Summary
조혈을위한 3D 문화 시스템은 인간 코드 혈액과 leukemic 골수 세포를 사용하여 설명합니다. 방법은 세포외 기질 단백질로 코팅 다공성 합성 폴리 우레탄 발판의 사용을 기반으로합니다. 이 발판은 세포의 광범위한 수용하는 적응이다.
Abstract
골수 (BM)은 spatially 조직 세포 microenvironments에 의해 규제되는 복잡한 입체 (3D) 조직이 어떤 점에서의 조혈입니다 틈새에게 2-4 되나, 조혈 줄기 세포는 혈액 세포 형성 1을 유지하기 위해 독특한 microenvironment를 필요로합니다. BM 틈새의 조직은 정상 또는 악성 BM 5의 기능 또는 기능 장애에 중요합니다. 따라서 전직 생체내의 흉내를 사용하여 생체내 microenvironment에의 이해 우리 leukemogenesis 6, 분자 세포 및 microenvironmental determinants을 명료하게하다 도움이 될 것이다.
현재 조혈 세포 중 allogenic 또는 이종 개체의 stromal 세포와 공동의 문화 또는 외인성 크린 시토킨 8의 추가 요구 (2D) 2 차원의 조직 문화 flasks / 잘 접시 7에서 체외에서 배양해 있습니다. 이러한 조건 인공 있으며 생체내에 따라 다를 9,10의 분화 및 손실을 초래할 수있는 비정상적으로 높은 시토킨 농도로 세포를 노출 점에서 microenvironment.
여기, 우리는 생체내 3D 성장 환경에서을 시뮬레이션 및 외인성 성장 요인 부재에 multilineage의 조혈을 지원하는 새로운 3D 골수 배양 시스템을 제시한다. 폴리 우레탄 (PU)으로 만들어진이 시스템에 사용되는 높은 다공성 발판은 2D 11에서 기존의 단일층 문화보다 높은 특정 표면 영역에 걸쳐 고밀도 세포 성장을 용이하게합니다. 우리의 연구는이 모델은 인간의 탯줄 혈액 (CB) mononuclear 세포 (MNC) 외인성 크린 시토킨의 부재에서 12 일차 leukemic 세포의 성장을 지원하는 것을 시사하고있다. 이 소설 차원 흉내는 조혈을 연구하고 백혈병에 대한 새로운 치료법을 탐구하는 인간의 실험적인 모델의 개발을위한 실행 가능한 플랫폼을 제공합니다.
Protocol
1. 공사장 공중 발판의 발판 제조 및 바이오 작용화
- 배양 접시 디스크의 형태로 우레탄 공사장 공중 발판 (기공 크기 1백~2백50밀리미터, 다공성 90~95%)를 조작하려면 다음 폴리머 솔루션 (Dioxan에서 5wt %)를 준비하여 열 유도된 상 분리에게 13 프로세스를 사용하여 동결 이후 용매 승화 (그림 1A).
- ECM 단백질 (그림 1B)와 코팅 이전 0.5 X 0.5 X 0.5 mm의 조각으로 발판 디스크를 자르고.
- 다음 1 분 및 인산으로 전송을 위해 에탄올 (70 %)에서 그들을 immersing하여 사전 서부 유럽 표준시 공사장 공중 발판은 20 분 동안 (PBS) 염분 버퍼. 그렇다면 3,630 XG에 10 분 동안 원심 분리기와 단백질 솔루션을 추가합니다.
- 20 분 대한 1,420 XG에서 단백질 용액에 공사장 공중 발판을 원심 분리기.
- 표면 모공 차단을 해제하고, 발판에 깊이 침투하는 놓는 세포를 허용하기 위해서는 10 분 동안 910 XG에 한 번만 더 공사장 공중 발판 원심 분리기PBS 인치
- 에탄올 2 H (70 %)에 대한 침수와 230 V, 50 Hz에서, 0.14, 자외선 램프,시 8 분 노출의 조합을 사용하여 공사장 공중 발판을 소독. 그 후, 30 % 태아 소 혈청 (FBS) 및 1퍼센트 페니실린과 스트렙토 마이신 (P / S)와 함께 보충 Iscove의 수정일 Dulbecco 중간 (IMDM)를 추가하기 전에 PBS로 두 번 공사장 공중 발판을 씻는다. ° C에서 5 % CO 2는 이전에 사용하기 37 3 일간 humidified 인큐베이터에서 공사장 공중 발판을 놓으십시오. 멸균 공사장 공중 발판은 24 잘 조직 배양 플레이트 (물론 당 하나 비계)에 배치됩니다.
