Summary
Infecção de camundongos com um Adenovírus expressando o autoantígeno major humano do citocromo P450 2D6 (hCYP2D6) reconhecidas pelos soros de pacientes que sofrem a partir de tipo 2 resultados da hepatite auto-imunes em uma forma persistente da auto-imune-mediada doença do fígado caracterizada por extenso hepatite fibrose, e de geração de um CYP2D6 -específica resposta imune.
Abstract
Hepatite auto-imune é uma doença rara mas potencialmente fatal auto-imune do fígado de 1,2 etiologia desconhecida. Em as tentativas passado, muitos tenham sido efectuadas ao gerar um modelo animal, que reflete as características de a doença humana 3-5. No entanto, em vários modelos a indução de doença foi de bastante complexo e, muitas vezes a hepatite foi de apenas transiente 3-5. Portanto, temos desenvolvido um modelo do rato simples de que, usa o autoantígeno major humano em tipo 2 hepatite auto-imune (AIH-2), a saber, hCYP2D6, como um gatilho 6. Tipo 1 fígado e rim-anticorpos microssomais (LKM-1) anticorpos que reconhecem hCYP2D6 são a marca registrada de AIH-2 7,8. Entrega de hCYP2D6 em tipo selvagem FVB ou camundongos C57BL / 6 foi por um construto Adenovírus (Ad-2D6), que garanta uma entrega directa de o antígeno desencadeante para o fígado. Assim, a inflamação que se seguiu local gera um campo fértil 9 para o desenvolvimento subseqüente de auto-imunidade. Um combination de injecção intravenosa e intraperitoneal de Ad-2D6 é a rota mais eficaz para induzir a um dano a longo-duradoura auto-imune para o fígado (secção 1). Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado sobre como doença auto-imune hepática é induzida no modelo de CYP2D6 e como os diferentes aspectos da lesão hepática pode ser avaliada. Em primeiro lugar, os níveis séricos de marcadores que indicam destruição hepatócito, tais como aminotransferases, bem como os títulos de aglutininas hCYP2D6 anticorpos são determinadas pela recolha de sangue retroorbitaly (seção 2). Segundo lugar, o hCYP2D6-específico resposta das células T é caracterizada através da recolha de linfócitos a partir do baço e do fígado. A fim de obter linfócitos de fígado puros, os fígados são perfundidos pela PBS através da veia portal (secção 3), digerido em colágeno e purificou-se ao longo de um gradiente de Percoll (seção 4). A frequência de células hCYP2D6-T específicas é analisada por estimulação com hCYP2D6 peptídeos e à identificação de IFNy-células produtoras de por citometria de fluxo (seção 5). Em terceiro lugar,infiltração celular e fibrose é determinada por imuno-histoquímica de secções de fígado (seção 6). Regimen Tal análise tem de ser conduzida a várias vezes após a iniciação da doença, a fim de provar a natureza crônica do modelo. A magnitude da resposta imune caracterizada por a freqüência e actividade das hCYP2D6-específicos T e / ou células B e o grau de a danos no fígado e fibrose têm de ser avaliados para uma subsequente avaliação de possíveis tratamentos para prevenir, atrasar ou revogue a autodestructive processo de o fígado.
Protocol
1. A injeção intravenosa de Ad-2D6 em seio oftálmico
- Sob condições estéreis, diluir o Ad-2D6 solução estoque vírus para uma concentração de 5 x 10 9 pfu / ml em meio RPMI e manter o vírus solução Ad-2D6 em gelo. A injeção de duas doses de 5 x 10 8 pfu (intravenosa e intraperitoneal) tem se mostrado para resultar em o resultado mais confiável de hepatite auto-imune em camundongos da estirpe utilizada na FVB.
- Anestesiar mouse com 4% de isoflurano em uma câmara de anestesia. Aperte a perna para se certificar de que o animal é anestesiado.
- Segure o mouse por parte de trás do pescoço e apertar a pele frouxa de a cabeça com o polegar eo dedo médio. Gosta dessa, o olho sai ligeiramente por a tração a da pele adjacente para o olho.
- Coloque a agulha verticalmente no canto medial (junção das pálpebras mais próximos ao nariz do animal) e, lentamente, injectar 100 vírus solução ul Ad-2D6. É importante não para aplicar pressão demasiada, paraevitar danos nos vasos ea traquéia.
