Summary
Infektion af mus med en Adenovirus udtrykker den vigtigste humane autoantigenet cytochrom P450 2D6 (hCYP2D6) anerkendt af sera af patienter, der lider type 2 autoimmun hepatitis resultater i en vedvarende form af autoimmun-medieret leversygdom kendetegnet af omfattende hepatitis, fibrose og generering af en CYP2D6 -specifikt immunrespons.
Abstract
Autoimmun hepatitis er en sjælden, men livstruende autoimmun sygdom i leveren af ukendt ætiologi 1,2. I de sidste mange forsøg er blevet gjort til at generere en dyremodel der afspejler de særlige kendetegn ved den humane sygdom 3-5. Men i forskellige modeller induktion af sygdommen var temmelig kompleks og ofte hepatitis var kun forbigående 3-5. Derfor, har vi udviklet en ligetil musemodel der bruger de primære humane autoantigenet i type 2 autoimmun hepatitis (AIH-2), nemlig hCYP2D6, som en udløser 6. Type 1 lever-nyre mikrosomale antistoffer (LKM-1) antistoffer, som genkender hCYP2D6 er kendetegnende for AIH-2 7,8. Levering af hCYP2D6 ind vild-type FVB eller C57BL / 6 mus var ved en Adenovirus konstrukt (Ad-2D6), der sikrer en direkte levering af det udløsende antigenet til leveren. Således efterfølgende lokal inflammation genererer en frugtbar felt 9 for den efterfølgende udvikling af autoimmunitet. A combination af intravenøs og intraperitoneal injektion af Ad-2D6 er den mest effektive vej til at fremkalde en langvarig autoimmun skader på leveren (afsnit 1). Her giver vi en detaljeret protokol om, hvordan autoimmun leversygdom induceres i CYP2D6-modellen, og hvordan de forskellige aspekter af leverskader kan vurderes. Det første er de serumniveauerne af markører indikerer hepatocyttransplantation destruktion, såsom aminotransferaser, såvel som de titere af hCYP2D6 antistoffer bestemmes ved opsamling blod retroorbitaly (afsnit 2). Det andet, er den hCYP2D6-specifik T-celle respons karakteriseret ved opsamling lymfocytter fra milten og leveren. For at opnå rene lever lymfocytter, de lever perfuseres af PBS via portalen vene (afsnit 3), fordøjet i kollagen og renset over en Percoll gradient (afsnit 4). Hyppigheden af hCYP2D6-specifikke T-celler bliver analyseres ved stimulering med hCYP2D6 peptider og identifikation af IFNy-producerende celler ved flowcytometri (afsnit 5). Tredje,cellulær infiltration og fibrose bestemmes ved immunohistokemi af lever sektioner (afsnit 6). En sådan analyse regimen skal udføres på flere gange efter initiering af sygdommen med henblik på at bevise den kroniske karakter af modellen. Størrelsen af den immunrespons kendetegnet ved den hyppighed og aktiviteten af hCYP2D6-specifikke T og / eller B-celler og graden af leveren skaderne og fibrose er nødt til at skal vurderes for en efterfølgende evaluering af mulige behandlinger at forebygge, forsinke eller det ophæver autodestructive proces af leveren.
Protocol
1. Intravenøs injektion af Ad-2D6 til oftalmologiske sinus
- Under sterile betingelser, fortynde den Ad-2D6 virus stamopløsning til en koncentration på 5 x 10 9 pfu / ml i RPMI og holde Ad-2D6 virus løsning på is. Injektion af to doser på 5 x 10 8 pfu (intravenøs og intraperitoneal) har vist sig at resultere i den mest pålidelige udfaldet af autoimmun hepatitis i mus af den FVB stammen.
- Anesthetize mus med 4% isofluran i en anæstesi kammer. Klem bagbenet at sikre, at dyret er bedøvet.
- Hold musen ved nakken og stramme løs hud af hovedet med tommel-og langfinger. Som denne, stikker øjet anelse af trækkraftleverandøren til huden hosliggende til øjet.
- Placer nålen lodret ind i den mediale øjenkrog (krydset af øjenlåg nærmest dyrets næse) og langsomt tilføre 100 ul Ad-2D6 virus løsning. Det er vigtigt ikke at anvende for meget pres, atundgå beskadigelse af de fartøjer og luftrør.
