magnética (1000 rpm), simultaneamente, em direcções opostas. Este método de dupla resultará uma mistura que micelas formadas no início antes de reticulação ocorre podem permanecer em solução e não assentam no fundo. Além disso, a barra de agitação magnética SIDA em DE-agregação de quitosano durante micela formação e rigidization.
- A mistura é agitada continuamente durante aproximadamente 1 hora até uma emulsão de água-em-óleo estável é obtido. Reticulação iónica é iniciada com a adição de 1,5 mL de 1% de hidróxido de w / v de potássio em n-octanol min a cada 15 durante 4 h (24 ml no total).
- Depois de se completar a reacção de reticulação, lentamente decantar a fase de óleo da mistura contendo CSM e imediatamente adicionar as esferas a 100 mL de acetona. Lave as esferas com acetona até que a fase de óleo é completamente removido.
- Secam-se as esferas recuperados em um exsicador de vácuo e analyze inalterado. O tamanho médio de partícula CSM, área de superfície por miligrama e da unidade de volume cúbico foi determinada utilizando analisador de tamanho de partícula.
- Para as experiências subsequentes, lavar CSM três vezes com água estéril para remover os sais residuais e esterilizar com álcool absoluto.
3. Determinando o número de grupos amino livres no CSM
Nota: Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma.
- Determinar o número de grupos amino livres presentes na CSM após reticulação iónica usando o ensaio de ácido benzenossulfónico trinitro (TNBS), de Bubins e Ofner 7. Incubar 5 mg de microesferas com 1 mL de 0,5% de solução de TNBS em um tubo de vidro de 50 mL durante 4 h, a 40 ° C e hidrolisar com a adição de 3 mL de HCl 6N a 60 ° C durante 2h.
- Arrefecer as amostras à temperatura ambiente, e extrair os TNBS livres por adição de 5 mL de água desionizada e 10 mL de acetatoéter.
- Aquecer uma alíquota de 5 ml da fase aquosa para 40 ° C num banho de água durante 15 min para evaporar qualquer éter residual, arrefecer até à temperatura ambiente, e diluir com 15 mL de água.
- Medir a absorvância a 345 nm com um espectrofotómetro com solução TNBS sem quitosana como em branco eo quitosano utilizado para a preparação CSM para determinar o número total de grupos amino. Estimar o número de grupos amino livres da MSC em relação ao quitosano.
4. Carregando ASC no CSM
Nota: Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma.
- Equilibrar 5 mg de CSM esterilizado de seção 2,5 em HBSS estéril durante a noite e adicionar um poro tamanho 8 mícrons membrana inserção placa de cultura (24-bem placa).
- Após o CSM se estabeleceram para a membrana, aspirar cuidadosamente os HBSS e adicionam-se 300 uL de meio de crescimento para o interior da inserção e 700 uL de meio de crescimento para the fora da pastilha.
- Ressuspender o ASC na concentração apropriada (1 x 10 4 a 4 x 10 4) em 200 uL de meio de crescimento e de sementes ao longo do CSM dentro do inserto placa de cultura. O volume final de meio de cultura dentro da inserção, após a semeadura, é de 500 uL.
- Incubar a seeded ASC à CSM por 24 h em um 5% de CO 2 incubadora humidificada a 37 ° C.
5. Determinação da porcentagem de ASC Carregando e viabilidade celular em CSM
Nota: Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma.
- Após a incubação, recolher o CSM ASC-carregado num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril, sem perturbar as células que migraram para a membrana de inserção.
- Remover o meio residual e adicionar 250 uL de meio de crescimento fresco para o tubo.
- Para cada tubo 25 uL de MTT [3 - (4,5-dimethylthiozole-2-il) -2,5-difeniltetrazólio]solução (5 mg / mL) e incubar durante 4 h em um 5% de CO 2 incubadora humidificada a 37 ° C.
- Após a incubação, o meio de remover, adicionar 250 uL de sulfóxido de dimetilo, e vórtice a mistura durante 2-5 minutos para solubilizar o formazan complexo.
- Centrifugar a CSM em 2700 X g durante 5 min, e determinar a absorvância sobrenadante medida a 570 nm 630 nm, utilizando como referência.
- Determinar o número de células associado com o MSC em relação ao valor de absorvância obtidos a partir de um número conhecido de ASC viável.
6. Caracterizando ASC-CSM-incorporado gel de colágeno
Nota: Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma.
