Summary
نحن هنا وصف أول ممارسة التصنيع الجيد (GMP) المتوافقة مع طريقة لانتاج الفيروسات محددة الخلايا الليمفاوية T السامة للخلايا (CTL) من دم الحبل السري، ومصدرا للخلايا T السذاجة في الغالب.
Abstract
العدوى بالفيروس بعد زرع الخلايا الجذعية هي من بين الأسباب الأكثر شيوعا للوفاة، خاصة بعد دم الحبل السري (CB) زرع (CBT) حيث CB لا تحتوي على أرقام ملموس من الخلايا T فيروس ذوي الخبرة التي يمكن أن تحمي من الإصابة المتلقي 1 - 4 نحن وآخرون أظهرت أن الفيروس محددة CTL ولدت من المانحين مصليا وغرست إلى المستلم آمنة واقية. 5-8 ومع ذلك، وحتى وقت قريب، لم يكن الفيروس خلايا T محددة يتم إنشاء من دم الحبل السري، من المحتمل بسبب غياب خلايا محددة فيروس T الذاكرة.
في محاولة لتقليد بشكل أفضل في ظروف فتيلة الجسم الحي من خلايا T السذاجة، أنشأنا الطريقة التي تستخدم الخلايا الجذعية المشتقة من CB (DC) transduced مع ناقلات الغدانية (Ad5f35pp65) التي تحتوي على مستضد CMV سائد مناعيا pp65، والقيادة وبالتالي خصوصية T الخلية نحو CMV واتش. [9] في البدء، ونحن نستخدم هذه أماهtured البلدان النامية وكذلك CB-T في الخلايا المشتقة وجود السيتوكينات IL-7، IL-12، وIL 15-10 الساعة تحفيز الثانية التي تستخدم EBV-تحولت الخلايا B، أو EBV LCL، التي تعبر عن كل من كامنة والتحللي مستضدات EBV. وتستخدم Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL لتحفيز خلايا T في حضور IL-15 في تحفيز الثانية. التحفيز لاحقة استخدام Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL وIL-2.
من الخلايا وحيدات النوى 50x10 6 CB نحن قادرون على توليد ما يزيد عن 150 × 10 خلايا الفيروسات محددة 6 T ليز أن مستضد نابض الأهداف والسيتوكينات الإفراج ردا على التحفيز المستضدية 11 هذه الخلايا تم تصنيعها بطريقة GMP المتوافقة فقط باستخدام وقد ترجمت الكسر 20٪ من وحدة دم الحبل السري ومجزأة للاستخدام السريري.
Protocol
1. وحيدات النوى خلية عزل (يوم 0)
- إدراج محول ارتفاع الأنبوب الإناث في ميناء مخرج الكسر 20٪ من الحبل وحدة الدم، وإزالة إرفاق حقنة الدم. نقل الدم إذابة إلى 20 مل من RPMI تحسنت في 50 مل أنبوب الطرد المركزي. شطف كيس الدم الحبل مع 5 مل من RPMI ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي نفسه.
- أجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة 10 دقائق في ز × 400. نضح طاف.
- إعادة تعليق الخلايا في 20 مل من RPMI الدافئة. خلايا طبقة على 15 مل من Lymphoprep في 50 مل أنبوب الطرد المركزي. أجهزة الطرد المركزي 40 دقيقة @ 400 × ز.
- حصاد واجهة تحتوي على الخلايا وحيدات النوى، وأغسلها في 20 مل من RPMI. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق @ 450 × ز.
- نضح طاف ويغسل في 20 مل من RPMI. عد الخلايا وتدور لمدة 5 دقائق @ 400 × ز.
- نضح طاف الخلايا و resuspend في 5 × 10 6 خلايا وحيدات النوى / مل من وسائل الإعلام Cellgenix DC (المصل مجانا). 1 مل لإزالة EBV-LCL جيل وضعت في 15 مل مntrifuge الأنبوب.
2. شجيري الجيل الخليوي (بدءا من اليوم 0)
- لوحة 2 مل من الخلايا (هي بالفعل في 5 × 10 6 خلية / مل من وسائل الإعلام DC) لكل بئر في لوحة 6 أيضا. ترك في حاضنة لمدة 1-2 ساعات.
- بعد 1-2 ساعات، يغسل خلايا غير ملتصقة عن طريق الغسيل 3-4 مرات مع برنامج تلفزيوني. جمع الخلايا غير ملتصقة والتجميد. إضافة 2 مل / جيد من وسائل الإعلام DC تحتوي على 1000 U / مل من IL-4 و 800 U / مل GM-CSF.