- Langsomt trækker nålen for at undgå spild og lukke øjenlågene.
- Injektion fungeret godt hvis virussen opløsningen ikke lække ud trug næsen og øjet glider tilbage til sin oprindelige position.
- Umiddelbart efter intravenøs injektion, en standard intraperitoneal injektion af den sekunder 100 ul af Ad-2D6 virus-opløsning udføre.
Alternativt, kan den intravenøse injektion blive henrettet via halevenen. Imidlertid, injektion via ophthalmiske sinus er meget lettere at udføre og minimerer tabet af virus opløsning. Det er blevet påvist at disse to teknikker kan anvendes i flæng og at begge ruter er lige effektive 10.
Inficerede mus monitoreres for bivirkninger og tydelige tegn på lidelse og smerte, såsom tab af appetit, vægttab, tab af mobilitet, manglende groom, ru pels, bøjetudseende, såvel som slikning, bide, rive, eller omrystning en bestemt område (dvs. injektionsstedet). Selv om de musene vise en massiv skader på leveren i CYP2D6 modellen, musene synes sundt og viser ingen tegn på lidelse, smerte eller stress. Ikke desto mindre er tegn på alvorlig leversvigt, såsom serum aminotransferaser fastlægges på en regelmæssig basis eller er en del af de udførte eksperimenter. Serum leveraminotransferaseniveauerne niveauer af> 1000 U / l bør kun fremstå som en direkte resultat af viruset infektion, men ikke kronisk. Hvis de serum aminotransferaseniveauer er kronisk over 1000 U / l (sværhedsgrad grænse) musene aflives.
2. Mus øje blødning
- Anesthetize mus med 4% isofluran i en anæstesi kammer. Klem bagbenet at sikre, at dyret er bedøvet.
- Hold musen ved nakken og stramme løs hud af hovedet med tommel-og langfinger. Som denne, stikker øjet lidt vedden trækkraft til huden hosliggende til øjet.
- Placer spidsen af kapillarrøret ved den nedre eller inderste hjørne af øjet og forsigtigt, men fast glides sideløbende øjeæblet for at det oftalmiske venøse sinus. Den venøse kapillærer ruptur og den resulterende blødning fylder orbital hulrummet.
- Anelse tilbagekalde kapillarrøret at frigøre spidsen, så at den akkumulerede blodet suges ind i røret.
- Når nok blod opsamles, er røret trækkes tilbage og de øjenlågene lukket. Blødning stopper efter tilbagetrækning af røret og genetablering af normalt okulært pres på den venøse komplekset.
- Blod i kapillarrøret overføres til et Microtainer rør og inkuberet i 30 min på is.
- Den Microtainer Røret centrifugeres ved 7500 xg i 2 min ved 4 ° C.
- Supernatanten svarer til den serum, som overføres til et frisk rør og opbevaret ved -80 ° C.
- Serum kan anvendes til at bestemme antistof-titer ved ELISA. Indicatorer af leverskader, såsom serum niveauer af leverenzymer alaninaminotransferase (ALAT / GPT) og aspartat aminotransferase (ASAT / GOT) kan vurderes ved hjælp af efter teststrimlerne fra Roche Diagnostics (Mannheim, Tyskland) og en Reflotron Plus analysator ( Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland).
Alternativt kan blodprøvetagning ske via halevenen eller via den overfladiske tidsmæssige vene 11.
3. Muselever perfusion
Bemærkning: Dette trin er vigtigt at undgå en forurening af isolerede lever lymfocytter ved blodlymfocytter
- Aflive den musen ved letale doser af CO 2 efterfulgt ved cervikal dislokation.
- Monter dyret om på ryggen på styrofoam bord. Brug 23 G kanyler til ben ekstremiteter.
- Moisturize og desinficer musen med 70% EtOH
- Om 1 cm væk fra bagbenene, gør et snit gennemhuden og musklen laget. Skåret på begge sider af dyret arbejder op til membranen.
- Når membranen er nået den huden kan vendes baglæns.
- Klip membranen væk fra river derefter skæres vena cava.
- Flyt maven og tarmene ud til siden, udsætte portal vene.
