Оценка изменения Печеночная Метаболический Во Прогрессивная Колонизация зародыш без мыши по ¹ Н-ЯМР-спектроскопии

Summary

Прогрессивная процедура колонизации описывается для дальнейшей оценки его влияния на метаболизм печеночных хоста. Колонизация контролируется, не invasively путем оценки экскреции микробных метаболитов совместного с помощью ЯМР основе метаболических профилей в то время как печеночный метаболизм оценивается Высокое разрешение магического угла Спиннинг (HR MAS) ЯМР профилирования интактных биопсии.

Protocol

1. Колонизация неинфицированных животных и отбора образцов

1. Удалить неинфицированных животных из изоляторов и их размещение в обычной комнате хозяйства в клетках, оборудованных фильтром перед обычных животных, которые будут служить в качестве контроля (рис. 1).
2. Смешайте половину помета (3 дней), взятые из-под контроля обычных клетку с пометом неинфицированных животных. Всегда держите 1 / 3 от обычной грязной мусор каждый раз надо продлевать его, чтобы поддерживать уровень бактерий (держать его по крайней мере в течение 3 дней).
3. Сбор мочи в 1,5 мл микропробирок путем обработки мыши над трубой и помочь мочеиспускания, осторожно массаж кишечника. Snap-немедленно заморозить в жидком азоте. Магазин по крайней мере при -40 ° C до анализа ЯМР. Минимальный объем 20 мкл требуется для приобретения с 5 мм датчик ЯМР, но рекомендуется использовать 30 мкл по улучшению качества метаболической профилирования.
4. Животные должны бэлектронной эвтаназии без использования какой-либо анестезии, чтобы избежать смешанных резонансов ЯМР за счет метаболизма в печени соединений анестетика (например, использовать цервикальным сдвигом с последующей подтверждение смерти от кровопускания)

2. Рекомендации по сбору биопсии печени

1. Не используйте продукт, содержащий алкоголь, чтобы избежать загрязнения. Вымойте инструменты, используя только воду или физиологический раствор.
2. Не перфорации желчного пузыря. В случае утечки желчи, мыть ткани сразу же с водой или физиологическим раствором.
3. Сбор биопсии печени (около 15-50 мг) с левой доли, как показано на рисунке 2. Для воспроизводимых биопсии, собирают последовательно в центре левой доли избегая периферийных районах, где ткань тоньше.
4. Привязка заморозить биопсии в жидком азоте сразу и хранить их при температуре -80 ° C до анализа ЯМР.

3. ЯМР ¹ Н приобретение мочи микрообъеме

Подготовка 0,2 М натрий-фосфатного буфера решение в D2O (99,8%), рН 7,4, содержащем 1 мМ 3 - (триметилсилил) пропионовой кислоты-й ₄ (TSP).

Смешайте 30 мкл мочи с 30 мкл натрий фосфатного буфера.

Передача 50 мкл смешанного раствора в 1,7 мм ЯМР капиллярной трубке (рис. 3 (2)), используя 50 мкл стеклянный шприц оснащен металлической иглы (OD 0,5 мм). Будьте осторожны, чтобы избежать пузырей.

Fit капиллярной адаптера (рис. 3 (3)) в верхней части капиллярной содержащих мочу и поместите его в 2,5 мм ЯМР микропробирок на 5 мм, ЯМР-зонд (рис. 3 (1)). Используйте это сочетание трубы как обычный 5 мм ЯМР-трубки для спектрального приобретения.

Используйте добычи стержня (рис. 3 (4)), чтобы удалить капиллярной трубки от 2,5 мм ЯМР при помощи винтов капиллярной адаптера аккуратно извлеките его.