- Lentamente, retirar a agulha para evitar o derramamento e fechar das pálpebras.
- Injeção funcionou bem, se a solução vírus não vazar para fora através do nariz e do olho desliza de volta para sua posição inicial.
- Imediatamente após a injecção intravenosa, executar um de injecção padrão de intraperitoneal de o uL 100 segundo da solução de vírus Ad-2D6.
Alternativamente, a injecção intravenosa pode ser executado via da veia da cauda. No entanto, a injeção de via do seio oftálmica é muito mais fácil para executar e minimiza a perda da solução vírus. Tem sido demonstrado que estas duas técnicas podem ser usados de forma intercambiável e que ambas as rotas são igualmente eficazes 10.
Camundongos infectados são monitorados para efeitos adversos e sinais evidentes de sofrimento e dor, tais como perda de apetite, perda de peso, perda de mobilidade, a falta de noivo, pêlos arrepiados, debruçadoaparência, bem como lambendo, mordendo, arranhando, ou sacudindo uma área em particular (site ou seja, de injecção). Embora os ratos exibir um dano enorme para o fígado no modelo de CYP2D6, os ratos parecem saudáveis e não mostram sinais de dor, sofrimento ou stress. Não obstante, os indicadores de de insuficiência grave do fígado, tais como aminotransferases séricos são determinados em uma base regular ou são parte de os experimentos realizados. Os níveis séricos de aminotransferases de> 1000 U / l deve aparecer apenas como um resultado direto da infecção pelo vírus, mas não cronicamente. Se os níveis séricos de aminotransferase são cronicamente acima de 1000 U / l (limite de severidade) os camundongos são sacrificados.
2. Hemorragia ocular do mouse
- Anestesiar mouse com 4% de isoflurano em uma câmara de anestesia. Aperte a perna para se certificar de que o animal é anestesiado.
- Segure o mouse por parte de trás do pescoço e apertar a pele frouxa de a cabeça com o polegar eo dedo médio. Assim, o olho sai ligeiramente pora tração a da pele adjacente para o olho.
- Coloque a ponta do tubo capilar no canto inferior ou interna do olho e, delicadamente, mas com firmeza deslizou ao lado de o globo ocular para o seio venoso oftálmico. A ruptura venosa capilares ea hemorragia resultante preenche a cavidade orbital.
- Ligeiramente retirar o tubo capilar para libertar a ponta de modo que o sangue acumulado é desenhada para dentro do tubo.
- Quando o sangue o suficiente é coletado, o tubo é retirado e as pálpebras fechado. Sangramento pára mediante a retirada do tubo e restabelecimento da pressão ocular normal em cima o complexo venoso.
- Do Sangue no tubo capilar é transferida para um tubo Microtainer e incubadas durante 30 min em gelo.
- O tubo de Microtainer é centrifugado a 7500 xg durante 2 min a 4 ° C.
- O sobrenadante corresponde ao soro, que é transferido para um tubo de fresco e armazenada à temperatura de -80 ° C.
- O soro pode ser usado para determinar título de anticorpo por ELISA. Indicadores de lesão hepática, tais como os níveis séricos das enzimas hepáticas alanina aminotransferase (ALT / GPT) e aspartato aminotransferase (AST / TGO) podem ser avaliados utilizando as tiras de teste de acordo da Roche Diagnostics (Mannheim, Alemanha) e um Reflotron Além disso analisador ( A Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha).
Como alternativa, amostragem de sangue pode ser feito através da veia da cauda ou através da veia temporal superficial 11.
3. Perfusão de fígado do rato
• Observação: Esta etapa é importante para evitar uma contaminação de linfócitos de fígado isoladas por linfócitos de sangue
- Euthanize o mouse por doses letais de CO 2 seguidas por deslocamento cervical.
- Montar o animal, que em sua parte traseira da placa de isopor. Use 23 agulhas G para o pino extremidades.
- Hidratar e desinfectar o mouse com EtOH 70%
- Cerca de 1 cm de distância de patas traseiras, fazem uma incisão atravésa pele e a camada de músculo. Em Recortar no ambos os lados de o animal de trabalho até o diafragma.