- 3-4 أيام بعد بدء DC، تجديد IL-4-CSF وجنرال موتورز عن طريق إضافة 100 ميكرولتر / جيد من وسائل الإعلام التي تحتوي على تركيز النهائي من 1000U/mL IL-4 و 800 U / مل GM-CSF.
- في يوم 5-6، حصاد DC عن طريق كشط البئر مع ماصة نقل. عد الخلايا الكبيرة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق @ 400 × ز. الرشفة وسائل الإعلام وDC إعادة تعليق على 2X10 6 خلايا / مل من وسائل الإعلام DC. إضافة 0.5 مل / بئر لوحة 24 أيضا.
- تنبيغ وDC باستخدام ناقلات Ad5f35pp65 في خلية في وزارة الداخلية من 10 وحدات المعدية. إضافة vectoR لكل بئر في لوحة 24 أيضا. احتضان خلايا مقابل 1.5 ساعة. بعد 1.5 ساعة، إضافة 1.5 مل / DC جيدا وسائل الإعلام التي تحتوي على: 1000 U / مل IL-4، 800 U / مل GM-CSF، 10 نانوغرام / مل TNF-ألفا، 1 ميكروغرام / مل PGE-1، 100 نانوغرام / مل IL-6، و 10 نانوغرام / مل IL-1beta. هذه السيتوكينات انضاج البلدان النامية.
3. جيل من EBV-LCL (بدءا من اليوم 0)
- أجهزة الطرد المركزي في أنبوب يحتوي على 5 × 10 6 خلايا وحيدات النوى. أضف 200 ميكرولتر من طاف تتركز B95.8 EBV و 1.8 مل من وسائل الإعلام كاملة (+ 10٪ RPMI FBS + L-2mm والجلوتامين) التي تحتوي على السيكلوسبورين (1 ميكروغرام / مل).
- قسامة 100 ميكرولتر من الخلايا في 10 آبار من لوحة 96-جيدا و 200 ميكرولتر إلى 5 آبار. إضافة 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام كاملة + السيكلوسبورين إلى الآبار التي تحتوي على فقط 100 ميكرولتر من الخلايا. ملء الآبار المتبقية مع الماء المعقم.
- تغذية الأسبوعية LCL والتوسع من لوحة 96-جيدا للوحة جيدا بعد 24 أسابيع 2 ~. بعد أسبوع آخر، ونقل إلى قارورة T25 ونقل في الأسبوع اللاحققارورة T75. في هذه المرحلة فمن المستحسن أن تقوم بتجميد مأخوذة من LCL. يستغرق عادة 1 شهر لتوليد عدد كاف من LCL.
4. بدء CTL - 7 أيام بعد بدء البلدان النامية
- البلدان النامية الحصاد وأشرق في 30 غراي. 4 × غسل والعد. إعادة تعليق DC في وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل الخلية T الإنسان (45٪ RPMI، 45٪ CLICK، ومصل الإنسان 10٪، 2mm والجلوتامين L-) @ 1 × 10 5 DCS / مل.
- ذوبان الجليد غير ملتصقة الخلايا من الخطوة 2.2. غسل الخلايا، والعد. إعادة تعليق في 2 × 10 6 غير ملتصقة خلية / مل في وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل الخلية T الإنسان. إضافة 10 نانوغرام / مل IL-7 12-IL و، و 5 نانوغرام / مل IL-15. إضافة 1 مل من الخلايا لكل بئر في لوحة 24 أيضا. إضافة 1 مل من DC لكل بئر. ملء الآبار فارغة من 24 لوحة جيدا مع الماء المعقم.
- 7 أيام بعد بدء خلية T، تغذية و / أو تقسيم خلايا مع وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل الخلية T الإنسان.
- 9-12 أيام بعد بدء خلية T، وتجميد الخلايا T حتى LCL جاهزة.
