Summary
Infektion von Mäusen mit einem Adenovirus, welches das wesentliche humane Autoantigen Cytochrom P450 2D6 (hCYP2D6) durch Seren von Patienten mit Typ-2-Autoimmun-Hepatitis führt zu einer persistierenden Form der Autoimmun-vermittelten Lebererkrankung, die durch umfangreiche Hepatitis, Fibrose und Erzeugung eines CYP2D6 gekennzeichnet anerkannt -spezifische Immunantwort.
Abstract
Autoimmun-Hepatitis ist eine seltene, aber lebensbedrohliche Autoimmunerkrankung der Leber unbekannter Ätiologie 1,2. In der Vergangenheit viele Versuche unternommen worden, es, ein Tiermodell, die die Eigenschaften der humanen Erkrankung 3-5 spiegelt zu erzeugen. Allerdings in verschiedenen Modellen die Induktion der Erkrankung war sehr komplex und oft nur vorübergehend war, Hepatitis 3-5. Deshalb haben wir einen einfachen Maus-Modell, das die wesentlichen menschlichen Autoantigen verwendet bei Typ-2 Autoimmunhepatitis (AIH-2), nämlich hCYP2D6, als Auslöser 6 entwickelt. Typ-1-Leber-Niere-Mikrosomen-Antikörper (LKM-1) Antikörper, die hCYP2D6 sind das Markenzeichen der AIH-2 7,8. Lieferung von hCYP2D6 in Wildtyp FVB oder C57BL / 6 Mäusen wurde von einem Adenovirus Konstrukt (Ad-2D6), die einer direkten Lieferung des auslösenden Antigens an der Leber sorgt. Somit erzeugt die daraus resultierende lokale Entzündung ein fruchtbares Feld 9 für die spätere Entwicklung von Autoimmunität. A combination von intravenöser und intraperitonealer Injektion von Ad-2D6 ist der effektivste Weg, um eine lang anhaltende autoimmunen Schädigungen der Leber (Abschnitt 1) zu induzieren. Hier bieten wir Ihnen ein ausführliches Protokoll, wie autoimmunen Lebererkrankungen wird in der CYP2D6-Modell induziert und wie die verschiedenen Aspekte von Leberschäden beurteilt werden kann. Zunächst werden die Serumspiegel von Markierungen, die Hepatozyten-Zerstörung, wie Aminotransferasen, sowie die Titer von Antikörpern durch hCYP2D6 Blutentnahme retroorbitaly (Abschnitt 2) bestimmt. Zweitens wird die hCYP2D6-spezifischen T-Zell-Antwort durch das Sammeln von Lymphozyten aus der Milz und der Leber dadurch gekennzeichnet. Um reines Leber-Lymphozyten zu erhalten, werden die Lebern von PBS über die Pfortader (Abschnitt 3), in Kollagen verdaut und gereinigt über einen Percoll-Gradienten (Abschnitt 4) perfundiert. Die Häufigkeit der hCYP2D6-spezifischen T-Zellen wird durch Stimulation mit hCYP2D6 Peptide und Identifizierung von IFN-produzierenden Zellen mittels Durchflusszytometrie (Abschnitt 5) analysiert. Drittenszelluläre Infiltration und Fibrose wird durch Immunhistochemie von Leber-Abschnitte (Abschnitt 6) bestimmt. Eine solche Analyse Regime muss zu mehreren Zeitpunkten nach Beginn der Erkrankung durchgeführt werden, um die chronische Natur des Modells zu beweisen. Die Größe der Immunantwort durch die Frequenz und Aktivität von hCYP2D6-spezifischen T-und / oder B-Zellen und dem Grad der Leberschädigung und Fibrose dadurch gekennzeichnet haben, um für eine spätere Auswertung der möglichen Behandlungen zu verhindern, verzögern oder aufheben Autodestruktiven beurteilt werden Verfahren nach der Leber.
Protocol
1. Die intravenöse Injektion von Ad-2D6 in ophthalmologische Sinus
- Unter sterilen Bedingungen, verdünnen Sie die Ad-2D6-Virus-Stammlösung zu einer Konzentration von 5 x 10 9 pfu / ml in RPMI und halten Sie die Ad-2D6 Virus-Lösung auf Eis. Die Injektion von zwei Dosen von 5 x 10 8 pfu (intravenös und intraperitoneal) hat sich in der zuverlässigste Ergebnis der autoimmunen Hepatitis in Mäusen des FVB Belastung führen.
