Summary
Здесь мы опишем первый надлежащей производственной практики (GMP)-совместимый способ получения вирус-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) из пуповинной крови, источником преимущественно наивных Т-клеток.
Abstract
Вирус инфекции после трансплантации стволовых клеток являются одними из самых распространенных причин смерти, особенно после пуповинной крови (CB) Трансплантация (CBT), где ЦБ не содержит заметное количество вируса опытный Т-клеток, который может защитить получателя от инфекции 1. - 4 Мы и другие показали, что вирус-специфических CTL, полученные от инфицированных доноров и настаивают, чтобы получатель являются безопасными и защитные. 5-8 Однако, до недавнего времени вирус-специфических Т-клеток, не могли быть получены из пуповинной крови, вероятно, связано с Отсутствие вирус-специфических Т-клеток памяти.
В попытке лучше имитировать в естественных условиях грунтовки наивных Т-клеток, мы создали метод, который использовал CB-дендритных клеток (ДК) трансдуцированных аденовирусные вектора (Ad5f35pp65), содержащих антиген CMV иммунодоминантные РР65, следовательно, вождение Т клеточную специфичность к ЦМВ и аденовирус. 9 На инициацию, мы используем эти мазахваченного ДК, а также CB-производных Т-клеток в присутствии цитокинов IL-7, IL-12 и IL-15. 10 На второй стимуляции мы использовали EBV-трансформированных клеток, или EBV-LCL, которые выражают как скрытых и литические антигены ВЭБ. Ad5f35pp65-трансдуцированных EBV-LCL используются для стимуляции Т-клеток в присутствии ИЛ-15 на второй стимуляции. После стимуляции использовать Ad5f35pp65-трансдуцированных EBV-LCL и ИЛ-2.
Из 50x10 6 CB мононуклеаров мы способны генерировать свыше 150 х 10 6 вирус-специфических Т-клеток, что лизировать антиген-импульсной цели и освобождение цитокинов в ответ на антигенную стимуляцию 11. Эти клетки были изготовлены в GMP-совместимый способом, используя только 20% доля фракционированного блок пуповинной крови и были переведены для клинического использования.
Protocol
1. Мононуклеарные изолятор (день 0)
- Вставьте всплеск женской Luer адаптер к розетке порта 20% долей единицы пуповинной крови, приложить шприц и удалить кровь. Передача талой крови до 20 мл RPMI нагревают в 50 мл центрифужные пробирки. Промойте мешок пуповинной крови с 5 мл RPMI и трансфер в той же трубке центрифуги.
- Центрифуга клетки в течение 10 минут при 400 х г. Супернатант.
- Ресуспендируют клеток в 20 мл теплой RPMI. Слой клеток на 15 мл Lymphoprep в 50 мл центрифужные пробирки. Центрифуга 40 минут при 400 х г.
- Урожай интерфейс, содержащий мононуклеаров и мыть в 20 мл RPMI. Центрифуга в течение 10 минут при 450 х г.
- Супернатант и мыть в 20 мл RPMI. Граф клеток и вращаться в течение 5 минут при 400 х г.
- Супернатант и ресуспендирования клеток в 5 х 10 6 мононуклеарных клеток / мл Cellgenix DC СМИ (без сыворотки). Удалить 1 мл для EBV-LCL поколения и введен в 15 мл сеntrifuge трубку.
2. Дендритные поколения Cell (начиная со дня 0)
- Plate 2 мл клеток (уже на 5 х 10 6 клеток / мл DC СМИ) на лунку в 6-луночный планшет. Оставить в инкубаторе в течение 1-2 часов.
- Через 1-2 часа смыть не соблюдают клеток стиральных 3-4 раза с PBS. Сбор не соблюдают клетки и заморозить. Добавить 2 мл / лунку DC средах, содержащих 1000 U / мл IL-4 и 800 ЕД / мл GM-CSF.
- 3-4 дней после начала постоянного тока, пополнить IL-4 и GM-CSF, добавив 100 мкл / лунку средах, содержащих конечной концентрации 1000U/mL IL-4 и 800 ЕД / мл GM-CSF.
- В день 5-6, урожай DC, очищая также с передачей пипетки. Граф большие клетки и центрифуги в течение 5 минут при 400 х г. Аспирата СМИ и ресуспендируют постоянного тока на 2х10 6 клеток / мл DC СМИ. Добавить 0,5 мл / лунку в 24-луночный планшет.
- Преобразовывать постоянный ток использованием Ad5f35pp65 вектора в клетки МВД в инфекционное из 10 единиц. Добавить Vectoг в каждую лунку в 24-луночный планшет. Инкубировать клетки в течение 1,5 часов. Через 1,5 часа, добавить 1,5 мл / лунку DC средах, содержащих: 1000 Ед / мл IL-4, 800 Ед / мл GM-CSF, 10 нг / мл TNF-альфа, 1 мкг / мл PGE-1, 100 нг / мл IL-6, и 10 нг / мл IL-1b. Эти цитокины созревания ДК.