- Quando o diafragma é alcançado, a pele pode ser capotou trás para frente.
- Cortar o diafragma de distância a partir de os rasga, em seguida, cortar a veia cava.
- Mova o estômago e os intestinos fora para o lado, expondo a veia portal.
- Em a veia portal de insert uma agulha G 27 conectado a uma seringa de 5 ml preenchido com PBS frio. Deixe o PBS lentamente lavar o sangue para fora do fígado.
- Dissecar o fígado por ainda se agarrando a o diafragma e cortando o diafragma para longe do corpo.
- Transfira o fígado para um prato de petri e retirar o diafragma, a vesícula biliar e qualquer outro tecido ainda está conectado para o fígado
- Transfira o fígado para 10 ml de PBS em um tubo de ml 50 em gelo ou embute em composto em outubro
4. Isolamento de linfócitos de fígado
- Prepare as seguintes soluções de reserva:
- Colagenase IV estoque (100 mg / ml) in PBS. (Faça pequenas alíquotas e armazenar a -20 ° C).
- DNase estoque (25 mg / ml) em PBS. (Faça pequenas alíquotas e armazenar a -20 ° C).
- Colagenase buffer: PBS contendo 0,2 mg / ml de colagenase IV, 0,02 mg / ml de DNase e FCS 5%; para 1 fígado, misture 9,5 ml de gelo-frio PBS, 20 uL colagenase IV (100 estoque mg / ml), 8 DNase ul ( 25 mg / estoque ml), e 500 uL inativado pelo calor de FCS.
- 35% de Percoll e misturar 175 ml de Percoll 20 ml 10 x PBS estoque; 305 ml PBS.
- RPMI completo = RPMI contendo 10% de inativado pelo calor FCS, a 100 μ / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina.
- Transfira o fígado perfundido de (ver secção 3) para 10 ml de PBS fresco em um prato de petri em gelo e cortado em pedaços pequenos usando uma tesoura.
- Pode transferir para um coador de célula de 70 iM e juncos de fígado squeeze através de com um pilão de vidro ou de um pilão a partir de uma seringa de 2 ml. Com cuidado, adicione 10 ml de tampão frio e colagenaseprima através de filtro. Coletar suspensão e filtrar através de coador de duas vezes mais.
- Transfira suspensão para o tubo ml fresca 50 em gelo. Processar fígado seguinte.
- Incubar suspensão de células de fígado a 37 ° C durante 60 min, misture suavemente a cada 15 min.
- Centrifugar a 30 xg durante 3 min a 4 ° C.
- Transfira o sobrenadante para um tubo fresco, deixando 5 fluido mm acima pellet
- Centrifugar a 650 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Elimine o sobrenadante, deixando 3 mm acima pellet
- Ressuspender o pellet em 20 ml de Percoll buffer de
- Centrifugar a 600 xg durante 20 min a 4 ° C.
- Elimine o sobrenadante e re-suspenda as pellet por flicking o tubo.
- Lave pellet 1 x com PBS.
- Lave pellet 1 x com RPMI completo
- Ressuspender o pellet em 3 ml de RPMI completar e contar as células em uma diluição de 1:10.
- Ressuspenda as células at ~ 10 7 células / ml em RPMI completar e transferir tubo para gelo. 5. Coloração de citocinas intracelular (CIEC)
- Prepare a linfócitos de fígado em ~ 10 7 células / ml em RPMI completo como descrito. UL placa de 100 (10 6 células) / bem em uma placa plana 96-bem o que não é da cultura de tecidos tratada.
- Adicionar 50 l RPMI completar contendo 2μg/ml Brefeldin A e em seguida, adicionar 50 l RPMI completo contendo 2 ug / ml estimulando CYP2D6 péptido (isto é, as CD4 imunodominantes epítopo CYP2D6 41-60 PGLGNLLHVD FQNTPYCFDQ 12 ou o imunodominante CD8 epítopo CYP2D6 193-212 RRFEYDDPRF LRLLDLAQEG 12). Misture por pipetagem.
- Incubar durante 5 horas a 37 ° C (tempo de uma estimulação óptima mas incubação durante a noite funciona tão bem).