- Anesthetize-Maus mit 4% Isofluran in einer Narkose Kammer. Drücken Sie das Hinterbein, um sicherzustellen, das Tier betäubt.
- Halten Sie die Maus von der Rückseite des Halses und ziehen Sie die lose Haut des Kopfes mit Daumen und Mittelfinger. Gefällt Ihnen diese, ragt das Auge leicht durch den Zug auf die Haut benachbart dem Auge.
- Stecken Sie die Nadel senkrecht in den inneren Augenwinkel (Kreuzung der Augenlider am nächsten an der Nase des Tieres) und injizieren Sie langsam 100 ul Ad-2D6-Virus-Lösung. Es ist wichtig, nicht zu viel Druck ausüben, umVermeidung von Schäden der Gefäße und der Luftröhre.
- Langsam ziehen Sie die Nadel um das Auslaufen zu vermeiden und Schließen der Augenlider.
- Injection hat gut funktioniert, wenn der Virus-Lösung nicht herauslecken Trog die Nase und das Auge gleitet zurück in seine Ausgangsposition.
- Unmittelbar nach der intravenösen Injektion, führen Sie eine Standard-intraperitoneale Injektion des zweiten 100 ul der Ad-2D6-Virus-Lösung.
Alternativ kann die intravenöse Injektion über die Schwanzvene ausgeführt werden. Allerdings ist Injektion über die ophthalmischen Sinus wesentlich leichter durchzuführen und minimiert den Verlust von Virus-Lösung. Es hat sich gezeigt, dass diese beiden Techniken, mit denen auswechselbar und dass beide Routen sind ebenso wirksame 10 unterzogen.
Infizierte Mäuse sind für unerwünschte Wirkungen und offensichtliche Anzeichen von Leiden und Schmerzen, wie Appetitlosigkeit, Gewichtsverlust, Verlust der Mobilität, der Nichteinhaltung von Bräutigam, raue Fell überwacht, gebeugtAussehen, als auch Lecken, Beißen, Kratzen, Schütteln oder einen bestimmten Bereich (dh der Injektionsstelle). Obwohl die Mäuse eine massive Schädigung der Leber in der CYP2D6-Modell zeigt, scheinen die Mäuse gesund und zeigen keine Anzeichen von Leiden, Schmerzen oder Stress. Dennoch sind Indikatoren für die schweren Leberversagen, wie Serum-Aminotransferase-Werte auf einer regelmäßigen Basis ermittelt oder sind Teil der durchgeführten Experimente. Serum-Aminotransferase-Spiegel von> 1000 U / l sollte nur als direkte Folge der Virusinfektion auftreten, aber nicht chronisch. Wenn die Serum-Aminotransferase-Spiegel dauerhaft sind oberhalb von 1000 U / l (Grenzwert Strenge) die Mäuse getötet.
2. Maus Auge Blutungen
- Anesthetize-Maus mit 4% Isofluran in einer Narkose Kammer. Drücken Sie das Hinterbein, um sicherzustellen, das Tier betäubt.
- Halten Sie die Maus von der Rückseite des Halses und ziehen Sie die lose Haut des Kopfes mit Daumen und Mittelfinger. Wie diese, ragt das Auge leicht umdie Traktion auf die Haut benachbart dem Auge.
- Setzen Sie die Spitze der Kapillare an der unteren oder inneren Augenwinkel und sanft, aber bestimmt rutschte neben den Augapfel in der Augenheilkunde venösen Sinus. Die venösen Kapillaren Bruch und die daraus resultierende Blutung füllt die Augenhöhle.
- Leicht ziehen Sie die Kapillare, die Spitze zu befreien, so dass der angesammelte Blut in das Rohr gezogen wird.
- Wenn genügend Blut gesammelt wird, wird das Rohr zurückgezogen und die Augenlider geschlossen. Blutung stoppt unmittelbar nach der Auslagerung des Rohres und die Wiederherstellung der normalen Augendruck Druck auf den venösen komplex.
- Blut in der Kapillare Röhre wird unter einen Microtainer Röhrchen überführt und inkubiert für 30 min auf Eis.