- Mistura ASC-carregado CSM (5 mg contendo ≈ 2 x 10 4 células) com colagénio de tipo 1 (7,5 mg / mL), extraído a partir de tendão da cauda de rato de acordo com o método de Bornstein 8 e fibrilam depois de ajustar o pH para 6,8 utilizando 2 N de NaOH. Adicionar a mistura de colagénio-ASC-CSM fibrilada para uma placa de 12 poços e incubar durante 30 min a uma em 5% de CO 2 incubadora humidificada a 37 ° C.
- Depois de fibrilação completa, incubar os géis de colagénio-ASC-CSM-se até 14 dias, em um 5% de CO 2 incubadora humidificada a 37 ° C.
- Libertação e migração de células de CSM no gel foram observadas utilizando técnicas de microscopia padrão.
7. Os resultados representativos
No presente estudo, nós desenvolvemos uma estratégia in vitro para proporcionar células-tronco de microesferas de quitosano (CSM) em um gel de colagénio andaime. CSM poroso de tamanho uniforme (175-225 um de diâmetro) e composição foram preparados e utilizados como transportadores de células (Figura 2). Após a incubação com a ASC CSM, as células ligado a uma concentração de 2 x 10 4 cells/5mg de MSC. As células foram capazes de espalhar sobre a microesfera, enquanto estende filopodiosnas fendas porosas do microesfera (Figura 3). Uma vez que a célula CSM-carregado foram misturadas com o gel de colagénio, as células imediatamente começou a migrar para os géis (Figura 4).
Tabela 1. Vantagens biológicos para o uso de quitosano e de colagénio em um sistema de entrega de células estaminais.
Figura 1. Esquemático que representa a estratégia geral para a utilização dupla de ASC-CSM andaimes de colagénio carregados. Figuras 2, 3 e 4 são anotadas no interior da esquemática para auxiliar com a interpretação das imagens.
Figura 2. Representação esquemática representando o processo de semear as células estaminais para quitosano. O process envolve co-cultura com ASC CSM em um 8 - mM tamanho dos poros da membrana de inserção placa de cultura. Após 24 horas, as microesferas são removidos do inserto e estão prontos para incorporação numa matriz biomaterial.
Figura 3. Caracterização morfológica de CSM-carregado com ASC. O painel A representa uma micrografia de luz de ASC-carregado CSM, enquanto o painel B mostra o mesmo campo de visão, sobreposto com uma imagem obtida por microscopia de fluorescência confocal. ASC foram pré-carregado com calceína AM (verde). O painel C mostra uma imagem de uma imagem SEM de uma microesfera descarregado, enquanto o painel D mostra células carregadas no microesfera (asteriscos). A imagem MET em E painel mostra uma secção transversal de uma microesfera descarregado. Uma multidão de poros e fendas estão localizados ao longo da microesfera. Painel F mostra uma microesfera transversalmente com as células (setas) ligado e estendendo filopodia na CREvícios. Ampliações originais: A & B = 70X; C = 500x, D = 2.000 x; E & F = 2.500 x.
Figura 4. A migração de ASC a partir do CSM para o colagénio tridimensional andaime. Os painéis A e B representam a CSM com células migrando do microesfera e para dentro da matriz de colagénio no dia 3 (A setas,). O painel B mostra uma cultura semelhante depois de 12 dias. Microscopia electrónica de transmissão (TEM) imagens são representadas em C, D e E. Os asteriscos em C e D mostram uma microesfera que tem sido transversalmente com as células de migrar para longe da microesfera (setas). Maior ampliação de painel D está representado na painel E, e mostra filopodia célula ligado às fibrilas de colagénio (inserção). Aumento original: A & B = 100x; C & D = 6.000 x; E = 20.000 x, inset = 150.000 x.
Figura 5.Esquema representando os usos vastas CSM na medicina regenerativa e entrega da droga.