- Prepare as seguintes soluções de reserva:
- FACS buffer: PBS contendo 1% de fetal de vitelo serum (FCS).
- Fixação / Permeabilização tampão: tampão FACS contendo 0,1% de saponina e paraformaldeído 4%
- FACS / saponina tampão de lavagem: tampão FACS contendo saponina 0,1%
- FACS / PFA tampão: tampão FACS contendo paraformaldeído 1% (PFA)
- Transfira células em V-parte inferior placa de microtitulação (96-bem) e girar à 460 xg durante 3 min a 4 ° C. Descartar médio e placa de vórtice
- Adicionar 150 tampão FACS uL e centrifugar a 460 xg durante 3 min a 4 ° C. Descartar médio e placa de vórtice. Repita o passo de lavagem.
- FcR Bloco de superfície, se necessário (quando usando anticorpos secundários) com 1 ug / ml αCD16/32 cocktail (bloco de FcR) em tampão de FACS durante 15 min a 4 ° C e lave 2 x com 150 tampão de coloração de uL (460 xg durante 2 min a 4 ° C).
- Stain para as moléculas de superfície: ou seja, Anti-CD8a-FITC mAb 10 ug / ml em 50 tampão FACS uL durante 30 min a 4 ° C no escuro.
- Adicionar 100 FACS uLbuffer e de spin menos 460 xg durante 3 min a 4 ° C.
- Lave as células 2 x com 150 tampão FACS uL (460 xg; 3 min; 4 ° C). Placa Vortex.
- Correção / permeabilizar células com 100 tampão de fixação / permeabilização uL durante 10 min a RT.
- Spin menos 460 xg durante 7 min a 4 ° C. Observe que ele é importante para estender o tempo de centrifugação para o 7 min, uma vez que a fixação / etapas permeabilzation muda a densidade global das células. Placa Vortex.
- Lave 2 x com 150 FACS uL / tampão de lavagem de saponina (460 xg; 7 min; 4 ° C). Placa Vortex.
- Stain para as moléculas intracelulares: ou seja, Anti-IFNy-PE mAb 10 ug / ml em 50 FACS uL / tampão de lavagem de saponina para 30 min a 4 ° C.
- Adicionar 100 FACS uL / tampão de lavagem de saponina e girar à 460 xg durante 7 min a 4 ° C.
- Lave as células 2 x com 150 FACS uL / tampão de lavagem de saponina (460 xg; 7 min; 4 ° C). Placa Vortex.
- Lave as células 1 x com tampão FACS (460 xg; 7 min; 4 ° C). Placa Vortex. Ressuspenda as células em 200 FACS uL / de buffer PFA, a transferência de em tubos, e loja a 4 ° C, no escuro até a aquisição de dados por parte citometria de fluxo. Nós normalmente usamos a II FACSCanto ou um FACSCalibur (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha).
- Fígado Colheita, imerso em Tissue-Tek outubro em um molde da base descartável e freeze-rápida sobre gelo seco.
- Corte 7 mM seções de tecido hepático utilizando um criostato Leica fixado em -17 ° C e montar as secções de tecido sobre Superfrost Além disso lâminas de microscópio. Slides Loja Loja de a -20 ° C até o uso mais adicional.
- Fix criossecções em pré-arrefecida EtOH durante 15 min a -20 ° C. Deixe secar por 10 min.
- Lave 2 x em água destilada por 2 min à temperatura ambiente (as seguintes etapas, 6.1.5 - 6.1.13, são realizados à temperatura ambiente).
- Mancha em solução de hematoxilina de Meyer para8 min.
- Lave em água morna (30 ° C) de água de torneira, durante 10 min. Alterar água várias vezes.
- Enxágüe em água destilada.
- Enxágüe em EtOH de 95% para 20 seg.
- Contracoloração em solução de Eosina G / Y por 40 seg.
- Desidratar 2 x em EtOH de 95% para 5 min por incubação.
- Desidratar 2 x em EtOH 100% para 5 min por incubação.
- Limpar em xilol 2 x por 5 min por compensação.
- Monte em Roti-Histokitt.
- Fígado colheita, imergir em Tissue-Tek outubro em um molde da base descartável e freeze-rápida sobre gelo seco.