- Die Microtainer Rohr wird bei 7500 × g für 2 min bei 4 ° C zentrifugiert
- Der Überstand entspricht dem Serum, das in ein frisches Röhrchen übertragen wird und bei -80 ° C
- Serum kann verwendet werden, um Antikörper-Titer durch ELISA zu bestimmen. Indicatoren von Leberschäden, wie die Serumspiegel der Leberenzyme Alanin-Aminotransferase (ALT / GPT) und Aspartat-Aminotransferase (AST / GOT) beurteilt werden kann mit Hilfe der Teststreifen nach der Firma Roche Diagnostics (Mannheim, Deutschland) und eine Reflotron Plus-Analysator ( Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland).
Alternativ kann Blutentnahme über die Schwanzvene oder über die temporalis superficialis Ader 11 getan werden.
3. Maus Leberperfusion
Anmerkung: Dieser Schritt ist wichtig, um eine Kontamination der isolierten Leber-Lymphozyten durch Blut-Lymphozyten zu vermeiden
- Sterbehilfe mit der Maus durch eine tödliche Dosen von CO 2 durch Genickbruch folgte.
- Montieren Sie das Tier mit auf dem Rücken auf dem Styropor-Brett. Verwenden Sie 23 G Nadeln an Extremitäten Pin.
- Befeuchten und desinfizieren Sie die Maus mit 70% EtOH
- Etwa 1 cm entfernt von Hinterbeinen, einen Einschnitt durchdie Haut und die Muskulatur. Schneiden Sie auf beiden Seiten des Tieres Aufarbeitung an der Membran.
- Wenn sich die Membran erreicht wird die Haut kann nach hinten geklappt werden.
- Schneiden Sie die Membran weg von den Rippen schneiden Sie dann das Hohlvene.
- Bewegen Sie den Magen und den Darm zur Seite, Freilegung der Pfortader.
- In der Pfortader Einsatz einer 27 G Nadel verbunden zu einem 5 ml-Spritze mit kaltem PBS gefüllt. Lassen Sie das PBS waschen langsam das Blut aus der Leber.
- Präparieren Sie die Leber durch Greifen auf die Blende und Schneiden des Membran vom Körper weg.
- Übertragen Sie die Leber in eine Petrischale und entfernen Sie die Blende, die Gallenblase und alle anderen Gewebe noch auf die Leber verbunden
- Übertragen Sie die Leber zu 10 ml PBS in einem 50 ml Röhrchen auf Eis oder einbetten in OCT-Verbindung.
4. Isolierung von Leber-Lymphozyten
- Bereiten Sie die folgenden Stammlösungen:
- Collagenase IV Lager (100 mg / ml) in PBS. (Machen Sie kleine Portionen und bei -20 ° C).
- DNase Lager (25 mg / ml) in PBS. (Machen Sie kleine Portionen und bei -20 ° C).
- Kollagenase-Puffer: PBS mit 0,2 mg / ml Collagenase IV, 0,02 mg / ml DNase und 5% FCS; für 1 Leber, mischen 9,5 ml eiskaltem PBS, 20 ul Kollagenase IV (100 mg / ml Stammlösung), 8 ul DNase ( 25 mg / ml Stammlösung) und 500 ul hitzeinaktiviertem FCS.
- 35% Percoll; mix 175 ml Percoll, 20 ml 10 x PBS Lager; 305 ml PBS.
- RPMI complete = RPMI mit 10% Hitze-inaktiviertem FCS, 100 μ / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin.
- Übertragen Sie die perfundierten Leber (siehe Abschnitt 3), um 10 ml frisches PBS in einer Petrischale auf Eis und in kleine Stücke schneiden mit einer Schere.
- Transfer in eine Zelle 70 um-Sieb und Squeeze Leber durch Dschunken mit einem Glas Pistill oder einem Stößel aus einer 2-ml-Spritze. Vorsichtig 10 ml kaltem Puffer und Kollagenasedrücken durch Sieb. Sammle Federung und durch Sieb-Filter zwei Mal mehr.
- Übertragen Sie die frische Suspension 50 ml Tube auf Eis. Als nächstes verarbeiten Leber.
- Inkubieren Leberzell-Suspension bei 37 ° C für 60 min, vorsichtig mischen, alle 15 min.