- I portvenen insertet en 27 G nål forbundet til en 5 ml sprøjte fyldt med kold PBS. Lad PBS langsomt vaske det blodet ud af leveren.
- Dissekere leveren ved at snuppe ind mellemgulvet og skære membranen væk fra kroppen.
- Overføre leveren til en petriskål og fjerne mellemgulvet, galdeblæren og enhver anden væv stadig er forbundet til leveren
- Overføre leveren til 10 ml PBS i et 50 ml rør på is eller integrere i OCT forbindelse.
4. Isolering af lever-lymfocytter
- Forbered følgende stamopløsninger:
- Collagenase IV lager (100 mg / ml) in. PBS. (Lav små portioner og opbevares ved -20 ° C).
- DNase bestand (25 mg / ml) i PBS. (Lav små portioner og opbevares ved -20 ° C).
- Collagenasepuffer: PBS indeholdende 0,2 mg / ml collagenase IV, 0,02 mg / ml DNase og 5% FCS; for 1 leveren, blandes 9,5 ml is-kold PBS, 20 ul collagenase IV (100 mg / ml stock), 8 pi DNase ( 25 mg / ml stock), og 500 pi varmeinaktiveret FCS.
- 35% Percoll; mix 175 ml Percoll, 20 ml 10 x PBS lager, 305 ml PBS.
- RPMI komplet = RPMI indeholdende 10% varme-inaktiveret FCS, 100 μ / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 2 mM L-glutamin.
- Overføre perfunderede leveren (se afsnit 3) til 10 ml af frisk PBS i en petriskål på is og skåret i små stykker under anvendelse saks.
- Overfør til en 70 um celle si og pres lever junker igennem med et glas støder eller en pistil fra en 2 ml sprøjte. Der tilsættes forsigtigt 10 ml kold collagenase buffer ogtryk gennem si. Saml suspension og filtreres gennem sien to gange mere.
- Overfør suspensionen frisk 50 ml rør på is. Behandl næste leveren.
- Inkuber levercelle suspension ved 37 ° C i 60 min, bland forsigtigt hvert 15. min.
- Centrifuger ved 30 xgi 3 min ved 4 ° C.
- Overfør supernatant til et frisk rør, efterlader 5 mm fluid ovenfor pellet
- Centrifuger ved 650 xgi 10 min ved 4 ° C.
- Kassér Supernatanten, efterlader 3 mm ovenfor pellet
- Resuspender pellet i 20 ml Percoll puffer
- Centrifuger ved 600 xgi 20 minutter ved 4 ° C.
- Kassér supernatanten og resuspender pellet ved flicking røret.
- Vaske Pelleten 1 x med PBS.
- Vaske Pelleten 1 x med RPMI komplet
- Resuspender pellet i 3 ml RPMI udfylde og tælle celler i en 1:10 fortynding.
- Resuspender cellerne hos ~ 10 7 celler / ml i RPMI udfylder og overføre røret til is. 5. Intracellulær cytokin farvning (ICCS)
- Forberede leverforandringer lymfocytter ved ~ 10 7 celler / ml i RPMI fuldstaendig som beskrevet. Plade 100 pi (10 6 celler) / brønd ind i et fladt 96-brønds plade hvilket ikke er vævs-kultur behandlet.
- Tilføj 50 pi RPMI udfyld indeholdende 2μg/ml Brefeldin A og derefter tilføje 50 pi RPMI komplette indeholdende 2 ug / ml stimulering CYP2D6 peptid (dvs. de immundominante CD4 epitop CYP2D6 41-60 PGLGNLLHVD FQNTPYCFDQ 12 eller den immundominante CD8 epitop CYP2D6 193-212 RRFEYDDPRF LRLLDLAQEG 12). Bland ved pipettering.
- Inkubér i 5 timer ved 37 ° C (optimal stimulation tid men inkubation natten fungerer såvel).
- Forbered følgende stamopløsninger:
- FACS buffer: PBS indeholdende 1% føtalt kalv serum (FCS).
