Vurdering Nedsat metaboliske ændringer Under Progressive Kolonisering af Kim-fri mus ved ¹ H-NMR-spektroskopi

Summary

En progressiv kolonisering proceduren er beskrevet yderligere at kunne vurdere dens indvirkning på værten hepatisk metabolisme. Colonization overvåges ikke invasivt ved at evaluere urinudskillelsen af ​​mikrobielle co-metabolitter ved NMR-baseret metabolisk profilering, mens levermetabolisme er vurderet af High Resolution Magic Angle Spinning (HR MAS) NMR profilering af intakte biopsi.

Abstract

Det er velkendt, at tarmbakterier bidrage væsentligt til værten homeostase, hvilket giver en række fordele, såsom immunbeskyttelsen og vitamin syntese. De leverer også værten med en betydelig mængde af næringsstoffer, hvilket gør dette økosystem en væsentlig metabolisk organ. I forbindelse med stigende dokumentation for sammenhængen mellem tarmflora og det metaboliske syndrom, forståelse af metabolisk interaktion mellem vært og dens tarm mikrobiota er ved at blive en stor udfordring for moderne biologi. ^1-4

Colonization (også kaldet normalisering processen) betegner etablering af mikroorganismer i en tidligere kim-fri dyr. Selv om det er en naturlig proces, der forekommer ved fødslen, er det også anvendes til voksne kim-fri dyr til at kontrollere tarmen blomsterarter økosystemet og yderligere bestemme dets indvirkning på værten stofskiftet. En fælles procedure til at kontrollere de kolonisering processen er at bruge sonde metoden med en single eller en blanding af mikroorganismer. Denne metode resulterer i en meget hurtig kolonisering og præsenterer den ulempe, at ekstremt stressende ^5. Derfor er det nyttigt at minimere stress og for at opnå en langsommere kolonisering proces at observere gradvist virkningen af ​​bakteriel etablering på værten stofskiftet.

I dette manuskript, beskriver vi en procedure for at vurdere ændringen af ​​levermetabolisme under en gradvis kolonisering proces med en ikke-destruktiv metabolisk profilering teknik. Vi foreslår at overvåge tarmen mikrobiel kolonisering ved at vurdere tarmen mikrobielle metaboliske aktivitet afspejles i urinudskillelsen af mikrobielle co-metabolitter ved ¹ H NMR-baseret metabolisk profilering. Dette giver en vurdering af stabiliteten i tarmen mikrobielle aktivitet ud over den stabile etableringen af tarmen mikrobielle økosystem vurderes normalt ved at overvåge fecal bakterier ved DGGE (denaturering gradient gelelektroforese). ⁶ Denkolonisering foregår i en konventionel åbent miljø og er initieret af en beskidt kuld tilsølet af konventionelle dyr, der skal tjene som kontrol. Gnavere er coprophagous dyr, dette sikrer en homogen kolonisering som tidligere beskrevet. ⁷

Nedsat metabolisk profilering måles direkte fra en intakt leverbiopsi bruger ¹ H High Resolution Magic Angle Spinning NMR spektroskopi. Denne semi-kvantitative teknik tilbyder en hurtig måde at vurdere, uden at beskadige cellen struktur, hovedmetabolitter som triglycerider, glukose og glykogen for yderligere at vurdere det komplekse samspil mellem kolonisering processen og den hepatiske metabolisme ^7-10. Denne metode kan også anvendes på alle væv biopsi ^11,12.