- Zentrifugieren bei 30 × g für 3 min bei 4 ° C
- Überstand in ein frisches Röhrchen mit 5 mm Fluid oberhalb Pellet
- Zentrifuge bei 650 xg für 10 min bei 4 ° C
- Überstand verwerfen, so dass 3 mm über dem Pellet
- Pellet in 20 ml Percoll-Puffer
- Zentrifugieren bei 600 × g für 20 min bei 4 ° C
- Überstand verwerfen und Pellet durch schnippte die Röhre.
- Waschen Sie Pellet 1 x mit PBS.
- Waschen Sie Pellet 1 x mit RPMI komplett
- Pellet in 3 ml RPMI vervollständigen und Zählen von Zellen in einer Verdünnung von 1:10.
- Die Zellen bei ~ 10 7 Zellen / ml in RPMI abzuschließen und Rohr zu Eis. 5. Intrazelluläre Zytokin-Färbung (ICCS)
- Planen Sie Leber-Lymphozyten bei ~ 10 7 Zellen / ml in RPMI komplett wie beschrieben. Tafel 100 ul (10 6 Zellen) / Well in eine flache 96-Well Platte, der nicht Gewebe-Kultur behandelt.
- In 50 ul RPMI komplett mit 2μg/ml Brefeldin A und fügen Sie dann 50 ul RPMI komplett mit 2 pg / ml stimuliert CYP2D6-Peptid (dh die immundominanten CD4-Epitop CYP2D6 41-60 PGLGNLLHVD FQNTPYCFDQ 12 oder das immundominante CD8-Epitop CYP2D6 193-212 RRFEYDDPRF LRLLDLAQEG 12). Durch Pipettieren gründlich mischen.
- Inkubieren Sie für 5 Std. bei 37 ° C (optimale Stimulation der Zeit aber Inkubation über Nacht funktioniert auch).
- Bereiten Sie die folgenden Stammlösungen:
- FACS-Puffer: PBS mit 1% fötalem Kälberserum sErum (FCS).
- Fixierung / Permeabilisierung Puffer: FACS-Puffer mit 0,1% Saponin und 4% Paraformaldehyd
- FACS / Saponin Waschpuffer: FACS-Puffer mit 0,1% Saponin
- FACS / PFA Puffer: FACS-Puffer mit 1% Paraformaldehyd (PFA)
- Übertragen Sie Zellen in V-Mikrotiterplatte (96-well) und Spin bei 460 xg für 3 min bei 4 ° C Entsorgen Sie mittel-und Vortex-Platte
- Fügen Sie 150 ul FACS-Puffer und Zentrifuge bei 460 xg für 3 min bei 4 ° C Entsorgen Sie mittel-und Vortex-Platte. Wiederholen Sie Schritt waschen.
- Blockoberfläche FcR wenn nötig (bei Verwendung von sekundären Antikörpern) mit 1 ug / ml αCD16/32 Cocktail (FcR-Block) in FACS-Puffer für 15 min bei 4 ° C waschen und 2 x mit 150 ul Färbepuffer (460 xg für 2 min bei 4 ° C).
- Stain für Oberflächenmoleküle: dh Anti-CD8a-FITC mAb 10 pg / ml in 50 ul FACS-Puffer für 30 min bei 4 ° C im Dunkeln.
- Geben Sie 100 ul FACSPuffer und Spin bei 460 × g für 3 min bei 4 ° C
- Waschen der Zellen 2 x mit 150 ul FACS-Puffer (460 × g; 3 min; 4 ° C). Vortex Platte.
- Fix / permeabilisieren Zellen mit 100 &mgr; l Fixierung / Permeabilisierung Puffer für 10 min bei RT.
- Spin bei 460 × g für 7 min bei 4 ° C Beachte bitte, dass es wichtig ist, die Zentrifugationszeit bis 7 min erstrecken, da durch die Fixierung / permeabilzation Schritte ändert die Gesamtdichte der Zellen. Vortex Platte.
- 2 x Waschen mit 150 ul FACS / Saponin Waschpuffer (460 xg, 7 min, 4 ° C). Vortex Platte.