- Fiksering / Permeabilisering buffer: FACS-buffer indeholdende 0,1% saponin og 4% paraformaldehyd
- FACS / saponin vaskepuffer: FACS-buffer indeholdende 0,1% saponin
- FACS / PFA buffer: FACS-buffer indeholdende 1% paraformaldehyd (PFA)
- Overføre-celler ind i V-bund mikrotiterplade (96-brønd) og spin ved 460 xgi 3 min ved 4 ° C. Kassér medium og vortex plade
- Tilføj 150 pi FACS puffer og der centrifugeres ved 460 xg i 3 minutter ved 4 ° C. Kassér medium og vortex plade. Gentage vaske trin.
- Blok overfladen FcR hvis nødvendigt (når du bruger sekundære antistoffer) med 1 ug / ml αCD16/32 cocktail (FcR blok) i FACS puffer i 15 minutter ved 4 ° C og vask 2 x med 150 ul farvning puffer (460 xgi 2 minutter ved 4 ° C).
- Pletdiameter for overflademolekyler: dvs. Anti-CD8a-FITC mAb 10 ug / ml i 50 pi FACS puffer i 30 minutter ved 4 ° C i mørke.
- Tilføj 100 gl FACSpuffer og centrifugering ved 460 xgi 3 min ved 4 ° C.
- Vaske celler 2 x med 150 ul FACS buffer (460 xg; 3 min; 4 ° C). Vortex plade.
- Fix / permeabilisere celler med 100 gl fiksering / permeabilisering buffer i 10 min ved RT.
- Spin ved 460 xgi 7 min ved 4 ° C. Bemærke, at det er vigtigt at forlænge centrifugeringen tid til at 7 min, eftersom fikseringen / permeabilzation skridt ændrer den overordnede densiteten af de cellerne. Vortex plade.
- Vaske 2 x med 150 ul FACS / saponin vaskepuffer (460 xg; 7 min; 4 ° C). Vortex plade.
- Pletdiameter for intracellulære molekyler: dvs. Anti-IFNy-PE mAb 10 ug / ml i 50 pi FACS / saponin wash puffersystemer for 30 minutter ved 4 ° C.
- Tilføj 100 ul FACS / saponin wash bufferopløsninger og spin ved 460 xgi 7 min ved 4 ° C.
- Vaske celler 2 x med 150 ul FACS / saponin vaskepuffer (460 xg; 7 min; 4 ° C). Vortex plade.
- Vaske celler 1 x med FACS puffer (460 xg; 7 min; 4 ° C). Vortex plade. Resuspender cellerne i 200 ul FACS / PFA puffersystemer, overførsel ind rør, og opbevar ved 4 ° C i mørke, indtil erhvervelse af data ved flowcytometri. Vi bruger normalt en FACSCanto II eller en FACSCalibur (BD Biosciences, Heidelberg, Tyskland).
- Harvest lever, nedsænkes i Tissue-Tek oktober i en engangs bund form og quick-freeze på tøris.
- Skæres 7 um leverenzymer vævssektioner anvender en Leica kryostat indstillet til -17 ° C, og montere de vævs afsnittene om SuperFrost Plus mikroskopobjektglas. Forretningspolitik dias ved -20 ° C indtil yderligere anvendelse.
- Fastsaette kryosektioner i præ-afkølede EtOH i 15 minutter ved -20 ° C. Lad tørre i 10 min.
- Vaske 2 x i destilleret vand til 2 minutter ved stuetemperatur (de følgende trin, 6.1.5 - 6.1.13, udføres ved stuetemperatur).
- Farv i Meyer 's hematoxylin løsning til8 min.
- Vask i lunkent (30 ° C) ledningsvand vand i 10 min. Skift vand flere gange.
- Skylning i destilleret vand.
- Skylles i 95% EtOH for 20 sek.
- Kontrastfarve i Eosin G / Y løsning for 40 sek.
- Dehydrer 2 x i 95% EtOH i 5 minutter pr inkubation.
- Dehydrer 2 x i 100% EtOH i 5 minutter pr inkubation.
- Ryd i xylen 2 x i 5 minutter pr clearing.
- Monter i Roti-Histokitt.
- Harvest lever, nedsænkes i Tissue-Tek oktober i en engangs bund form og quick-freeze på tøris.