. 4 ¹ H HR MAS ЯМР ткани печени биопсии: пробоподготовки

1. MAS ротора компоненты и инструментыописано на рисунке 4.
2. Вставьте биопсии (около 15-50 мг) в циркония ротора (рис. 4 (1)) и заполните остальные объем чистой D ₂ O при ЯМР замок. Будьте осторожны, чтобы не делать никаких пузырей, потому что это изменило бы качество последующих прокладок и качество сбора данных.
3. Вставьте 50 мкл Spacer тефлон (рис. 4 (2)) с помощью цилиндрических винта (рис. 4 (5)). Открутите его и калибровки с помощью глубиномера на короткой стороне (рис. 4 (8)). На данном этапе, важно обратить особое внимание на пример, потому что часть ее может просочиться через прокладку отверстие. Если это так, то часть биопсии разрушается, и вес образца больше не надежна. Таким образом, необходимо начать с самого начала подготовки образца.
4. Место нарезаемой резьбы штифта (рис. 4 (3)) и винт аккуратно с помощью отвертки (рис. 4 (6)). Сухой любые остатки воды с кусочком ткани.
5. Место крышкой (рис. 4 (4)) вверхней части ротора и вставить его в роторе пакером (рисунок 4 (6)). Плотно прижмите, пока крышка на месте. Там не должно быть свободного места между ротором и его шапку.
6. Марк половины нижней части ротора использованием черного маркера, чтобы оптического детектирования скорости вращения.
7. Место ротора внутри ЯМР-спектрометра и начинают крутиться на 5 кГц. Приобретать ¹ H ЯМР-спектр использования CPMG последовательности импульсов ¹³ в соответствии с указаниями производителя.
8. Использование α аномерный резонанс глюкозы в 5,22 промилле (дублет) для калибровки спектров ЯМР.
9. Для распаковки ротора, действовать путем удаления крышки использованием колпачок для удаления (рис. 4 (9)). Отвинтите THEAD контактный и удаления тефлоновой Spacer использованием цилиндрических винта. Тщательно промыть с помощью воды и моющего средства.

5. Представитель Результаты

Гут микробной активности можно контролировать с помощью мочевого профилирования обмена веществ. Большое количество мочи микробныхсовместно метаболитов идентифицировать по ¹ Н-ЯМР были описаны в литературе ^7,14-17. Эти микробные совместно метаболиты особенно полезны для контроля процесса колонизации, поскольку они обеспечивают быстрый и неинвазивный способ оценить, когда вновь созданные экосистемы является устойчивой. Рисунок 5A наглядно иллюстрирует появление кишки микробных метаболитов со-за колонизации процесса. Эта цифра показывает, мочевого профиля метаболических получены по методике, описанной в шаге 2 для животных колонизировали 20 дней с помощью процедуры, описанной в шаге 1. Это животное не выделяют какой-либо indoxyl сульфат и очень мало количество phenylacetylglycine (PAG) и п-крезола сульфата в зародышевой свободном состоянии (день 0-синий). Как колонизация прогрессирует, эти 3 маркеров белкового обмена на кишечник микрофлоры значительно увеличить, чтобы достичь равновесия в день 20 (красный). Это особенно удобно для контроля за группой животных, как показано на рисунке 5B использованием PAGрезонанса. Эта диаграмма была получена за счет интеграции площадь под резонансов выделены серым цветом на рисунке 5А (δ 7.40-7.43), соответствующие конкретным резонанса (триплет) от PAG для группы из 7 животных.

¹ Н высокого разрешения магическим углом Спиннинг (HR MAS) ЯМР спектроскопии неразрушающего техника, которая позволяет быстро и воспроизводимые приобретения метаболические профили любого вида биопсии ^18. В этом протоколе, мы использовали этот мощный метод для получения профиля печеночной метаболических от 2 до мышей (синий цвет) и после (красный) колонизации (рис. 6). Эта цифра хорошо иллюстрирует информацию, которая может быть получена из MAS ЯМР основе метаболического профиля. Многочисленные аминокислот, а также метаболиты выводятся из энергетического обмена, такие как глюкоза, гликоген, лактат, триглицериды, (D)-3-оксибутират и nicotinurate могут быть визуализированы. Эти профили также содержат информацию, имеющую отношение к окислительному стрессу (например, аскорбиноваяСид, глутатион), нуклеотидных обмена веществ (например, инозин, уридина) и метиламина обмена веществ (например, холин, триметиламин-N-оксид). В этом примере, это очень ясно, что стерильных мышей почти не отображает гликогена и очень небольшое количество глюкозы и триглицеридов, как была ранее опубликована ^7.