- Stain für intrazelluläre Moleküle, dh Anti-IFN-PE mAk 10 pg / ml in 50 ul FACS / Saponin Waschpuffer für 30 min bei 4 ° C
- Geben Sie 100 ul FACS / Saponin Waschpuffer und Spin bei 460 xg für 7 min bei 4 ° C
- Waschen der Zellen 2 x mit 150 ul FACS / Saponin Waschpuffer (460 × g; 7 min; 4 ° C). Vortex Platte.
- Waschen der Zellen 1 x mit FACS-Puffer (460 × g; 7 min; 4 ° C). Vortex Platte. Die Zellen in 200 ul FACS / PFA-Puffer, Transfer in die Rohre, und lagern bei 4 ° C im Dunkeln bis zur Erfassung von Daten mittels Durchflusszytometrie. Wir benutzen normalerweise eine FACSCanto II oder eine FACSCalibur (BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland).
- Ernte Leber, tauchen in Tissue-Tek Oktober in einem Einweg-Basis-Form und quick-freeze auf Trockeneis.
- Cut 7 um Leber Gewebeschnitte mit einem Leica Kryostat bei -17 ° C eingestellt und montieren Sie die Gewebeschnitte auf Superfrost Plus Objektträger. Objektträger bei -20 ° C bis zur weiteren Verwendung.
- Fix Kryoschnitten in vorgekühlten EtOH für 15 min bei -20 ° C Lassen Sie für 10 Minuten trocken.
- Waschen Sie 2 x in destilliertem Wasser für 2 min bei Raumtemperatur (die folgenden Schritte, 6.1.5 - 6.1.13, werden bei Raumtemperatur durchgeführt).
- Färben in Meyers Hämatoxylin-Lösung für8 min.
- Waschen in warmem (30 ° C) Leitungswasser für 10 min. Wechseln Sie das Wasser einige Male.
- Spülen in destilliertem Wasser.
- Spülen in 95% EtOH für 20 sek.
- Gegenfärbung in Eosin G / Y-Lösung für 40 sek.
- Entwässern 2 x in 95% EtOH für 5 min pro Inkubation.
- Dehydrieren 2 x in 100% EtOH für 5 min pro Inkubation.
- Deaktivieren Sie in Xylol 2 x 5 min pro Lichtung.
- Montieren Sie in Roti-Histokitt.
- Ernte-Leber, in Tissue-Tek Oktober einzutauchen. in einem Einweg-Basis-Form und quick-freeze auf Trockeneis.
- Cut 7 um Leber Gewebeschnitte mit einem Leica Kryostat bei -17 ° C eingestellt und montieren Sie die Gewebeschnitte auf Superfrost Plus Objektträger. Objektträger bei -20 ° C bis zur weiteren Verwendung.
- Fix Kryoschnitten in kaltem EtOH für 15 min bei -20 ° C Lassen Sie für 10 Minuten trocken.
- Waschen Sie 2 x in PBS für 2 min bei Raumtemperatur. <li> Inkubation in PBS, enthaltend 0,3% H 2 O 2 und 0,1% Na-Azid für 10 min bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie 2 x in PBS für 2 min bei Raumtemperatur.
- Block mit einem Avidin-Biotin-Blocking-Kit nach den Richtlinien des Herstellers.
- Sperren mit 10% FCS in PBS (FKS / PBS) für 30 min bei Raumtemperatur.
- Der primäre Antikörper ist ein Kaninchen-anti-Maus Kollagen I-Antikörper, 1:200 verdünnt wird in 10% FCS / PBS. Inkubieren Abschnitten mit primärem Antikörper für 2 Stunden bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie Abschnitte 3 x in PBS für 4 min bei Raumtemperatur.
- Verdünnen biotinylierten Anti-Kaninchen-Antikörper bis 1:500 und inkubieren Sie mit den Abschnitten für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie Abschnitte 3 x in PBS für 4 min bei Raumtemperatur.
- Die Farbe Reaktion wird durch sequentielle Inkubation mit Avidin-Peroxidase-Konjugat und Diaminobenzidin-von Wasserstoffperoxid nach den Richtlinien des Herstellers erhaeltlich.
- Gegenfärbung in Meyers Ermatoxylin-Lösung für 5 min, 2 x waschen in PBS für 2 min bei Raumtemperatur und montieren in Aquatex.