- Skæres 7 um leverenzymer vævssektioner anvender en Leica kryostat indstillet til -17 ° C, og montere de vævs afsnittene om SuperFrost Plus mikroskopobjektglas. Forretningspolitik dias ved -20 ° C indtil yderligere anvendelse.
- Fix kryosektioner i koldt EtOH i 15 minutter ved -20 ° C. Lad tørre i 10 min.
- Vaske 2 x i PBS i 2 minutter ved stuetemperatur. <li> Inkuber i PBS indeholdende 0,3% H 2 O 2 og 0,1% Na-azid i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Vaske 2 x i PBS i 2 minutter ved stuetemperatur.
- Blokere med en avidin-biotin blokerende kittet ifølge fabrikantens retningslinjer.
- Bloker med 10% FCS i PBS (FCS / PBS) i 30 min ved stuetemperatur.
- Det primære antistof er et kanin-anti-muse kollagen I antistof, som er fortyndes 1:200 i 10% FCS / PBS. Inkuber sektioner med primært antistof i 2 timer ved stuetemperatur.
- Vaske sektioner 3 x i PBS i 4 minutter ved stuetemperatur.
- Fortyndes biotinyleret anti-kanin-antistof til 1:500 og inkubere med afsnittene til 1,5 time ved stuetemperatur.
- Vaske sektioner 3 x i PBS i 4 minutter ved stuetemperatur.
- Farvereaktion opnås ved sekventiel inkubering med avidin-peroxidase konjugat og diaminobenzidin-hydrogen peroxid ifølge fabrikantens retningslinjer.
- Kontrastfarve i Meyers Hanmatoxylin løsning for 5 min, vaske 2 x i PBS i 2 minutter ved stuetemperatur og montere på Aquatex.
5,1 Stimulation:
5,2. Farvning:
6. Immunhistokemi
6,1. H & E farvning for vurdering af generel leveren patologi:
6,2. Immunohistokemi for kollagen I deposition:
7. Repræsentative Resultater
Infektion af mus med Ad-2D6 inducerede to forskellige stadier af leverskader. I de første dage efter infektion, forårsager virus infektion af leveren en akut stigning af serum aminotransferaseniveauer, en indikator for hepatocyt døden 6. Denne 1:e, akut etape forekommer uafhængig af ekspressionen af hCYP2D6 og også kan observeret efter infektion med en tom kontrol-virus (Ad-Control) eller en virus udtrykker grøn fluorescens protein (Ad-GFP). I modsætning, er anden etape autoimmune-medieret og afhængige på ekspressionen af det udløsende molekylet hCYP2D6. Dette autoimmun stadie forekommer inden for 2-4 uger post-infektion og vedvarer i flere måneder 6.
Følgende funktioner er karakteristiske for den vedvarende autoimmun hepatitis udvikle sig efter Ad-2D6-infektion af vildtype FVB eller C57BL / 6 mus i CYP2D6 modellen: For det første, leveren viser en afvigende ændret morfologi. I særdeleshed, er de leveren lapperne fusioneres, hyperplastiske nodules vises spredt over hele leveren og en massiv kapselformet fibrose er synlig (figur 2).
Figur 2. Leveren morfologi. Typisk Ad-2D6-induceret leverskader som detekteret ved uge 4 post-infektion. Bemærke, at de individuelle leveren Lappe er fusioneres (pilespidser). Hyperplastiske nodules synes spredt over hele leveren (pile). Infektion med en kontrol adenovirus ikke udtrykker hCYP2D6 har ingen effekt på leveren morfologi.
For det andet, omfattende og vedvarende cellulære infiltrationer vises i peri-portalen og parenkymale regioner af de lever af Ad-2D6-inficerede, men ikke Ad-Control-inficerede mus (figur 3A). Fibrose overvejende udvikler i den subkapsulær regionen med nogle kollagenbundter fremspringende ind i parenkym (figuren 3B).