Рисунок 1. Обзор колонизации протокола. Стерильных и обычных животных размещены в клетках оборудованы боковыми фильтры с другом и их помета обмениваются, чтобы прогрессивные колонизации от обычной микрофлоры кишечника (1). Гут микробной активности контролируется с помощью ЯМР ¹ Н основе метаболического профиля (2-3). Метаболизма в печени оценивается по ¹ H ЯМР MAS HR основе метаболического профиля (4-5).

Рисунок 2. Мышь житьГ анатомии. Печень отображаются такие как плоская сторона лица органа таблице. Для воспроизводимых биопсии, рекомендуется, чтобы всегда брать образцы от центра левой доли, как показано штриховой прямоугольник.

Рисунок 3 1.7 мм ЯМР капиллярной комплект для работы с микрообъемах ключ:.. 1: 2,5 мм ЯМР микропробирок, 2: 1,7 мм ЯМР капиллярная трубка, 3: Капиллярное адаптер, 4: Извлечение стержня.

. Рисунок 4 MAS ротора оборудования Основные: 1.: MAS ротора, 2: 50 мкл Spacer тефлон, 3: THEAD контактный, 4: кепка, 5: цилиндрический винт, 6: отвертки, 7: ротор упаковщик, 8: глубина колеи.

Рисунок 5. Эволюция мочевого профили метаболических во colonization.

1. Увеличить на ароматические области спектра между 6.8-7.8 промилле, где микробное совместно метаболиты могут быть визуализированы. ¹ H ЯМР спектры были получены из одного человека в день 0 (синий), 4 (зеленый), 15 (оранжевый) и 20 (красный) после колонизации. Серой зоне соответствует область, которая была интегрирована, чтобы сделать диаграмму B. Основные: 1-MeHistamine: 1-methylhistamine; Indoxyl-S: Indoxyl сульфата Его: Гистидин, п-крезола-S: п-крезола сульфата PAG : Phenylacetylglycine.
2. Средняя концентрация PAG во время колонизации (п = 7). Стьюдента-тест был использован для сравнения разницы в PAG концентрации на различных временных точках:: р <0,05 по сравнению с днем ​​0, б: р <0,01 по сравнению с 10-й день.

Рисунок 6. Типичные 600 МГц ¹ Н HR MAS ЯМР биопсии печени производным от неинфицированных (синий) и экс-неинфицированных (рег) мышей. Жирный протоны несут ответственность за триглицеридов резонанс Key:. 3-HB: 3-оксибутирата, GSH: восстановленный глутатион, ТГ: триглицериды, ТМАО: триметиламин-N-оксид.

Discussion

В этом протоколе, мы описали прогрессивные процедуры колонизации в открытую среду для дальнейшего изучения воздействия микрофлоры кишечника на печеночный метаболизм оценивается ¹ H HR MAS ЯМР профилирования интактных биопсии. Различные методы колонизации были описаны в литературе. Наиболее распространенные методы, чтобы колонизировать животных с определенной микрофлоры являются устные зонд или загрязненной питьевой воды, ^19,20. Фекальные прививки также могут быть использованы, как описано выше ^21. Колонизация метод, представленный здесь является производным от "нормализации" метод неинфицированных животных описывается Koopman JP и соавт. В 1986 году ^22. В этой публикации, авторы поместили жизни обычных животных в изолятор среди неинфицированных животных. Тем не менее, это не всегда возможно держать животных в изоляторы, особенно если им нужно манипулировать во время колонизации (это особенно трудно, если образец Коллеction проектов обязательна гиперссылка). Таким образом, альтернативная к дому экс-неинфицированных животных в обычной открытой среде в присутствии помет загрязненной обычных животных, которые будут использованы в качестве контроля. Таким образом, животные манипуляции с целью колонизации минимальна, и это приводит к снижению напряжения по сравнению с устной желудочный зонд. Этот метод также позволяет прогрессивных колонизации кишечника, которая ближе к естественному процессу колонизации и предлагает однородной колонизацию животных обмен одной клетке как показывает DGGE (денатурирующих электрофореза гель градиента) оценка микробной ДНК профилей (доступно в качестве дополнительного материала в Мороз и соавт. ^7).