3. Генерация EBV-LCL (начиная со дня 0)
- Центрифуга пробирку, содержащую 5 х 10 6 мононуклеаров. Добавить 200 мкл концентрированного EBV B95.8 супернатант и 1,8 мл полной среды (RPMI + 10% FBS + 2 мМ L-глутамина), содержащие циклоспорин (1 мкг / мл).
- Алиготе 100 мкл клеток в 10 скважинах из 96-луночный планшет и 200 мкл на 5 скважинах. Добавить 100 мкл полной циклоспорина СМИ + в лунки, содержащие только 100 мкл клеток. Заполните оставшиеся лунки стерильной водой.
- Поток LCL еженедельно и расширяться от 96-луночный планшет с 24-луночный планшет после ~ 2 недели. Еще через неделю, трансфер в колбе T25 и в последующей передачей неделюT75 колбу. На этом этапе рекомендуется заморозить аликвоты LCL. Это обычно занимает 1 месяц генерировать достаточное количество LCL.
4. CTL Начало - 7 дней после начала РС
- Урожай ДК и облучают в дозе 30 Гр. Промойте 4 х и кол. Ресуспендируют DC в Т-клеточных средах, содержащих сыворотки крови человека (45% RPMI, 45% CLICK, 10% человеческой сыворотки, 2 мМ L-глутамина) @ 1 х 10 5 РС / мл.
- Оттепель не соблюдают клеток, начиная с шага 2.2. Вымойте клетки, и считать. Ресуспендируют на 2 х 10 6 неадгезивные клеток / мл в Т-клеточных средах, содержащих сыворотки крови человека. Добавить 10 нг / мл IL-7 и ИЛ-12, и 5 нг / мл IL-15. Добавить 1 мл клеток на лунку в 24-луночный планшет. Добавить 1 мл DC на лунку. Заполнить пустые лунки 24-луночный планшет с стерильной водой.
- 7 дней после начала Т-клеток, кормов и / или разделение клеток с Т СМИ ячейку, содержащую сыворотки крови человека.
- 9-12 дней после начала Т-клеток, замораживать Т-клеток до LCL готовы.
- Oсть LCL расширили и пассировать в T75 колбы, преобразовывать LCL путем центрифугирования в течение 5 минут при 400 х г. Добавить вектора осадок клеток в МВД из 100 инфекционных единиц на клетку. Выдержите в течение 1,5 часов. Через 1,5 часа, ресуспендируют в полной среде при 5 х 10 5 LCL / мл и добавляют 2 мл на лунку в 24-луночный планшет 12.
- Через 2 дня собрать LCL и облучают при 40 Гр. Промойте 4 х и кол. Ресуспендируют LCL в Т-клеточных средах, содержащих сыворотки крови человека на уровне 2,5 х 10 5 клеток / мл. Добавить 1 мл LCL на лунку в 24-луночный планшет. Кроме того, добавьте 5 х 10 6 LCL к Grex40 устройств культуры, а также 5 нг / мл IL-15 13.
- Урожай Т-клеток. Центрифуга в течение 5 минут при 400 мкг, аспирации супернатант и ресуспендируют в Т-клеточных средах, содержащих сыворотки крови человека на 1 х 10 6 Т-клеток / мл. Добавить 5 нг / мл IL-15 и добавить 1 мл / и Т-клеток (всего 1 х 10 6 клеток T) в LCL, которые уже в 24-луночный планшет. В Grex40, принесиобщего объема средств массовой информации до 30 мл.
- В день 3-4 после стимуляции, если клетки сливающийся затем разделить их (в пластине) 1:1 и добавляют свежую среду, содержащую 50 Ед / мл IL-2. Если они не вырожденная, то просто аспирации ½ средствах массовой информации и заменить со средствами массовой информации, содержащего 50 ЕД / мл IL-2. В Grex40, аспирации половины средств массовой информации, заменить свежей информации, и добавить 50 Ед / мл IL-2.
- На 7 день повторять, как в шаге 4,6, но использовать Ил-2 в день стимуляции, а не IL-15.
5. Представитель Результаты
Схема GMP-совместимый FDA утвержденных производственных протокола изображено на рисунке 1. Этот процесс занимает около 50 дней. Типичные методы генерации вирус-специфических Т-клеток, расширить уже существующие ячейки памяти T, однако пуповинной крови не хватает вируса опытный Т-клеток и, следовательно, мы должны наивным премьер-T бывших естественных условиях клетки. Для этого мы используем дендритных клеток, а также цитокинов IL-7, IL-12 и IL-15,необходимые для создания вирусного специфику.