- Corte 7 mM seções de tecido hepático utilizando um criostato Leica fixado em -17 ° C e montar as secções de tecido sobre Superfrost Além disso lâminas de microscópio. Slides Loja Loja de a -20 ° C até o uso mais adicional.
- Fix criossecções em EtOH a frio durante 15 min a -20 ° C. Deixe secar por 10 min.
- Lave 2 x em PBS durante 2 min à temperatura ambiente. <li> Incubar em PBS contendo 0,3% de H 2 O 2 e 0,1% de Na-azida de durante 10 min a temperatura ambiente.
- Lave 2 x em PBS durante 2 min à temperatura ambiente.
- Bloco com um kit de avidina-biotina bloqueio de acordo com as orientações do fabricante.
- Bloqueie com FCS 10% em PBS (FCS / PBS) durante 30 min a temperatura ambiente.
- O anticorpo primário é um coelho anti-rato de colágeno anticorpo I, que é diluída 1:200 em 10% de FCS / PBS. Incubar secções, com um anticorpo primário para a 2 hrs à temperatura ambiente.
- Lave seções 3 x em PBS durante 4 min à temperatura ambiente.
- Diluir o anticorpo anti-coelho biotinilado a 1:500 e incubar com as seções para 1,5 hr à temperatura ambiente.
- Lave seções 3 x em PBS durante 4 min à temperatura ambiente.
- Reação de cor é obtida por incubação sequencial com avidina-peroxidase conjugado e diaminobenzidina-hidrogénio peróxido de de acordo com orientações do fabricante.
- Contracoloração de Meyer Elematoxylin solução para 5 min, lave 2 x em PBS durante 2 min à temperatura ambiente e montar em Aquatex.
5,1 Estimulação:
5,2. Coloração:
6. Imunohistoquímica
6,1. H & E coloração para a avaliação do fígado patologia geral:
6,2. Imuno-histoquímica para a deposição de colágeno I:
7. Os resultados representativos
Infecção de camundongos com Ad-2D6 induzidas em duas fases distintas de danos ao fígado. Nos primeiros dias após a infecção, infecção por vírus de o fígado faz com que um aumento agudo dos níveis séricos de aminotransferase, um indicador da morte do hepatócito 6. Este estágio, em primeiro lugar aguda ocorre independente de a expressão de hCYP2D6 e também pode ser observada após a infecção com um vírus de controle vazia (Ad de Controle-) ou um vírus expressando proteína de fluorescência verde (Ad-GFP). Em contraste, o segundo estágio é auto-imune-mediada e dependente da expressão da molécula de desencadeamento hCYP2D6. Esta fase auto-imune ocorre dentro de 2-4 semanas após a infecção e persiste por vários meses 6.
Os seguintes recursos são característica para a hepatite persistente auto-imune em desenvolvimento após a Ad-2D6-infecção de tipo selvagem FVB ou camundongos C57BL / 6 no modelo de CYP2D6: Em primeiro lugar, o fígado mostra uma morfologia aberrantemente mudado. Em particular, os lobos do fígado são fundidos, nódulos hiperplásicas aparecem espalhadas ao longo da fígado inteiro e uma fibrose capsular maciço é visível (figura 2).
Figura 2. Morfologia do fígado. Danos no fígado típica Ad-2D6-induzida, como detectado na 4 ª semana pós-infecção. Observe que os lobos do fígado individuais são fundidos (pontas de seta). Nódulos hiperplásicos aparecem espalhadas por todo o fígado (setas). A infecção com um adenovírus de controle não expressando hCYP2D6 não tem nenhum efeito sobre a morfologia do fígado.
Em segundo lugar, extensa e persistente infiltrações celulares aparecem nas regiões peri-portal e parenquimatosa de fígado de camundongos Ad-2D6-infectados, mas não Ad-Control-infectados (Figura 3A). Fibrose predominantemente se desenvolve na região subcapsular com alguns feixes de colágeno salientes para o parênquima (figura 3B).