Protocol

1. Kolonisering af kim-fri dyr og prøvetagning

1. Fjern kim-fri dyr fra isolatorer og huse dem i et konventionelt husdyrbrug værelse i bure udstyret med filter foran den konventionelle dyr, som vil tjene som kontrol (Figur 1).
2. Bland halvdelen af ​​kuldet (3 dage gammel) taget fra kontrol konventionelle buret med kuld af kimen-frie dyr. Hold altid 1 / 3 af det beskidte konventionelle kuld, hver gang det er nødvendigt at forny det for at opretholde et niveau af bakterier (holde det i det mindste for 3 dage).
3. Saml urin i en 1,5 ml mikrorør ved at håndtere musen over røret og hjælpe vandladning ved forsigtigt at massere tarm. Snap-fryse straks i flydende kvælstof. Opbevares ved mindst -40 ° C, indtil NMR analyse. Et minimum volumen på 20 μL er nødvendig for erhvervelsen med et 5 mm NMR roer, men det anbefales at bruge 30 mikroliter med at forbedre kvaliteten af ​​metabolisk profilering.
4. Dyr bør be aflives uden brug af bedøvelse for at undgå confounding NMR resonanser pga. hepatisk metabolisme af bedøvende stoffer (for eksempel, dislokation af halsen efterfulgt af bekræftelsen af ​​dødens indtræden ved afblødning brug)

2. Anbefaling til opsamling af leverbiopsi

1. Brug ikke produkt, der indeholder alkohol, for at undgå forurening. Vask værktøj med kun vand eller saltvand.
2. Du må ikke perforere galdeblære. I tilfælde af galde lækage, vask væv straks med vand eller saltvand.
3. Saml leverbiopsier (ca. 15-50 mg) fra venstre lap som vist i figur 2. For reproducerbar biopsier, indsamle konsekvent i midten af ​​den venstre lap undgå de perifere områder, hvor vævet er tyndere.
4. Snap fryse biopsier i flydende kvælstof straks og opbevares ved -80 ° C, indtil NMR analyse.

3. ¹ H NMR erhvervelse af urin microvolume

Forbered 0.2M natrium fosfatbuffer i D2O (99,8%), pH 7,4 indeholdende 1 mM 3 - (trimethylsilyl) propionsyre-d ₄ (TSP).

Bland 30 μL af urin med 30 μL af natrium fosfat buffer.

Overfør 50 μL af blandede opløsning i 1,7 mm NMR kapillarrør (Figur 3 (2)) ved hjælp af en 50 μL glassprøjte udstyret med en metal kanyle (OD 0,5 mm). Vær omhyggelig med at undgå bobler.

Monter kapillar adapter (Figur 3 (3)) oven på kapillar indeholder urinprøve og læg det i en 2,5 mm NMR mikrorør til 5 mm NMR roer (Figur 3 (1)). Brug denne kombination af rør som en almindelig 5 mm NMR rør til spektral erhvervelse.

Brug udvinding stangen (Figur 3 (4)) til at fjerne kapillær fra 2,5 mm NMR rør ved at skrue den kapillære adapteren forsigtigt at trække det ud.

. 4 ¹ H HR MAS NMR af levervæv biopsi: prøveforberedelse

1. MAS rotor komponenter og værktøjer erbeskrevet i Figur 4.
2. Indsæt biopsi (ca. 15-50 mg) i zirconium rotor (Figur 4 (1)), og fyld resten af volumen med ren D ₂ O til NMR-lås. Vær omhyggelig med ikke at foretage nogen bobler, fordi dette ville ændre kvaliteten af ​​efterfølgende lagdannelse og kvaliteten af ​​dataopsamling.
3. Sæt 50 μL Teflon spacer (Figur 4 (2)) ved hjælp af cylindriske skruen (Figur 4 (5)). Skru den og kalibrere det med dybdemåler på den korte side (Figur 4 (8)). På dette trin, er det vigtigt at betale en særlig opmærksomhed til prøven, fordi en del af det kan sive igennem spacer hullet. Hvis dette er tilfældet, så en del af biopsi er ødelagt, og prøvens vægt er ikke længere pålidelige. Det er derfor nødvendigt at starte forfra fra begyndelsen forberedelse af prøven.
4. Placer thead pin (Figur 4 (3)), og skru det forsigtigt med en skruetrækker (Figur 4 (6)). Tørre ud eventuelt resterende vand med et stykke væv.
5. Sæt hætten (Figur 4 (4)) påtoppen af ​​rotoren og indsætte det i rotoren pakkeren (Figur 4 (6)). Tryk hårdt, indtil hætten er på plads. Der bør ikke være nogen plads tilbage mellem rotor og cap.
6. Mark halvdelen af ​​den nederste del af rotoren med en sort tusch til at tillade optisk spin sats detektion.
7. Anbring rotoren inde i NMR-spektrometer og starte spinning på 5 kHz. Erhverve ¹ H NMR spektret ved hjælp af CPMG puls sekvens ¹³ Ifølge producentens vejledning.
8. Brug α anomere glukose resonans på 5,22 ppm (dublet) til at kalibrere NMR spektre.
9. At pakke rotoren, skal du fortsætte ved at fjerne hætten ved hjælp af cap remover (Figur 4 (9)). Skru thead pin og fjerne Teflon spacer bruger den cylindriske skruen. Vask grundigt med vand og vaskemiddel.