- ONCE LCL توسعت وpassaged في قوارير T75، وتنبيغ LCL بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق @ 400 × ز. إضافة إلى ناقلات بيليه الخلية في وزارة الداخلية على 100 وحدة المعدية في الخلية. احتضان لمدة 1.5 ساعة. بعد 1.5 ساعة، resuspend في وسائل الإعلام الكامل في 5 × 10 5 مل / LCL وإضافة 2 مل لكل بئر في لوحة 24 أيضا 12
- بعد 2 يوم، حصاد LCL وأشرق في 40 غراي. 4 × غسل والعد. إعادة تعليق على LCL في وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل الخلية T الإنسان عند 2.5 X 5 10 خلايا / مل. إضافة 1 مل من LCL لكل بئر من لوحة 24 أيضا. أيضا، إضافة 5 × 10 6 LCL إلى جهاز الثقافة Grex40 وكذلك 5 نانوغرام / مل IL 15-13
- حصاد الخلايا T. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق @ 400 XG، نضح طاف، و resuspend في وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل الخلية T الإنسان في 1 × 10 6 خلايا T / مل. إضافة 5 نانوغرام / مل IL-15 وإضافة 1 مل / جيد من الخلايا T (مجموعه 1 × 10 خلايا T 6) إلى LCL التي هي بالفعل في لوحة 24 أيضا. في Grex40، وجلبالحجم الكلي للسائل الإعلام تصل إلى 30 مل.
- في يوم 3-4 التحفيز آخر، إذا كانت الخلايا متموجة أدى ذلك إلى انقسام لهم (في لوحة) 1:1 وسائل الإعلام إضافة جديدة تحتوي على 50 U / مل IL-2. إذا لم تكن متكدسة ثم نضح ببساطة ½ وسائل الإعلام واستبدالها مع وسائل الإعلام التي تحتوي على 50 U / مل IL-2. في Grex40، نضح نصف وسائل الإعلام، استبدال مع وسائل الإعلام الجديدة، وإضافة 50 U / مل IL-2.
- في يوم 7، كرر كما في الخطوة 4.6 ولكن استخدام IL-2 في اليوم من التحفيز، وليس IL-15.
5. ممثل النتائج
ويصور A التخطيطي للبروتوكول GMP المتوافقة تصنيع وافقت عليها الهيئة في الشكل 1. تستغرق العملية حوالي 50 يوما. طرق نموذجية توليد خلايا محددة الفيروسات T توسيع القائمة من قبل الخلايا T الذاكرة، ولكن تفتقر إلى خلايا دم الحبل السري T فيروس ذوي الخبرة، وبالتالي نحن بحاجة الى رئيس الوزراء السابق فيفو T السذاجة الخلايا. للقيام بذلك، ونحن نستخدم الخلايا الجذعية وكذلك السيتوكينات IL-7، IL-12، وIL 15-،اللازمة لتوليد خصوصية الفيروسية.
بعد 3 التحفيز، ينبغي أن يكون العائد على الخلايا 6 100x10. إذا الخلايا كافية ليست متاحة، يمكن إجراء التحفيز إضافية حتى العدد المرغوب فيه من CTLs متوفرة. ينبغي أن غالبية هذه الخلايا تكون CD3 + بمزيج من CD4 + + CD8 والخلايا التائية. ينبغي أن يكون هناك أقل من 15٪ خلايا NK (CD3-/CD56 +) وأقل من 1٪ CD19 + B الخلايا (الشكل 2).
ينبغي أن تعترف CTL الموسع مستضد pp65 من CMV، وhexon بينتون من اتش، فضلا عن العديد من مولدات المضادات التي يتم التعبير EBV على EBV-LCL. عند اختباره في مقايسة ELISPOT، CTL ينبغي تفرز المزيد من الإنترفيرون؟ واستجابة لهذه المستضدات من المستضدات غير ذات صلة (الشكل 3).
ينبغي أن CTL ليز أيضا الفيروسية الببتيد نابض هذه الأهداف التفجيرات PHA. في مقايسة 51 الإفراج الكروم، يجب CTL ليز LCL، CMVpp65-نابض واتش hexon و/أو أهداف نابض بينتون، نابض أهداف ولكن ليس مع الببتيدات غير ذي صلة (الشكل 4).
الشكل 1. الجيل متعددة للفيروسات محددة CTL من دم الحبل السري. التخطيطي تبين كامل عملية تصنيع CTL من دم الحبل السري. أولا يتم عزل الخلايا وحيدات النوى من دم الحبل السري الكسر 20٪ من وحدة دم الحبل السري السري مجزأة. باستثناء 5x10 6 خلايا التي يتم حفظها لتوليد LCL، ومطلي ثم جميع الخلايا الجذعية في وسائل الإعلام خلية لمدة 1-2 ساعات، وعند هذه النقطة ويتم حصاد الخلايا غير ملتصقة والمجمدة. ويتم تغذية DC DC ثم وسائل الإعلام التي تحتوي على IL-4 وGM-CSF. بعد 5 أيام من الثقافة، ونضجت وDC transduced مع ناقلات الغدانية تحتوي على مستضد CMV سائد مناعيا pp65. في البدء، يتم الجمع بين هذه DC مع الخلايا غير ملتصقة وكذلك السيتوكينات IL-7، IL-12،وIL-15. في التحفيز لاحقة، يتم استخدام ناقلات نفس الغدانية لتنبيغ EBV-LCL، والتي تستخدم الخلايا كما مستضد تقديم. IL-15 ويستخدم في التحفيز الثانية و2-IL بعد ذلك.