Figura 3. Histologia hepática A:. H & E coloração de seção de fígado tecido de camundongos FVB infectadas com as Ad-Control ou Ad 2D6-at semanas 4 pós-infecção. Note-se que significativas infiltrações de células mononucleares estão presentes apenas em Ad-2D6 camundongos infectados (setas simples). Setas indicam Triple maiores infiltrações celulares no parênquima hepático ponte entre vizinhos tratos portais. B: representação por IHQ da fibrose hepática na 4 ª semana após a infecção com o Ad-2D6 ou Ad-controle. As seções a hepáticas tenham sido manchada para colágeno usando um de colágeno anticorpo anti-I. Observação camada de múltiplo de disposição de colágeno sob a cápsula do fígado (setas triplos) com algumas bundles salientes para o parênquima (setas de solteiro) e a presença de grandes aglomerados de células infiltrantes (pontas de seta). Duas seções de fígado representativos são exibidos para cada condição. Bares Tamanho: 100 um.
Uma terceira característica é a geração de altos títulos de anti-CYP2D6 anticorpos, os quais têm uma especificidade epítopo semelhante a humanos LKM-1 anticorpos 6,13. Últimos, hCYP2D6-específicos CD4 e células T CD8 são gerados que predominantemente para casa para o fígado. Tais células hCYP2D6-T específicas pode ser detectada por estimulação com immunodomigrávidas hCYP2D6 peptídeos e subsequente medição de expressão IFNy por uma coloração de citocina intracelular (CIEC) (figura 4). hCYP2D6-células T CD8 específicas matar as células Ad-2D6-infectados-alvo in vivo 12.
Figura 4. hCYP2D6-células T específicas. de análise por citometria de fluxo de células hCYP2D6-T específicas. Linfócitos do fígado têm sido isoladas na semana 4 após a infecção Ad--2D6 e foram estimuladas com quer os CD4 imunodominantes or CD8 hCYP2D6 epítopo durante a noite. Geração de IFNy foi detectada através de coloração citocina intracelular e analisadas por citometria de fluxo utilizando um FACS Canto II (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha). A percentagem de hCYP2D6-específicos CD4 e CD8 células de origem é indicado.
Discussion
Em estudos anteriores, hepatite experimental foi freqüentemente relatado para ser apenas transitórios e muitos modelos atuais para doença hepática auto-imune dependem de uma doença bastante complexos protocolos de indução (para revisões ver 3,5). Por exemplo, vários modelos usar camundongos transgênicos expressando antígenos-alvo específicos e adotivamente transferido alvo antígeno-específicas, na sua maioria TcR-transgênicas células, T 14,15. Muitas vezes, uma infecção adicional com vírus, bactérias ou livertropic parasitas é necessário para induzir a doença 16-18. Alternativamente, o DNA-vacinação com plasmídeos que codificam para antígenos-alvo, incluindo CYP2D6 19, é usado para induzir a hepatite. No entanto, uma vacinação adicional com plasmídeos que codificam para citocinas pró-inflamatórias, tais como a IL-12, é exigido 20. Infelizmente, com raras exceções 15,20 hepatite é apenas transitória.
O modelo CYP2D6 6,21 usa um método simples tPara induzir a hepatite auto-imune, simplesmente infectando camundongos com um adenovírus expressando hCYP2D6, o auto-antígeno importante na AIH-2 7,8. Entrega de CYP2D6 por uma construção adenovírus garante a segmentação direta do fígado, bem como uma inflamação local que promove a quebra de tolerância. É importante notar, contudo, que tanto o título de o vírus, bem como a via de administração é crucial para esse modelo. Por um lado, o Ad-2D6 é um vírus de replicação deficiente, assim, um titer suficiente elevado de vírus é necessária para gerar uma quantidade crítica de antígeno dentro do fígado. Por outro lado, demasiado elevado título de um pode resultar em uma falha de fígado aguda fatal. Além disso, ele tem sido demonstrada anteriormente de que a infecção de camundongos por altos títulos de adenovírus leva a uma exaustão funcional da resposta imune 22. Em nosso modelo, nós usou uma combinação de infecção por via venosa e por via intraperitoneal em fim de se obter tanto a infiltração crônica celular, bem como extfibrose ensive. Temos observado que a infecção por via venosa sozinho ainda faz com que infiltração celular maciço, mas nenhuma fibrose da região subcapsular, indicando que a inflamação peritoneal devido à injecção intraperitoneal pode estar envolvido na o acúmulo contínuo subcapsular de colágeno (Hintermann & Christen, manuscrito em preparação). No entanto, ele é importante para, observe que o fibrose hepática observada é antígeno-específica, desde que nós não detectou a ativação de células estreladas hepáticas e deposição de colágeno após a infecção com igualdade de vírus-títulos de Ad GFP-ou Ad de Controle-23.