После 3 раздражений, доходность должна быть более 100х10 6 клеток. Если достаточное клетки отсутствуют, дополнительных стимуляций может быть выполнено до нужного количества ЦТЛ имеются. Большинство из этих клеток должна быть CD3 + смесью CD4 + и CD8 + Т-клеток. Там должно быть не менее 15% NK клеток (CD3-/CD56 +) и менее 1% CD19 +-клетки (рис. 2).
Расширенный CTL следует признать антигена РР65 от ЦМВ, Hexon и Пентон от аденовируса, а также многочисленных антигенов EBV, которые выражаются в EBV-LCL. При испытании в анализе ELISPOT, CTL должны выделять больше ИФН-? В ответ на эти антигены, чем никакого отношения антигенов (рис. 3).
CTL также должны лизировать вирусных пептид-импульсной целей, таких взрывов PHA. В 51-анализе выпуска Cr, CTL должны лизировать LCL, CMVpp65-импульсного и аденовирус Hexon и /или Пентон-импульсной цели, но не целевые импульсный, не относящимися к пептидов (рис. 4).
Рисунок 1. Поколение мульти-вирус-специфических CTL из пуповинной крови. Схема, показывающая весь процесс CTL производства из пуповинной крови. Первый пуповинной крови мононуклеаров изолированы от 20% долей фракционированного единица пуповинной крови пуповины. За исключением 5x10 6 клеток, которые сохраняются для поколения LCL, все клетки, которые затем помещают в дендритные клетки средствах массовой информации в течение 1-2 часов, после чего не соблюдают клетки собирали и замораживали. DC затем подаются DC средах, содержащих IL-4 и GM-CSF. После 5 дней культуры, постоянного тока созрел и трансдуцированных аденовирусной вектора, содержащего иммунодоминантные антигена ЦМВ РР65. При инициации, эти постоянного тока в сочетании с не соблюдают клеток, а также цитокинов IL-7, IL-12,и IL-15. На последующих раздражений, то же аденовирусный вектор используется для трансдукции EBV-LCL, которые используются в качестве антиген-представляющие клетки. IL-15 используется на второй стимуляции и IL-2 в дальнейшем.
Рисунок 2. Фенотип в результате Т-клеток. Показан процент живых клеток, включенных в лимфоцитами ворот. CTL являются CD3 + и CD4 + и CD8 +, но в основном CD3-/CD56- и CD19-.
Рисунок 3. Т-клеточной функции. T клеточную специфичность была проверена IFN-γELISPOT. T клетки импульсно перекрывающихся пептидов, охватывающих весь белка Hexon, Пентон, РР65, и не имеет значения антиген IE-1. CTL одно это указывает на СМИ в одиночку. Аутологичные LCL облучали и добавил в 1x10 5 / а. Показана средняя месте формирования Cell CДобавить систему из трех экземплярах скважин.
Рисунок 4. Цитолитическую активность CTL. Способность результате CTL для лизиса целей выражения вирусных антигенов была испытана в 51-анализа Кр. 51 Cr-меченных аутологичных взрывов PHA были импульсные с перекрывающихся пептидов, охватывающих весь антигена или 51 Cr-меченных аутологичных LCL были cocultured с CTL. Через 4 часа, гамма-релизе было рассчитывать на гамма-счетчике.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Данной стратегии, направленные на борьбу с вирусными инфекциями после ТОС могут быть эффективными, но они связаны со значительными токсичности, стоят дорого, и не придают долгосрочную защиту против инфекции позже. На самом деле, использование некоторых противовирусных препаратов может ограничить расширение вирус-специфических Т-клеток, которые иначе были бы защитную 14. Другим вариантом является вливание донорской полученных вирус-специфических Т-клеток. Мы и другие показали, что такие Т-клетки являются безопасными, эффективными и рентабельными. 15-17 Здесь мы покажем, что этот подход может быть распространен на пуповинной крови.
Крайне важно использовать асептики при культивировании человеческих первичных клеток. В связи с наивным характером Т-клетки, также важно, что сыворотке крови человека используется во всех средствах массовой информации, которые требуют сыворотки. По нашему опыту, FBS-содержащей продукции приведет к массовому распространению Т-клеток ориентации белков, полученных из FBS.