Figur 3. Leverhistologien A:. H & E farvning af levervæv sektion af FVB-mus inficeret med enten Ad-Control-eller Ad-2D6 ved uge 4 post-infektion. Bemærke, at betydelige infiltrationer af mononukleære celler er kun til stede i Ad-2D6 inficerede mus (enlige pile). Triple pile angiver større cellulære infiltrationer i leverparenkym bro mellem nabo-portal skrifter. B: Immunhistokemisk repræsentation af leverfibrose i uge 4 efter infektion med Ad-2D6 eller Ad-kontrol. Leveren afsnit er blevet farvet for collagen under anvendelse en anti-kollagen I antistof. Note multiplum lag af kollagen disposition under den leveren kapslen (tredobbelte pile) med nogle bundter fremspringende ind i parenkym (enlige pile) og tilstedeværelsen af store klynger af infiltrerende celler (pilespidser). To repræsentative leveren sektioner er vises for hver betingelse. Size barer: 100 um.
Et tredje træk er generation af høje titere af anti-CYP2D6 antistoffer, hvilket har en lignende epitop specificitet til humane LKM-1 antistoffer 6,13. Sidste, hCYP2D6-specifikke CD4 og CD8-T-celler genereres, der overvejende hjem til leveren. Sådanne hCYP2D6-specifikke T-celler kan detekteres ved stimulering med immunodomiNant hCYP2D6 peptider og efterfølgende måling af IFNy ekspression ved en intracellulær cytokin farvning (ICCS) (figur 4). hCYP2D6-specifikke CD8 T-celler kill Ad-2D6-inficerede målceller in vivo 12.
Fig 4. hCYP2D6-specifikke T-celler. Flowcytometrisk analyse af hCYP2D6-specifikke T-celler. Lever lymfocytter er blevet isoleret ved uge 4 efter, Ad-2D6-infektion og blev stimuleret med enten de immundominante CD4 eller CD8 hCYP2D6 epitop-natten over. Generation af IFNy blev detekteret ved intracellulær cytokin farvning og analyseret ved flowcytometri under anvendelse en FACS Canto II (BD Biosciences, Heidelberg, Tyskland). Procentdelen af hCYP2D6-specifikke CD4 og CD8 celler er indiceret.
Discussion
I tidligere studier blev eksperimentel hepatitis ofte rapporteret at være kun transiente og mange aktuelle modeller for autoimmun leversygdom afhænge en temmelig kompleks sygdom induktion protokoller (for bedømmelser se 3,5). For eksempel, bruge adskillige modeller transgene mus udtrykker specifikke målantigener og adoptivt overført target antigenspecifikke-specifikke, hovedsagelig TcR-transgene, T-celler 14,15. Ofte en yderligere infektion med livertropic vira, bakterier eller parasitter er noedvendigt at inducere sygdom 16-18. Alternativt, er DNA-vaccination med plasmider kodende for målantigenerne, herunder CYP2D6 19, anvendes til at fremkalde hepatitis. Imidlertid en yderligere vaccination med plasmider der koder for pro-inflammatoriske cytokiner, såsom IL-12, er forpligtet til 20. Desværre, med få undtagelser 15,20 hepatitis er kun forbigående.
Den CYP2D6 Modellen 6,21 benytter en meget ligefrem metode to inducere autoimmun hepatitis ved simpelthen inficere mus med en Adenovirus udtrykker hCYP2D6, den største autoantigenet i AIH-2 7,8. Levering af CYP2D6 ved at en adenovirus konstrukt garanterer både en direkte målretning af leveren såvel som en lokal inflammation der fremmer nedbrydningen af tolerance. Er det vigtigt at bemærke imidlertid at både virustiter såvel som indgivelsesvejen er afgørende for denne model. På den ene side, er Ad-2D6 en replikations deficient virus, dermed, en tilstrækkelig høj titer af virus er nødvendig for at generere en kritisk mængde af antigen inden for det leveren. På den anden side, måske for høj en titer resultere i en fatal akut leversvigt. Derudover, er det blevet demonstreret tidligere, at infektion af mus ved høje titere af adenovirus fører til en funktionel konsumption af den immunresponset 22. I vores model, brugte vi en kombination af intravenøs og intraperitoneal infektion for at opnå både kronisk cellulær infiltration såvel som extensive fibrose. Vi har observeret at intravenøs infektion alene stadig forårsager massiv cellulær infiltration, men ingen fibrose af den subkapsulær regionen, hvilket indikerer, at peritoneal inflammation på grund på den intraperitoneale injektion måtte være involveret i den kontinuerlige subkapsulær akkumulering af collagen (Hintermann & Christen, manuskript under udarbejdelse). Det er imidlertid vigtigt at bemærke, den observerede hepatisk fibrose er antigen-specifik, da vi ikke registrerer aktivering af hepatiske stjerneformige celler og collagen deposition efter infektion med lige virus-titere af Ad-GFP eller Ad-Control 23.