O modelo CYP2D6 reflete muitos aspectos de 1,2 AIH humana, tais como hepatite crônica caracterizada por infiltração celular persistente e fibrose hepática 6. Além disso, a presença de alta-título de anti-CYP2D6 anticorpos com especificidade epítopo semelhante e se espalhando 13 a LKM-1 anticorpos encontrados em AIH-2 pacientes indica o présença de uma reatividade crônica auto-imune comum. CYP2D6 é o antígeno importante na AIH-2, mas ele não é reconhecido por pacientes diagnosticados com a mais freqüente AIH tipo 1. Além disso, pacientes que sofrem de outras doenças hepáticas de etiologia auto-imune, tais como cirrose biliar primária (PBC) ou colangite esclerosante primária (PSC), gerar auto-anticorpos característicos com a especificidade de auto-antígenos distintos do fígado e seus fígados mostram diferentes características patológicas centradas no pequeno (PBC ) ou grandes dutos (PSC) biliares. Não obstante, as CYP2D6 modelos oferece a oportunidade de analisar mecanismos imunopatogênicos envolvidos em processos de hepáticas crônicas inflamatórias como ocorrendo durante as doenças hepáticas auto-imunes, para identificar jogadores-chave que impulsionam a destruição auto-imune de hepatócitos e para avaliar possíveis intervenções terapêuticas para curar a doença.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado pela Universidade Goethe de Frankfurt Hospital e uma bolsa da Fundação Alemã de Pesquisa para a UC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 23G needle | BD Biosciences | 300800 | |
| 27½G needle | VWR international | 612-0151 | |
| 30½ G needle | BD Biosciences | 304000 | |
| Alanine aminotransferase test strips (GPT/ALT) | Roche Group | 10 745 138 202 | |
| Aspartate aminotransferase test strips (GOT/AST) | Roche Group | 10 745 120 202 | |
| Anaesthesia Unit Univentor 400 |  AgnTho’s |
||
| Base molds, disposable 37x24x10 mm | VWR international | 720-0208 | |
| Cell strainer 70mm | VWR international | 734-0003 | |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM1850 UV | |
| Heparinized capillary tubes | Fisher Scientific | 3123987 | |
| Microscope slides Superfrost Plus | Menzel-Glaser | J1800AMNZ | |
| Microtainer SST tubes | BD Biosciences | 365951 | |
| Microtiter plates, V-bottom | VWR international | 391-1924 | |
| Reflotron Plus | Roche Group | Determiniation of serum AST / ALT | |
| Rabbit anti-mouse anti-Collagen type I IgG, | Chemicon International | AB765P | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | VC-BA-1000-MC15 | |
| FITC-conjugated anti mouse CD8a antibody | SouthernBiotech | 1550-02 | |
| PE-conjugated anti mouse IFNγ antibody | BD Biosciences | 554412 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD16/CD32 antibody (FcR block) | BD Biosciences | 553141 | |
| Aquatex | VWR international | 1.08562.0050 | |
| Avidin/Biotin Blocking kit | Vector Laboratories | VC-SP-2001-KI01 | |
| Brefeldin A | Sigma-Aldrich | B6542 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138-100MG | |
| DAB substrate kit 3’3’diaminobenzidine | Vector Laboratories | VC-SK-4100-KI01 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Elite ABC Reagent | Vector Laboratories | VC-PK-7100-L050 | |
| Eosin G/Y solution | Carl Roth Gmbh | X883.1 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | |
| Isofluran | Forene | B506 | |
| Meyer’s Hematoxylin solution | AppliChem | A4840,1000 | |
| OCT Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| PBS-buffered formaldehyde 10% | Carl Roth Gmbh | A146.3 | |
| Percoll | Amersham | 17-0891-01 | |
| Roti-Histokit | Carl Roth Gmbh | 6638.1 | |
| RPMI | Invitrogen | 61870 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S7900 |
References
- Manns, M. P. Diagnosis and management of autoimmune hepatitis. Hepatology. 51, 2193-2213 (2010).