5,1 Stimulation:
5.2. Färbung:
6. Immunhistochemie
6.1. H & E-Färbung für die Erfassung der allgemeinen Leber-Pathologie:
6.2. Immunhistochemie für Kollagen I Ablagerung:
7. Repräsentative Ergebnisse
Infektion von Mäusen mit Ad-2D6 induzierte zwei unterschiedliche Stadien der Leberschädigung. In den ersten Tagen nach der Infektion, verursacht Virusinfektion der Leber einen akuten Anstieg des Serum-Aminotransferase-Spiegel, ein Indikator für Hepatozyten Tod 6. Diese erste, akute Stadium tritt unabhängig von der Expression von hCYP2D6 und kann auch nach der Infektion mit einem leeren Virus Control (Ad-Control) oder einem Virus, das grün fluoreszierendes Protein (Ad-GFP) beobachtet werden. Im Gegensatz dazu ist die zweite Stufe Autoimmun-vermittelte und abhängig von der Expression des stimulierende Molekül hCYP2D6. Diese Autoimmun-Bühne tritt innerhalb von 2-4 Wochen nach der Infektion und dauert mehrere Monate 6.
Die folgenden Features sind charakteristisch für die anhaltende Entwicklung von Autoimmun-Hepatitis nach Ad-2D6-Infektion von Wildtyp FVB oder C57BL / 6 Mäusen in der CYP2D6-Modell: Erstens zeigt die Leber eine aberrant geändert Morphologie. Vor allem die Leberlappen verschmolzen sind, erscheinen hyperplastischen Knötchen verstreut über die gesamte Leber und ein massiver Kapselfibrose ist sichtbar (Abbildung 2).
Abbildung 2. Lebermorphologie. Typische Ad-2D6-induzierten Leberschäden wie in Woche 4 nach der Infektion nachgewiesen. Beachte bitte, dass die einzelnen Leberlappen fusioniert sind (Pfeilspitzen). Hyperplastischen Knötchen über die gesamte Leber (Pfeile) verstreut. Infektion mit einem Kontroll-Adenovirus nicht exprimieren hCYP2D6 hat keine Wirkung auf die Leber Morphologie.
Zweitens, umfassende und anhaltende zelluläre Infiltrationen erscheinen in den peri-Portal und Regionen Parenchym der Leber von Ad-2D6-infizierten, aber nicht Ad-Control-infizierten Mäusen (Abbildung 3A). Fibrose entwickelt sich überwiegend im subkapsulären Region mit einigen hervorstehenden Kollagenbündel in das Parenchym (Abb. 3b).
Abbildung 3. Leberhistologie A:. H & E Färbung von Lebergewebe Abschnitt des FVB Mäuse entweder mit Ad-Control oder Ad-2D6 in Woche 4 nach der Infektion infiziert. Beachten Sie, dass signifikante Infiltration von mononukleären Zellen nur im Ad-2D6 infizierten Mäusen sind (einzelne Pfeile). Dreifach-Pfeile zeigen größere zelluläre Infiltrationen im Leberparenchym Brückenschlag zwischen benachbarten portale Fibrose. B: Immunhistochemische Darstellung von Leberfibrose in Woche 4 nach der Infektion mit Ad-2D6 oder Ad-Kontrolle. Die Leber Abschnitten wurden für Kollagen mit einem anti-Kollagen I-Antikörper gefärbt. Beachten Sie die vielfachen Schicht aus Kollagen Vorschrift im Sinne von der Leber Kapsel (Dreifach-Pfeile) mit einigen Bündeln vorstehenden in das Parenchym (einfache Pfeile) und das Vorhandensein von großen Clustern von infiltrierenden Zellen (Pfeilspitzen). Zwei repräsentative Leber Abschnitte sind für jede Bedingung angezeigt. Bars Größe: 100 um.
Ein drittes Merkmal ist die Erzeugung von hohe Titer von Anti-CYP2D6 Antikörper, die eine ähnliche Epitop-Spezifität für die menschliche LKM-1-Antikörper 6,13 haben. Zuletzt, hCYP2D6-spezifischen CD4-und CD8 T-Zellen werden in erster Linie, dass die Heimat der Leber erzeugt. Solche hCYP2D6-spezifische T-Zellen kann durch Stimulation mit immunodomi nachgewiesen werdennant hCYP2D6 Peptide und anschließende Messung der IFN Expression durch eine intrazelluläre Zytokin-Färbung (ICCS) (Abbildung 4). hCYP2D6-spezifischen CD8 T-Zellen töten Ad-2D6-infizierten Zielzellen in vivo 12.