Den CYP2D6 model afspejler mange aspekter af menneskelig AIH 1,2, såsom kronisk hepatitis karakteriseret ved vedvarende cellulær infiltration og leveren fibrose 6. Derudover, indikerer tilstedeværelse af høj-titer anti-CYP2D6 antistoffer med lignende epitop specificitet og spredning 13 til LKM-1 antistoffer fundet i AIH-2 patienter præsnaevre betydning af en fælles kronisk autoimmun reaktivitet. CYP2D6 er den største antigen i AIH-2, men det er ikke anerkendt af patienter diagnosticeret med hyppigere type 1 AIH. Derudover,, patienter, der lider fra andre lever sygdomme med autoimmun ætiologi, såsom primær biliær cirrhose (PBC) eller primær skleroserende cholangitis (PSC) generere kendetegnende autoantistoffer med specificitet til distinkte lever autoantigener og påhængskøretøjer lever vise forskellige patologiske træk centrerende på lille (PBC ) eller store (PSC) galdegangene. Ikke desto mindre CYP2D6 modeller giver mulighed for at analysere immunopathogenic mekanismer, der er involveret i kroniske hepatiske inflammatoriske processer, som opstår under autoimmune leversygdomme, at identificere de vigtigste spillere, der driver autoimmun ødelæggelse af hepatocytter og for at evaluere mulige terapeutiske interventioner at helbrede sygdommen.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde er støttet af Goethe-universitetet Hospital Frankfurt og et tilskud af den tyske Research Foundation til UC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 23G needle | BD Biosciences | 300800 | |
| 27½G needle | VWR international | 612-0151 | |
| 30½ G needle | BD Biosciences | 304000 | |
| Alanine aminotransferase test strips (GPT/ALT) | Roche Group | 10 745 138 202 | |
| Aspartate aminotransferase test strips (GOT/AST) | Roche Group | 10 745 120 202 | |
| Anaesthesia Unit Univentor 400 |  AgnTho’s |
||
| Base molds, disposable 37x24x10 mm | VWR international | 720-0208 | |
| Cell strainer 70mm | VWR international | 734-0003 | |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM1850 UV | |
| Heparinized capillary tubes | Fisher Scientific | 3123987 | |
| Microscope slides Superfrost Plus | Menzel-Glaser | J1800AMNZ | |
| Microtainer SST tubes | BD Biosciences | 365951 | |
| Microtiter plates, V-bottom | VWR international | 391-1924 | |
| Reflotron Plus | Roche Group | Determiniation of serum AST / ALT | |
| Rabbit anti-mouse anti-Collagen type I IgG, | Chemicon International | AB765P | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | VC-BA-1000-MC15 | |
| FITC-conjugated anti mouse CD8a antibody | SouthernBiotech | 1550-02 | |
| PE-conjugated anti mouse IFNγ antibody | BD Biosciences | 554412 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD16/CD32 antibody (FcR block) | BD Biosciences | 553141 | |
| Aquatex | VWR international | 1.08562.0050 | |
| Avidin/Biotin Blocking kit | Vector Laboratories | VC-SP-2001-KI01 | |
| Brefeldin A | Sigma-Aldrich | B6542 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138-100MG | |
| DAB substrate kit 3’3’diaminobenzidine | Vector Laboratories | VC-SK-4100-KI01 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Elite ABC Reagent | Vector Laboratories | VC-PK-7100-L050 | |
| Eosin G/Y solution | Carl Roth Gmbh | X883.1 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | |
| Isofluran | Forene | B506 | |
| Meyer’s Hematoxylin solution | AppliChem | A4840,1000 | |
| OCT Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| PBS-buffered formaldehyde 10% | Carl Roth Gmbh | A146.3 | |
| Percoll | Amersham | 17-0891-01 | |
| Roti-Histokit | Carl Roth Gmbh | 6638.1 | |
| RPMI | Invitrogen | 61870 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S7900 |
References
- Manns, M. P. Diagnosis and management of autoimmune hepatitis. Hepatology. 51, 2193-2213 (2010).