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Discussion
Um grande obstáculo na terapia de células-tronco base é o desenvolvimento de métodos eficientes para a entrega de células para as regiões especificadas para a reparação. Devido ao paciente a variabilidade do paciente, o tipo de tecido, tamanho da lesão e da profundidade, a metodologia de células estaminais entrega deve ser determinada numa base de caso-a-caso. Embora a incorporação de células-tronco dentro de uma matriz e entregá-los para o local da ferida parece ser uma abordagem lógico seguinte para a engenharia de tecidos, algumas dificuldades técnicas permanecem. Isto inclui a capacidade das células incorporados para anexar à matriz e fornecer um biocompatível circundante no qual as células pode anexar, proliferam e restabelecer um microambiente adequado antes anoikis 9-10. Este processo requer que as células upregulate sua maquinaria de remodelação da matriz, um processo que pode demorar dias para realizar antes dos processos celulares desejadas de migração, proliferação e diferenciação das células estaminais. Para contornar esses problemas, temos hav desenvolvido um método para pré-carregar as células estaminais para quitosano antes da sua incorporação em uma matriz apropriada para reparar o tecido danificado. Usando o nosso cross-linking única iónico métodos para preparar as microesferas, o protocolo é capaz de preparar> 90% das microesferas para estar dentro 175-225 um de diâmetro, gerando assim um transportador de tamanho micro excelente para as células. Mais importante ainda, após reticulação, as microesferas permanecem carregados positivamente, que é altamente favorável para a fixação das células. Estas características permitem que as células-tronco de microesferas para anexar rapidamente para o CSM. Uma vez ligados, estes células estaminais microesferas carregadas são estáveis e capazes de atingir arranjos espaciais dentro do andaime, tais como hidrogéis de colagénio, para imitar o tecido lesionado. Em suma, este protocolo fornece um novo método para carregar ASC em CSM e mostra que células na microesferas pode migrar preservando seu fenótipo de células-tronco. O CSM poroso descrito fornecer umamicroambiente excelente para ASC fixação e ainda permitir que as células para migrar na matriz circundante.
Resumo:
Etapas críticas
- Use microesferas uniforme em tamanho desde variação no diâmetro influencia directamente área de superfície disponível para a fixação de células por miligrama de microesferas.
- Prepara-se uma cama uniforme de microesferas no interior da inserção de cultura de fixação uniforme óptimo das células para o MSC.
- Assegurar que o volume de meio adicionado ao poço exterior do inserto de cultura de células é maior do que o menisco do interior bem. Tipicamente, uma interior: proporção em volume de 1:2 exterior é apropriado, como o que facilita células associadas à microesferas.
- Distribua o celular carregado microesferas uniformemente dentro do andaime. Se a distribuição de ASC-CSM é muito densa, as células não irá migrar do seu microesferas.
- A quantidade desejada de CSM e distribuiçãobuição densidade é dependente de aplicação e área de tecido lesado.
Limitações
- Este método é limitado à área de superfície total disponível no microesferas. Se um número maior de células é desejada, microesferas mais são necessários para aumentar a área de superfície.
- O processo permite que as células a serem semeadas em às microesferas pré-formado e não se destinam a fins de encapsulação de células.
- As microesferas de quitosano desenvolvido neste processo pode apoiar-dependentes de ancoragem células, mas os tipos de células não outros.
- Uma vez que microesferas de quitosano são desenvolvidas utilizando uma solução de ácido 0,5 M acético, emulsionado em uma mistura de óleo (o óleo de soja: n-octanol) e recuperado utilizando solvente orgânico que não permite activas terapêuticas porções vulneráveis à condição acima mencionado.
- O CSM são destinados principalmente para fornecer células e medicamentos em menor duração do tempo (5-10 dias), devido à sua rápida degradaçãotaxa de, ao contrário dos destinados a disponibilidade de longa duração.
Modificações possíveis e versatilidade (Figura 5)
- Tamanho de microsferas podem ser modificados para alterar a área da superfície total. Por exemplo, o tamanho de microsferas pode ser reduzida para aumentar a área da superfície / mg de CSM, que por sua vez irá aumentar a área de superfície total eo número de células que podem ser anexados à microesferas, resultando em um aumento da célula de carga por microesfera.
- Microesferas de quitosano pode ser usado como um transportador para carregar outros tipos de células (células endoteliais, pericitos, fibroblastos, etc.)
- Cell-carregados esferas (ambos os tipos simples ou múltiplo de células) pode ser embutido dentro de locais específicos de andaimes. Esta estratégia vai ajudar na construção de multicelulares tecido de andaimes para a regeneração dos tecidos.
- Além disso a entrega de células, as microsferas também podem ser utilizados para entregar drogas terapêuticas (isto é, os factores de crescimento, indutores de diferenciação, e / ou antibióticos). Estas microesferas droga carregada pode também ser utilizado em combinação com células de microesferas carregadas dentro de um andaime para melhorar a cura ea processos de regeneração.
Solução de problemas
- Após a preparação do CSM, se uma grande variação no tamanho ocorre, em seguida, um número de itens podem ser ajustados para se obter o tamanho desejado CSM 11.