- Czaja, A. J., Manns, M. P. Advances in the Diagnosis, Pathogenesis and Management of Autoimmune Hepatitis. Gastroenterology. 4, 429-443 (2010).
- Christen, U., Hintermann, E., Jaeckel, E. New animal models for autoimmune hepatitis. Semin. Liver Dis. 29, 262-272 (2009).
- Christen, U., Holdener, M., Hintermann, E. Animal models for autoimmune hepatitis. Autoimmun. Rev. 6, 306-311 (2007).
- Czaja, A. J.
- Holdener, M. Breaking tolerance to the natural human liver autoantigen cytochrome P450 2D6 by virus infection. J. Exp. Med. 205, 1409-1422 (2008).
- Manns, M. P., Griffin, K. J., Sullivan, K. F., Johnson, E. F. LKM-1 autoantibodies recognize a short linear sequence in P450IID6, a cytochrome P-450 monooxygenase. J. Clin. Invest. 88, 1370-1378 (1991).
- Zanger, U. M., Hauri, H. P., Loeper, J., Homberg, J. C., Meyer, U. A. Antibodies against human cytochrome P-450db1 in autoimmune hepatitis type II. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85, 8256-8260 (1988).
- von Herrath, M. G., Fujinami, R. S., Whitton, J. L. Microorganisms and autoimmunity: making the barren field fertile. Nat. Rev. Microbiol. 1, 151-157 (2003).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S.
- Forbes, N. Morbidity and mortality rates associated with serial bleeding from the superficial temporal vein in mice. Lab. Anim. (NY). 39, 236-240 (2010).
- Ehser, J. Molecular mimicry rather than identity beaks T cell tolerance in the CYP2D6 mouse model for human autoimmune hepatitis. , Forthcoming (2011).
- Hintermann, E. Epitope spreading of the anti-CYP2D6 antibody response in patients with autoimmune hepatitis and in the CYP2D6 mouse model. J. Autoimmun. , Forthcoming (2011).
- Ando, K. Class I-restricted cytotoxic T lymphocytes are directly cytopathic for their target cells in vivo. J. Immunol. 152, 3245-3253 (1994).
- Zierden, M., Kuhnen, E., Odenthal, M., Dienes, H. P. Effects and regulation of autoreactive CD8+ T cells in a transgenic mouse model of autoimmune hepatitis. Gastroenterology. 139, 975-986 (2010).
- Limmer, A. Failure to induce organ-specific autoimmunity by breaking of tolerance: importance of the microenvironment. Eur. J. Immunol. 28, 2395-2406 (1998).
- Voehringer, D. Break of T cell ignorance to a viral antigen in the liver induces hepatitis. J. Immunol. 165, 2415-2422 (2000).
- Derkow, K. Differential priming of CD8 and CD4 T-cells in animal models of autoimmune hepatitis and cholangitis. Hepatology. 46, 1155-1165 (2007).
- Lapierre, P., Djilali-Saiah, I., Vitozzi, S., Alvarez, F. A murine model of type 2 autoimmune hepatitis: Xenoimmunization with human antigens. Hepatology. 39, 1066-1074 (2004).
- Djilali-Saiah, I., Lapierre, P., Vittozi, S., Alvarez, F. DNA vaccination breaks tolerance for a neo-self antigen in liver: a transgenic murine model of autoimmune hepatitis. J. Immunol. 169, 4889-4896 (2002).
- Christen, U., Hintermann, E., Holdener, M., von Herrath, M. G. Viral triggers for autoimmunity: is the 'glass of molecular mimicry' half full or half empty. J. Autoimmun. 34, 38-44 (2010).
- Krebs, P., Scandella, E., Odermatt, B., Ludewig, B. Rapid functional exhaustion and deletion of CTL following immunization with recombinant adenovirus. J. Immunol. 174, 4559-4566 (2005).
- Hintermann, E., Bayer, M., Pfeilschifter, J., Christen, U. Adenoviral delivery of the liver autoantigen cytochrome P450 2D6 chronically activates hepatic stellate cells and induces fibrosis. Manuscript Submitted. , (2011).