الشكل 2. النمط الظاهري الناتج من الخلايا T. أظهرت هو النسبة المئوية للخلايا الحية المدرجة في البوابة اللمفاويات. CTL + CD3 هي وCD4 + + CD8 أو CD3-/CD56- ولكن إلى حد كبير وCD19.
الشكل 3. وظائف T الخلية. تم اختبار T خصوصية الخلية عن طريق الإنترفيرون γELISPOT. ونابض خلايا T مع الببتيد متداخلة تغطي كامل البروتين من hexon، بينتون، pp65، ومستضد غير ذي صلة IE 1-. CTL وحده يشير إلى وسائل الإعلام وحدها. وLCL ذاتي المشع، وأضاف في 1x10 5 / أيضا. أظهرت هو المكان يعني تشكيل خلية جount الآبار ثلاث نسخ.
الشكل 4. النشاط لحل الخلايا من CTL. تم اختبار قدرة CTL مما أدى إلى التعبير عن أهداف ليز المستضدات الفيروسية في مقايسة الكروم 51. ونابض 51 الكروم، وصفت التفجيرات ذاتي PHA مع الببتيدات متداخلة تغطي كامل المستضد أو 51 الكروم، وصفت ذاتي cocultured LCL مع CTL. بعد 4 ساعات، وتحسب على الافراج غاما عداد غاما.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن الاستراتيجيات الحالية التي تهدف إلى السيطرة على العدوى الفيروسية بعد CBT تكون فعالة، ولكن ترتبط مع أنها السميات كبيرة، غالية الثمن، ولا تمنح حماية ضد العدوى على المدى الطويل في وقت لاحق. في الواقع، قد يكون استخدام بعض الأدوية المضادة للفيروسات يحد من التوسع في الخلايا T الفيروسات محددة من شأنها أن يكون الأمر خلاف ذلك واقية 14 وثمة خيار آخر هو ضخ خلايا الفيروسات محددة المانحة المستمدة T. نحن وغيرنا قد أظهرت أن الخلايا T هذه هي آمنة، فعالة، وفعالة من حيث التكلفة. 15-17 وهنا تبين أن هذا النهج يمكن أيضا أن تمتد إلى دم الحبل السري.
لا بد من استخدام تقنية زراعة الخلايا العقيم عند الإنسان الأساسية. نظرا لطبيعة السذاجة من الخلايا T، فإنه من المهم أيضا أن يتم استخدام مصل الإنسان في جميع وسائل الإعلام التي تتطلب المصل. في تجربتنا، فإن المنتجات المحتوية على FBS يؤدي إلى التوسع الهائل للخلايا T التي تستهدف البروتينات المستمدة من FBS.