- Czaja, A. J., Manns, M. P. Advances in the Diagnosis, Pathogenesis and Management of Autoimmune Hepatitis. Gastroenterology. 4, 429-443 (2010).
- Christen, U., Hintermann, E., Jaeckel, E. New animal models for autoimmune hepatitis. Semin. Liver Dis. 29, 262-272 (2009).
- Christen, U., Holdener, M., Hintermann, E. Animal models for autoimmune hepatitis. Autoimmun. Rev. 6, 306-311 (2007).
- Czaja, A. J.
- Holdener, M. Breaking tolerance to the natural human liver autoantigen cytochrome P450 2D6 by virus infection. J. Exp. Med. 205, 1409-1422 (2008).
- Manns, M. P., Griffin, K. J., Sullivan, K. F., Johnson, E. F. LKM-1 autoantibodies recognize a short linear sequence in P450IID6, a cytochrome P-450 monooxygenase. J. Clin. Invest. 88, 1370-1378 (1991).
- Zanger, U. M., Hauri, H. P., Loeper, J., Homberg, J. C., Meyer, U. A. Antibodies against human cytochrome P-450db1 in autoimmune hepatitis type II. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85, 8256-8260 (1988).
- von Herrath, M. G., Fujinami, R. S., Whitton, J. L. Microorganisms and autoimmunity: making the barren field fertile. Nat. Rev. Microbiol. 1, 151-157 (2003).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S.
- Forbes, N. Morbidity and mortality rates associated with serial bleeding from the superficial temporal vein in mice. Lab. Anim. (NY). 39, 236-240 (2010).
- Ehser, J. Molecular mimicry rather than identity beaks T cell tolerance in the CYP2D6 mouse model for human autoimmune hepatitis. , Forthcoming (2011).
- Hintermann, E. Epitope spreading of the anti-CYP2D6 antibody response in patients with autoimmune hepatitis and in the CYP2D6 mouse model. J. Autoimmun. , Forthcoming (2011).
- Ando, K. Class I-restricted cytotoxic T lymphocytes are directly cytopathic for their target cells in vivo. J. Immunol. 152, 3245-3253 (1994).
- Zierden, M., Kuhnen, E., Odenthal, M., Dienes, H. P. Effects and regulation of autoreactive CD8+ T cells in a transgenic mouse model of autoimmune hepatitis. Gastroenterology. 139, 975-986 (2010).
- Limmer, A. Failure to induce organ-specific autoimmunity by breaking of tolerance: importance of the microenvironment. Eur. J. Immunol. 28, 2395-2406 (1998).
- Voehringer, D. Break of T cell ignorance to a viral antigen in the liver induces hepatitis. J. Immunol. 165, 2415-2422 (2000).
- Derkow, K. Differential priming of CD8 and CD4 T-cells in animal models of autoimmune hepatitis and cholangitis. Hepatology. 46, 1155-1165 (2007).
- Lapierre, P., Djilali-Saiah, I., Vitozzi, S., Alvarez, F. A murine model of type 2 autoimmune hepatitis: Xenoimmunization with human antigens. Hepatology. 39, 1066-1074 (2004).
- Djilali-Saiah, I., Lapierre, P., Vittozi, S., Alvarez, F. DNA vaccination breaks tolerance for a neo-self antigen in liver: a transgenic murine model of autoimmune hepatitis. J. Immunol. 169, 4889-4896 (2002).
- Christen, U., Hintermann, E., Holdener, M., von Herrath, M. G. Viral triggers for autoimmunity: is the 'glass of molecular mimicry' half full or half empty. J. Autoimmun. 34, 38-44 (2010).
- Krebs, P., Scandella, E., Odermatt, B., Ludewig, B. Rapid functional exhaustion and deletion of CTL following immunization with recombinant adenovirus. J. Immunol. 174, 4559-4566 (2005).
- Hintermann, E., Bayer, M., Pfeilschifter, J., Christen, U. Adenoviral delivery of the liver autoantigen cytochrome P450 2D6 chronically activates hepatic stellate cells and induces fibrosis. Manuscript Submitted. , (2011).