Abbildung 4. hCYP2D6-spezifische T-Zellen. Die durchflusszytometrische Analyse der hCYP2D6-spezifische T-Zellen. Leber-Lymphozyten wurden in Woche 4 nach Ad-2D6-Infektion isoliert worden und wurden entweder mit den immundominanten CD4-oder CD8-Epitop hCYP2D6 über Nacht stimuliert. Erzeugung von IFN &ggr; wurde durch intrazelluläre Zytokinfärbung erkannt und mittels Durchflusszytometrie analysiert unter Verwendung eines FACS Canto II (BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland). Der Prozentsatz der hCYP2D6-spezifischen CD4 und CD8-Zellen wird nicht mitgeteilt.
Discussion
In früheren Studien wurde experimentellen Hepatitis oft berichtet, dass sie nur vorübergehend und viele aktuelle Modelle für autoimmunen Lebererkrankungen auf einem ziemlich komplexe Erkrankung Induktion Protokolle (für Übersichten siehe 3,5) ab. Verwenden Sie z. B. mehrere Modelle transgenen Mäusen, die spezifische Ziel-Antigene und adoptiv übertragen Ziel-Antigen-spezifische, meist TcR-transgenen, T-Zellen 14,15. Oft eine zusätzliche Infektion mit livertropic Viren, Bakterien oder Parasiten ist nötig, Krankheit 16-18 zu induzieren. Alternativ wird die DNA-Impfung mit Plasmiden, die für die Ziel-Antigene, einschließlich CYP2D6 19, verwendet werden, um Hepatitis zu induzieren. Es wird jedoch ein zusätzliche Impfung mit Plasmiden, die für pro-inflammatorische Zytokine, wie IL-12, erforderlich 20. Leider mit einigen wenigen Ausnahmen 15,20 Hepatitis ist nur vorübergehend.
Die CYP2D6-Modell 6,21 verwendet eine einfache Methode to induzieren Autoimmun-Hepatitis, indem Sie einfach Infektion von Mäusen mit einem Adenovirus, hCYP2D6, dem wichtigsten Autoantigen in AIH-2 7,8. Lieferung von CYP2D6 durch einen Adenovirus Konstrukt garantiert sowohl eine direkte Ausrichtung der Leber sowie eine lokale Entzündung, die den Abbau von Toleranz fördert. Es ist jedoch wichtig darauf hinzuweisen, dass sowohl der Virustiter sowie die Art der Verabreichung von entscheidender Bedeutung für dieses Modell an ist. Auf der einen Seite, ist Ad-2D6 eine Replikation defizienten Virus, damit, eine ausreichend hohe Titer von Virus benötigt, um eine kritische Menge an Antigen in der Leber zu erzeugen. Auf der anderen Seite könnte eine zu hohe Titer in einem fatalen akutem Leberversagen führen. Darüber hinaus hat es sich bereits erwiesen, dass Infektion von Mäusen durch hohe Titer von Adenovirus auf eine funktioneller Erschöpfung der Immunantwort 22 führt demonstriert. In unserem Modell haben wir eine Kombination von intravenöser und intraperitonealer Infektion, um sowohl die chronische zelluläre Infiltration sowie ext erhaltenensive Fibrose. Wir haben beobachtet, dass die intravenöse Infektion allein noch verursacht massive zelluläre Infiltration, aber keine Fibrose der subkapsulären Region, was darauf hinweist, dass die peritoneale Entzündung aufgrund der intraperitonealen Injektion könnte in der kontinuierlichen subkapsulären Ansammlung von Kollagen (Hintermann & Christen, Manuskript in Vorbereitung) beteiligt sein. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die beobachtete Leberfibrose Antigen-spezifische ist, da wir nicht erkennen Aktivierung von hepatischen Sternzellen und Ablagerung von Kollagen nach der Infektion mit dem gleichen Virus-Titer von Ad-GFP-oder Ad-Control 23.