ve_content "> При выделении мононуклеарных клеток с использованием градиента Ficoll, часто бывает трудно исключить красные кровяные клетки, потому что многие из них зарождаются и не лизировали красного буфера для лизиса клеток. Если число красных кровяных клеток является чрезмерным, продукт может быть повторно -ficolled.В то время как метод здесь ограничивается расширением вирус-специфических Т-клеток, а именно CMV, EBV, и аденовирус-это применимо к поколению другие антиген-специфические Т-клетки из пуповинной крови, а также. Использование дендритных клеток и выше цитокинов коктейль является мощным стимулятором наивных Т-клеток и должны вести расширение антиген-специфические CTL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Dan Duncan L. совместных исследовательских грантов (CMB и EJS), Национальный институт сердца, легких и крови институт (US4HL081007), лейкемии и лимфомы общества клинической награду научный сотрудник (CMB) и Национального института рака (RO1 CA06150816; EJS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 21870-076 | |
| DC media | CellGenix | 20801-0500 | |
| EHAA (Click’s Medium) | Irvine Scientific | 9195 | |
| Human Serum | Gemini Bio Products | 100-110 | |
| Gas Permeable Cultureware18 | Wilson Wolf Manufacturing | 80040S | |
| IL-2 | Chiron (TCH Pharmacy) | ||
| IL-12 | National Cancer Institute | ||
| IL-15 | CellGenix | 1013-050 | |
| IL-7 | R&D Systems | AFL207 | |
| IL-1beta | R&D Systems | AFL201 | |
| IL-6 | CellGenix | 1004-050 | |
| GM-CSF | TCH Pharmacy | ||
| IL-4 | R&D Systems | AFL204 | |
| TNF-alpha | R&D Systems | AFL210 | |
| Ad5f35pp65 | BCM CAGT Vector Production Facility | ||
| Plasma transfer set with female luer adapter | Charter Medical | 89-550-66j | |
| Lymphoprep | Nycomed | 1114550 |
References
- Kennedy-Nasser, A. A. Comparable outcome of alternative donor and matched sibling donor hematopoietic stem cell transplant for children with acute lymphoblastic leukemia in first or second remission using alemtuzumab in a myeloablative conditioning regimen. Biol. Blood Marrow Transplant. 14, 1245-1245 (2008).
- Hanley, P. J. Improving clinical outcomes using adoptively transferred immune cells from umbilical cord blood. Cytotherapy. 12, 713 (2010).
- Szabolcs, P., Cairo, M. S. Unrelated umbilical cord blood transplantation and immune reconstitution. Semin. Hematol. 47, 22 (2010).
- Canto, E., Rodriguez-Sanchez, J. L., Vidal, S. Distinctive response of naive lymphocytes from cord blood to primary activation via TCR. J. Leukoc. Biol. 74, 998-998 (2003).
- Leen, A. M. Monoculture-derived T lymphocytes specific for multiple viruses expand and produce clinically relevant effects in immunocompromised individuals. Nat. Med. 12, 1160-1160 (2006).
- Riddell, S. R. Restoration of viral immunity in immunodeficient humans by the adoptive transfer of T cell clones. Science. 257, 238 (1992).
- O'Reilly, R. J. Adoptive transfer of antigen-specific T-cells of donor type for immunotherapy of viral infections following allogeneic hematopoietic cell transplants. Immunol. Res. 38, 237-237 (2007).
- Peggs, K. S. Adoptive cellular therapy for early cytomegalovirus infection after allogeneic stem-cell transplantation with virus-specific T-cell lines. Lancet. 362, 1375-1375 (2003).
- Sili, U. Large-scale expansion of dendritic cell-primed polyclonal human cytotoxic T-lymphocyte lines using lymphoblastoid cell lines for adoptive immunotherapy. J. Immunother. 26, 241 (2003).
- Bollard, C. M. Good manufacturing practice-grade cytotoxic T lymphocytes specific for latent membrane proteins (LMP)-1 and LMP2 for patients with Epstein-Barr virus-associated lymphoma. Cytotherapy. 13, 518 (2011).
- Hanley, P. J. Functionally active virus-specific T cells that target CMV, adenovirus, and EBV can be expanded from naive T-cell populations in cord blood and will target a range of viral epitopes. Blood. 114, 1958 (1958).
- Hanley, P. J. Expansion of T cells targeting multiple antigens of cytomegalovirus, Epstein-Barr virus and adenovirus to provide broad antiviral specificity after stem cell transplantation. Cytotherapy. , (2011).
- Gerdemann, U. Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant. J. Vis. Exp. (51), e2736 (2011).
- Mori, T., Kato, J. Cytomegalovirus infection/disease after hematopoietic stem cell transplantation. Int. J. Hematol. 91, 588 (2010).
- Einsele, H. Infusion of cytomegalovirus (CMV)-specific T cells for the treatment of CMV infection not responding to antiviral chemotherapy. Blood. 99, 3916 (2002).
- Bao, L. Expansion of cytomegalovirus pp65 and IE-1 specific cytotoxic T lymphocytes for cytomegalovirus-specific immunotherapy following allogeneic stem cell transplantation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14, 1156 (2008).
- Shpall, E. J., Bollard, C. M., Brunstein, C. Novel cord blood transplant therapies. Biol. Blood Marrow Transplant. 17, Suppl 1. S39-S45 (2011).
- Vera, J. F. Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex. J. Immunother. 33, 305 (2010).