- Viscosidade da solução de quitosano. Estoque preparada de fresco é preferido manter a solução sob viscosidade constante de lote para lote preparação
- Ajustar o volume de agente tensioactivo (Span 80) usado para preparar a emulsão.
- Assegurar a velocidade do agitador suspenso permanece constante durante todo o processo (a velocidade pode variar com flutuações de energia elétrica
- Durante a agitação ar proporcionadora atmosférica pode causar turbulência e tamanho variação (isto pode ser evitado por KEep ondulação do líquido, a qual faz durante a agitação, apenas sobre as lâminas do agitador suspenso.
- Para garantir um carregamento de células óptima das microesferas, um ensaio MTT calorimétrico pode ser executada. Isto vai dar uma estimativa do número de células viáveis carregado por miligrama de microesferas.
- Evitar aglomeração de célula-microesferas carregadas suspendendo-os num pequeno volume de meio de cultura de células antes de misturar-las dentro de um andaime tal como um hidrogel de colagénio.
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Disclosures
Não há interesses conflitantes financeiros existem.
Alerta
As opiniões ou afirmações contidas neste documento são as opiniões pessoais dos autores e não devem ser interpretadas como oficial ou refletindo as opiniões do Departamento de Defesa ou o Governo dos EUA. Os autores são funcionários do governo dos EUA, e este trabalho foi elaborado como parte das suas funções oficiais. Todo o trabalho foi apoiado pelo EUA Pesquisa Médica do Exército e do Comando de Material. Este estudo foi realizado ao abrigo de um protocolo revisto e aprovado pelo Comitê de Ética Médica EUA Exército e do Comando de Material Conselho de Revisão Institucional, e de acordo com o protocolo aprovado.
Acknowledgments
DOZ é apoiado por uma subvenção concedida à Fundação de Genebra. SN foi apoiado por uma bolsa pós-doutorado da Iniciativa Engenharia de Tecidos Pittsburgh.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks BalancedSalt Solution (HBSS) | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | Consumable |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | Consumable |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | C6685 | Consumable |
| 70-μm nylon mesh filter | BD Biosciences | 352350 | Consumable |
| 100-μm nylon mesh filter | BD Biosciences | 352360 | Consumable |
| MesenPRO Growth Medium System | Invitrogen | 12746-012 | Consumable |
| L-glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | Consumable |
| T75 Tissue Culture Flask | BD Biosciences | 137787 | Consumable |
| Chitosan | Sigma-Aldrich | 448869 | Consumable |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Consumable |
| N-Octanol | Acros Organics | 150630025 | Consumable |
| Sorbitan-Mono-oleate | Sigma-Aldrich | S6760 | Consumable |
| Potassium Hydroxide | Sigma-Aldrich | P1767 | Consumable |
| Acetone | Fisher Scientific | L-4859 | Consumable |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 270741 | Consumable |
| Trinitro Benzenesulfonic Acid | Sigma-Aldrich | P2297 | Consumable |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Consumable |
| Ethyl Ether | Sigma-Aldrich | 472-484 | Consumable |
| 8-μm Tissue Culture Plate Inserts | BD Biosciences | 353097 | Consumable |
| 1.5-ml Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | Consumable |
| MTT Reagent | Invitrogen | M6494 | Consumable |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8779 | Consumable |
| Qtracker Cell Labeling Kit (Q tracker 655) | Molecular Probes, Life Technologies | Q2502PMP | Consumable |
| Type 1 Collagen | Travigen | 3447-020-01 | Consumable |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | Consumable |
| 12-Well Tissue Culture Plates | BD Biosciences | 353043 | Consumable |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | Equipment |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scienctific | C24 | Equipment |
| Humidified Incubator with Air-5% CO2 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Model 370 | Equipment |
| Overhead Stirrer | IKA | Visc6000 | Equipment |
| Magnetic Stirrer | Corning | PC-210 | Equipment |
| Vacuum Desiccator | - | - | Equipment |
| Particle Size Analyzer | Malvern Instruments | STP2000 Spraytec | Equipment |
| Water Bath | Fisher Scientific | Isotemp210 | Equipment |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter Inc. | Beckman Coulter DU800UV/Visible Spectrophotometer | Equipment |
| Vortex | Diagger | 3030a | Equipment |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | Equipment |
| Light/Fluorescence Microscope | Olympus Corporation | IX71 | Equipment |
| Confocal Microscope | Olympus Corporation | FV-500 Laser Scanning Confocal Microscope | Equipment |
| Scanning Electron Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Leo 435 VP | Equipment |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEOL 1230 | Equipment |
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