Die CYP2D6-Modell spiegelt viele Aspekte des menschlichen AIH 1,2, wie chronische Hepatitis durch anhaltende zelluläre Infiltration und Leberfibrose 6 gekennzeichnet. Darüber hinaus zeigt das Vorhandensein von hohem Titer Anti-CYP2D6 Antikörper mit ähnlichen Epitop-Spezifität und Verbreitung 13 bis LKM-1-Antikörper bei der AIH-2-Patienten fanden die Presence einer gemeinsamen chronische Autoimmun-Reaktivität. CYP2D6 ist die wichtigste Antigen in AIH-2, aber es wird nicht von Patienten mit der häufigeren Typ 1 AIH diagnostiziert anerkannt. Darüber hinaus Patienten mit anderen Lebererkrankungen mit autoimmunen Ätiologie, wie der primär biliären Zirrhose (PBC) oder primär sklerosierende Cholangitis (PSC), erzeugen Markenzeichen Autoantikörper mit Spezifität für verschiedene Autoantigene Leber und ihre Lebern zeigen verschiedene pathologische Merkmale Zentrierung auf kleine (PBC ) oder große (PSC) Gallengänge. Dennoch bietet die CYP2D6-Modelle die Möglichkeit, immunpathogenen Mechanismen der chronischen hepatischen entzündlichen Prozessen wie auftretenden autoimmunen Lebererkrankungen, zu wichtigen Akteuren, die die autoimmune Zerstörung der Hepatozyten zu fahren und eine mögliche therapeutische Interventionen zu bewerten, um die Krankheit zu heilen identifizieren beteiligt zu analysieren.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird von der Goethe-Universität Frankfurt und einem Zuschuss von der Deutschen Forschungsgemeinschaft unterstützt, um UC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 23G needle | BD Biosciences | 300800 | |
| 27½G needle | VWR international | 612-0151 | |
| 30½ G needle | BD Biosciences | 304000 | |
| Alanine aminotransferase test strips (GPT/ALT) | Roche Group | 10 745 138 202 | |
| Aspartate aminotransferase test strips (GOT/AST) | Roche Group | 10 745 120 202 | |
| Anaesthesia Unit Univentor 400 |  AgnTho’s |
||
| Base molds, disposable 37x24x10 mm | VWR international | 720-0208 | |
| Cell strainer 70mm | VWR international | 734-0003 | |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM1850 UV | |
| Heparinized capillary tubes | Fisher Scientific | 3123987 | |
| Microscope slides Superfrost Plus | Menzel-Glaser | J1800AMNZ | |
| Microtainer SST tubes | BD Biosciences | 365951 | |
| Microtiter plates, V-bottom | VWR international | 391-1924 | |
| Reflotron Plus | Roche Group | Determiniation of serum AST / ALT | |
| Rabbit anti-mouse anti-Collagen type I IgG, | Chemicon International | AB765P | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | VC-BA-1000-MC15 | |
| FITC-conjugated anti mouse CD8a antibody | SouthernBiotech | 1550-02 | |
| PE-conjugated anti mouse IFNγ antibody | BD Biosciences | 554412 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD16/CD32 antibody (FcR block) | BD Biosciences | 553141 | |
| Aquatex | VWR international | 1.08562.0050 | |
| Avidin/Biotin Blocking kit | Vector Laboratories | VC-SP-2001-KI01 | |
| Brefeldin A | Sigma-Aldrich | B6542 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138-100MG | |
| DAB substrate kit 3’3’diaminobenzidine | Vector Laboratories | VC-SK-4100-KI01 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Elite ABC Reagent | Vector Laboratories | VC-PK-7100-L050 | |
| Eosin G/Y solution | Carl Roth Gmbh | X883.1 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | |
| Isofluran | Forene | B506 | |
| Meyer’s Hematoxylin solution | AppliChem | A4840,1000 | |
| OCT Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| PBS-buffered formaldehyde 10% | Carl Roth Gmbh | A146.3 | |
| Percoll | Amersham | 17-0891-01 | |
| Roti-Histokit | Carl Roth Gmbh | 6638.1 | |
| RPMI | Invitrogen | 61870 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S7900 |
References
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- Czaja, A. J., Manns, M. P. Advances in the Diagnosis, Pathogenesis and Management of Autoimmune Hepatitis. Gastroenterology. 4, 429-443 (2010).
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