5. Repræsentative resultater

Gut mikrobielle aktivitet kan overvåges ved hjælp af urin metabolisk profilering. Et stort antal af urin mikrobielco-metabolitter, som er karakteriseret ved ¹ H NMR er blevet beskrevet i litteraturen ^7,14-17. Disse mikrobiel co-metabolitter er især nyttige til at overvåge koloniseringen processen, da de giver en hurtig og noninvasiv metode til at estimere, hvornår den nyetablerede økosystemet er stabil. Figur 5A tydeligt illustrerer forekomsten af ​​tarmen mikrobiel co-metabolitter over kolonisering processen. Dette tal viser en urin metabolisk profil opnås ved at følge proceduren beskrevet i Trin 2 for et dyr koloniserede 20 dage ved hjælp af proceduren beskrevet i trin 1. Dette dyr har ikke udskiller noget indoxyl sulfat og meget små mængder af phenylacetylglycine (PAG) og p-cresol sulfat på kim-fri tilstand (dag 0-blå). Som kolonisering skrider frem, disse 3 markører af protein metabolisme i tarmen mikrobiota stige betydeligt for at nå en ligevægt på dag 20 (rød). Dette er særlig nemt at overvåge for en gruppe af dyr som illustreret på figur 5B ved hjælp af PAGresonans. Dette diagram blev opnået ved at integrere området under resonanser fremhævet i gråt i figur 5A (δ fra 7,40 til 7,43), svarende til en specifik resonans (triplet) af PAG for en gruppe på 7 dyr.

¹ H High Resolution Magic Angle Spinning (HR MAS) NMR-spektroskopi er en ikke-destruktiv teknik, der giver hurtig og reproducerbar opkøb af metaboliske profiler af enhver form for biopsi ^18. I denne protokol, brugte vi denne kraftfulde teknik til at opnå en nedsat metaboliske profil af 2 mus før (blå) og efter (rød) kolonisering (Figur 6). Dette tal illustrerer godt de oplysninger, der kan udledes af en MAS NMR-baseret metabolisk profil. Talrige aminosyrer samt metabolitter stammer fra energiske metabolisme såsom glucose, glykogen, laktat, triglycerider, (D)-3-hydroxybutyrat og nicotinurate kan visualiseres. Disse profiler indeholder også oplysninger af betydning for oxidativt stress (dvs. ascorbinsyre encid, glutathion), nukleotid metabolisme (dvs. inosin, Uridin) og methylamin stofskifte (dvs. cholin, trimethylamin-N-oxid). I dette eksempel er det meget klart, at kim-fri mus viser næsten ingen glykogen og meget lave mængder af glucose og triglycerider, som er tidligere blevet udgivet ^7.

Figur 1. Oversigt over koloniseringen protokol. Kim-fri og konventionelle dyrene er anbragt i bure udstyret med filtre ved siden af ​​hinanden, og deres kuld der udveksles at tillade progressive kolonisering fra den konventionelle tarmen mikrobiota (1). Gut mikrobielle aktivitet overvåges ved hjælp af ¹ H NMR-baseret metabolisk profilering (2-3). Levermetabolisme vurderes ved ¹ H HR MAS NMR-baseret metabolisk profilering (4-5).

Figur 2. Mouse lever anatomi. Leveren er vist som den flade side af orglet ansigter bordet. For reproducerbar biopsier, anbefales det altid at indsamle prøver fra midten af ​​venstre lap som angivet ved den stiplede rektangel.