ve_content "> عندما عزل الخلايا وحيدات النوى باستخدام التدرج Ficoll، غالبا ما يكون من الصعب استبعاد خلايا الدم الحمراء لأن العديد من الأنوية و lysed ليس من قبل الخلية الحمراء العازلة تحلل. وإذا كان عدد خلايا الدم الحمراء هو المفرط، يمكن إعادة المنتج -ficolled.في حين يقتصر الأسلوب هنا إلى توسيع الفيروسات محددة وهي خلايا T CMV، EBV، واتش-IT. تنطبق على توليد خلايا مستضد محددة أخرى T من دم الحبل السري وكذلك استخدام الخلايا الجذعية وفوق كوكتيل خلوى المذكورة هو محفز قوي للخلايا T السذاجة وينبغي أن تقود التوسع في مستضد محددة CTL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل L. دان دنكان منحة بحثية تعاونية (CMB ونقابة الصحفيين المصرية)، المعهد الوطني للقلب والرئة، والدم المعهد (US4HL081007)، وسرطان الدم وسرطان الغدد الليمفاوية جمعية جائزة الباحث العلمي البحوث السريرية (CMB)، والمعهد الوطني للسرطان (RO1 CA06150816؛ نقابة الصحفيين المصرية).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 21870-076 | |
| DC media | CellGenix | 20801-0500 | |
| EHAA (Click’s Medium) | Irvine Scientific | 9195 | |
| Human Serum | Gemini Bio Products | 100-110 | |
| Gas Permeable Cultureware18 | Wilson Wolf Manufacturing | 80040S | |
| IL-2 | Chiron (TCH Pharmacy) | ||
| IL-12 | National Cancer Institute | ||
| IL-15 | CellGenix | 1013-050 | |
| IL-7 | R&D Systems | AFL207 | |
| IL-1beta | R&D Systems | AFL201 | |
| IL-6 | CellGenix | 1004-050 | |
| GM-CSF | TCH Pharmacy | ||
| IL-4 | R&D Systems | AFL204 | |
| TNF-alpha | R&D Systems | AFL210 | |
| Ad5f35pp65 | BCM CAGT Vector Production Facility | ||
| Plasma transfer set with female luer adapter | Charter Medical | 89-550-66j | |
| Lymphoprep | Nycomed | 1114550 |
References
- Kennedy-Nasser, A. A. Comparable outcome of alternative donor and matched sibling donor hematopoietic stem cell transplant for children with acute lymphoblastic leukemia in first or second remission using alemtuzumab in a myeloablative conditioning regimen. Biol. Blood Marrow Transplant. 14, 1245-1245 (2008).
- Hanley, P. J. Improving clinical outcomes using adoptively transferred immune cells from umbilical cord blood. Cytotherapy. 12, 713 (2010).
- Szabolcs, P., Cairo, M. S. Unrelated umbilical cord blood transplantation and immune reconstitution. Semin. Hematol. 47, 22 (2010).
- Canto, E., Rodriguez-Sanchez, J. L., Vidal, S. Distinctive response of naive lymphocytes from cord blood to primary activation via TCR. J. Leukoc. Biol. 74, 998-998 (2003).
- Leen, A. M. Monoculture-derived T lymphocytes specific for multiple viruses expand and produce clinically relevant effects in immunocompromised individuals. Nat. Med. 12, 1160-1160 (2006).
- Riddell, S. R. Restoration of viral immunity in immunodeficient humans by the adoptive transfer of T cell clones. Science. 257, 238 (1992).
- O'Reilly, R. J. Adoptive transfer of antigen-specific T-cells of donor type for immunotherapy of viral infections following allogeneic hematopoietic cell transplants. Immunol. Res. 38, 237-237 (2007).
- Peggs, K. S. Adoptive cellular therapy for early cytomegalovirus infection after allogeneic stem-cell transplantation with virus-specific T-cell lines. Lancet. 362, 1375-1375 (2003).
- Sili, U. Large-scale expansion of dendritic cell-primed polyclonal human cytotoxic T-lymphocyte lines using lymphoblastoid cell lines for adoptive immunotherapy. J. Immunother. 26, 241 (2003).
- Bollard, C. M. Good manufacturing practice-grade cytotoxic T lymphocytes specific for latent membrane proteins (LMP)-1 and LMP2 for patients with Epstein-Barr virus-associated lymphoma. Cytotherapy. 13, 518 (2011).
- Hanley, P. J. Functionally active virus-specific T cells that target CMV, adenovirus, and EBV can be expanded from naive T-cell populations in cord blood and will target a range of viral epitopes. Blood. 114, 1958 (1958).
- Hanley, P. J. Expansion of T cells targeting multiple antigens of cytomegalovirus, Epstein-Barr virus and adenovirus to provide broad antiviral specificity after stem cell transplantation. Cytotherapy. , (2011).
- Gerdemann, U. Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant. J. Vis. Exp. (51), e2736 (2011).
- Mori, T., Kato, J. Cytomegalovirus infection/disease after hematopoietic stem cell transplantation. Int. J. Hematol. 91, 588 (2010).
- Einsele, H. Infusion of cytomegalovirus (CMV)-specific T cells for the treatment of CMV infection not responding to antiviral chemotherapy. Blood. 99, 3916 (2002).
- Bao, L. Expansion of cytomegalovirus pp65 and IE-1 specific cytotoxic T lymphocytes for cytomegalovirus-specific immunotherapy following allogeneic stem cell transplantation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14, 1156 (2008).
- Shpall, E. J., Bollard, C. M., Brunstein, C. Novel cord blood transplant therapies. Biol. Blood Marrow Transplant. 17, Suppl 1. S39-S45 (2011).
- Vera, J. F. Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex. J. Immunother. 33, 305 (2010).