Мониторинг процесса колонизации мочевых профилирования метаболических это неинвазивный, простой, быстрый и эффективный способ определить, когда микробная активность становится стабильной. Как не надо управлять животными каждый день для таких целей, как показано на рисунке 5B, уровень напряжения поддерживается насвоего минимума. Примечательно отметить, что даже если колонизация инициируется помет загрязненной обычных контрольных животных, необходимо сохранить равное количество тех, контрольными животными, которые будут позволяют оценить неоднозначные последствия стресса и старения на печеночный метаболизм. Другие методы, основанные на масс-спектрометрия (MS), такие как GC-MS (газовой хроматографии) или LC-MS (жидкостной хроматографии) также может быть использована для определения мочевой микробных метаболитов совместно, а также получить метаболический профиль жидких образцов (то есть мочи, плазмы, тканей экстракты), но они не могут быть применены на неповрежденной ткани биопсии. ГХ-МС успешно применяется для целенаправленного анализа стабильных летучих жирных кислот ^23. Эта техника требует производных шаг, который вводит предубеждения, которые должны быть тщательно рассмотрены в ходе анализа данных ^24. LC-MS может быть особенно полезно для улучшения обнаружения микробного совместно метаболитов в целевых профилирование ^25. Хотянецелевое LC-MS метаболических профилей существенно улучшает чувствительность обнаружения низких концентраций метаболитов, идентификации может быть трудным и большое количество обнаруженных метаболитов может оставаться неназначенный ^26. Таким образом, большинство нецелевое metabonomic исследования были выполнены при помощи одномерной ЯМР ¹ Н-разрядных платформах. Интересное обсуждение различных аналитических методов, доступных для метаболических целей профилирования был недавно опубликован Райан и соавт. ^27.

Метаболизма в печени оценивали по неразрушающего ¹ H HR MAS ЯМР-спектроскопии. Этот метод был выбран потому, что не требует извлечения шаг, который разрушает ткани и приводит к окислению высокой реакционной способностью соединений, таких как глутатион. ЯМР ¹ Н основе метаболических профилей также представлены преимущества предлагает нецелевой метаболического профиля биопсии. Таким образом, она позволяет наблюдать большой диапазонметаболитов покрытие энергичный, аминокислоты, нуклеотид, метиламина и окислительного стресса, связанного путей. Единственным ограничением является предел обнаружения которых варьируется в зависимости от молекулярной структуры соединений в. Действительно, предел обнаружения определяется химическим (т.е. метаболит) концентрации, а также число протонов дает резонансного пика и их химической среды. Определение метаболитов резонансов также может быть трудно на основе ¹ H HR MAS ЯМР в покое и он, таким образом, рекомендуется выполнять некоторые дополнительные 2D ЯМР экспериментов для подтверждения назначения (т.е. J-решена, COSY, TOCSY, HSQC, HMBC экспериментов ^{28-30) 31,32.} Это ¹ H HR MAS ЯМР техника обычно используется для metabonomic исследований, и в этом случае использование многомерного статистического анализа (также называемые методами распознавания образов) необходимо ^{33. 1} H ЯМР основе метаболических профилирования методов, описанных в этом протоколе были широко применяется в различных биологических условий и не ограничиваются анализом мочи и печеночных проб ^34-36. Генеральный пробоподготовки протоколов для ЯМР основан metabonomics были рассмотрены Beckonert и др.. ^18,37.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table of specific reagents and equipment:
2.5 mm microtube	New Era	NE-H5/2.5-V-Br
1.7 mm capillary tube	Sigma-Aldrich	NORS175001
Capillary adapter	New Era	NE-325-5/1.7
Extraction rod	New Era	NE-341-5
HR-MAS rotor BL4 with 50 μL spherical Teflon spacer kit	Bruker Corporation	HZ07213
Tool kit for 50 μL inserts	Bruker Corporation	B2950
Advance III 600 MHz NMR	Bruker Corporation
1H HR MAS NMR solid probe	Bruker Corporation
Deuterium oxide 99.9 %	Sigma-Aldrich	530867-1L
3-(trimethylsilyl)propionic acid-d4 (TSP)	Sigma-Aldrich	269913