Figur 3 1,7 mm NMR kapillar kit til at arbejde med microvolumes Key:.. 1: 2,5 mm NMR mikrorør, 2: 1,7 mm NMR kapillarrør, 3: Kapillært adapter, 4: Ekstraktion stang.

. Figur 4 MAS rotor udstyr Key:. 1: MAS rotor, 2: 50 μL Teflon spacer, 3: thead pin, 4: cap, 5: cylindrisk skrue, 6: skruetrækker, 7: rotor Packer, 8: dybdemåler.

Figur 5. Udviklingen i urin metaboliske profiler i løbet colonizatioN.

1. Zoom på de aromatiske region af spektre mellem 6,8-7,8 ppm, hvor mikrobiel co-metabolitter kan visualiseres. ¹ H NMR spektre blev afledt af et enkelt individ på dag 0 (blå), 4 (grøn), 15 (orange) og 20 (rød) efter kolonisering. Den grå zone svarer til det område, der var integreret til at gøre diagrammet i B. Key: 1-MeHistamine: 1-methylhistamine; Indoxyl-S: Indoxyl sulfat, Hans: Histidin, p-cresol-S: p-cresol sulfat; PAG : Phenylacetylglycine.
2. Gennemsnitlig PAG koncentration under kolonisering (n = 7). Students t-test blev brugt til at sammenligne forskellen i PAG koncentrationen på forskellige tids-punkter: a: p <0,05 i forhold til dag 0, b: p <0,01 i forhold til dag 10.

Figur 6. Typisk 600 MHz ¹ H HR MAS NMR-spektre af leverbiopsier stammer fra kim-fri (blå) og ex-kim-fri (red) mus. Fed protoner er ansvarlige for triglycerid resonans Key:. 3-HB: 3-hydroxybutyrat, GSH: reduceret glutathion, TG'er: Triglycerider, TMAO: trimethylamin-N-oxid.

Discussion

I denne protokol, beskrev vi en progressiv kolonisering procedure i et åbent miljø for yderligere at undersøge virkningen af tarme mikrobiota på levermetabolisme vurderet af ¹ H HR MAS NMR profilering af intakte biopsi. Forskellige metoder til kolonisering er blevet beskrevet i litteraturen. De mest almindelige metoder til at kolonisere dyr med en defineret mikrobiota er oral sonde eller forurenet drikkevand ^19,20. Fecal podningen kan også bruges som tidligere beskrevet ^21. Koloniseringen Metoden præsenteres her, er afledt af en "normalisering" metode til kim-fri dyr beskrevet af Koopman JP et al. i 1986 ^22. I denne publikation, placeres forfatterne et levende konventionelle dyr ind i isolator blandt de kim-fri dyr. Men det er ikke altid muligt at holde dyr i isolatorer, især hvis de har brug for at blive manipuleret under koloniseringen processen (dette er især vanskeligt, hvis prøven ColleIndsatsen er påkrævet). Et alternativ er således at huset ex-kim-fri dyr i en konventionel åbent miljø i overværelse af kuldet tilsølet af konventionelle dyr, som vil blive brugt som kontrolgruppe. På denne måde er dyr manipulation med henblik på kolonisering minimal, og dette resulterer i lavere stress sammenlignet med oral sonde. Denne metode giver også mulighed for en progressiv kolonisering af tarmen, som er tættere på en naturlig kolonisering proces og tilbyder en homogen kolonisering af dyr, der deler den samme bur, som det fremgår af DGGE (Denaturering Gradient Gel Elektroforese) vurdering af mikrobielle DNA-profiler (fås som supplerende materiale i Claus et al. ^7).

Overvågning af kolonisering processen fra urin metabolisk profilering er en noninvasiv, nem, hurtig og effektiv måde at opdage, når den mikrobielle aktivitet bliver stabil. Da det ikke er nødvendigt at manipulere dyr hver dag til sådanne formål, som vist i figur 5B, er stress niveauet holdes pådens mindstekrav. Det er værd at nævne, at selv om kolonisering er indledt af et kuld tilsmudset af konventionelle kontrol dyr, er det nødvendigt at holde et lige stort antal af disse kontrolprocedurer dyr, der vil tillade en til at vurdere blandede effekter af stress og aldring på hepatisk metabolisme. Andre teknikker baseret på massespektrometri (MS) såsom GC-MS (gaskromatografi) eller LC-MS (Liquid Chromatography) kan også bruges til at bestemme urin mikrobiel co-metabolitter samt at opnå en metaboliske profil af flydende prøver (dvs. urin, plasma, væv uddrag), men de kan ikke anvendes på intakt væv biopsi. GC-MS er blevet anvendt med succes til målrettede analyser af stabile flygtige fedtsyrer ^23. Denne teknik kræver en derivatisering skridt som indfører bias, der skal overvejes nøje under dataanalysen ^24. LC-MS kan være særdeles nyttigt at forbedre påvisningen af mikrobielle co-metabolitter i målrettede profilering ^25. Selvomikke-målrettede LC-MS metabolisk profilering væsentligt forbedrer påvisning følsomhed af en lav koncentration metabolitter, kan identifikationen være svært og en lang række af påviste metabolitter kan forblive ikke-tildelte ^26. Derfor har de fleste af de ikke-målrettede metabonomic undersøgelser er blevet udført ved hjælp af en-dimensionelle ¹ H NMR-baserede platforme. En interessant diskussion af de forskellige analysemetoder til rådighed for metabolisk profilering formål er for nylig blevet offentliggjort af Ryan et al. ^27.

Levermetabolisme blev vurderet ved ikke destruktive ¹ H HR MAS NMR spektroskopi. Denne metode blev valgt, fordi det ikke nødvendiggør en udvindings-skridt, der ødelægger væv og resulterer i oxidation af meget reaktive forbindelser såsom glutathion. ¹ H NMR-baseret metabolisk profilering præsenterer også den fordel, at tilbyde en ikke-målrettede metaboliske profil af biopsi. Det giver således mulighed for observation af en lang rækkeaf metabolitter, der dækker energiske, aminosyre, nukleotid, methylamin og oxidativ stress relaterede veje. Den eneste begrænsning er den detektionsgrænse, som varierer efter en stoffets molekylære struktur. Faktisk er detektionsgrænsen bestemmes af den kemiske (dvs. metabolit) koncentration så vel som antallet af protoner giver resonans peak og deres kemiske miljø. Identifikation af metabolit resonanser kan også være svært baseret på ¹ H HR MAS NMR spektre alene, og det er derfor rådes til at udføre nogle ekstra 2D NMR eksperimenter for at bekræfte opgaver (dvs. J-løst, COSY, TOCSY, HSQC, HMBC eksperimenter ^{28-30) 31,32.} Denne ¹ H HR MAS NMR teknik er almindeligt anvendt til metabonomic undersøgelser, i hvilket tilfælde brug af multivariat statistik (også kaldet mønstergenkendelse metoder) er nødvendigt ^33. Den ¹ H NMR-baseret metabolisk profilering metoder, der beskrives i denne protokol er blevet grundigt anvendt til forskellige biologiske forhold og er ikke begrænset til analysen af urin og leverprøver ^34-36. General prøveforberedelse protokoller for NMR-baseret metabonomics er blevet gennemgået af Beckonert et al. ^18,37.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table of specific reagents and equipment:
2.5 mm microtube	New Era	NE-H5/2.5-V-Br
1.7 mm capillary tube	Sigma-Aldrich	NORS175001
Capillary adapter	New Era	NE-325-5/1.7
Extraction rod	New Era	NE-341-5
HR-MAS rotor BL4 with 50 μL spherical Teflon spacer kit	Bruker Corporation	HZ07213
Tool kit for 50 μL inserts	Bruker Corporation	B2950
Advance III 600 MHz NMR	Bruker Corporation
1H HR MAS NMR solid probe	Bruker Corporation
Deuterium oxide 99.9 %	Sigma-Aldrich	530867-1L
3-(trimethylsilyl)propionic acid-d4 (TSP)	Sigma-Aldrich	269913