2. Mononuclear 세포 분리 및 비계를 심는
- Ficoll-Paque 밀도 기울기 원심 분리 (1500 rpm으로 35 분) (그림 1C)를 사용하여, 코드 혈액 또는 leukemic 골수 샘플로부터 인간 MNC의 압축을 풉니다.
- IMDM의 Resuspend MNC 30 % FBS와 1 % P / S.를 포함하는
- 마이크로 피펫을 사용하여 공사장 공중 발판쪽으로 MNC 서스펜션의 종자 100μl (2 × 10 6 세포 / 비계).
- 공사장 공중 발판으로 정착하는 세포에 대해 10 분 동안 5 % CO 2 하에서 37 ° C에서 씨앗을 품고 공사장 공중 발판을 품어.
- 37시 인큐베이터 30 % FBS와 1 % P / S와 장소도 접시를 포함 IMDM 1.5 ML 각 잘 더더 이동 ° C와 실험 기간 동안 5퍼센트 CO 2.
- 씨앗을 품고 공사장 공중 발판은 모든 미디어 일일 변경될 받고있다.
3 원위치 세포 증식과 형태론의 경우 :. MTS, SEM 및 Cytospins
- MTS 분석 : 문화 한 해제 번시드인하고 깨끗한 24 개의 새 항목 잘 플레이트에서 두 씨앗을 품고 공사장 공중 발판과 장소에서 제거합니다. 미디어 1 ML 37에서 MTS 솔루션 및 3 시에위한 품어 200 μl를 추가 ° C에서 5 % CO 2.
- microplate 판독기를 사용하여 490 nm의시 96 - 웰 플레이트 및 측정 흡광도에서 개최하며 뜨는에서 8 X 100 μl 샘플을 가져가라.
- 일 중 다른 시간 시점 : 전자 현미경 (SEM)을 스캔전자 문화, 미디어에서 MNC로 놓는 공사장 공중 발판을 제거하고 4에 40 분 2.5 % PBS 버퍼 글루 타 알데히드 용액 ° C로 고정 후 PBS로 두 번 씻는다.
- 탈수 4 시간 동안 무균 환경에서 10 분 건조를위한 에탄올의 등급 시리즈 (25, 50, 70, 80, 90, 95 및 100 %), 각각의 공사장 공중 발판.
- 섹션 표본 후 사전 SEM 평가 2 분 아르곤 분위기 속에서 금을 스퍼터 코팅 그들은 20 kV의 가속 전압을 사용합니다.
- Cytospins : 문화에서 다른 시간 시점에서 발판에서 세포를 aspirating하여 2.0 X 10 4 세포 / 슬라이드를 수집합니다.
- 1,500 RPM에서 3 분 유리 슬라이드에 세포를 원심 분리기.
- 라이트-Giemsa 수정된 청바지와 광학 현미경을 사용하여 관찰과 함께 슬라이드를 청바지. 소프트 이미징 시스템은 사진을 찍는하는 데 사용할 수있는 F-봅니다.
- 현미경 관찰 이전 슬라이드를 씻으십시오.
- M ultiphoton 분석 : 자세한 분석 시까지 -20시 에탄올 증기 (70 %) 숙박 후 건조하고 매장 ° C와 다른 시간 지점에서 픽스 공사장 공중 발판. 이전 multiphoton 현미경의 30 μm의 두께의 슬라이드로 섹션 비계 및 PBS와 젖은와 시각화합니다.
- 상온에서 30 분 10 % 태아 소 혈청으로 PBS에 씨앗을 품고 공사장 공중 발판을 차단합니다.
- 마우스 안티 인간 CD71를 : ° C ~ 어둠 속에서 기본 단클론 항체의 1시 50분 희석과 4에서 공사장 공중 발판이 하룻밤 사이에 알을 품다.
- PBS에서 샘플을 세 번 씻고 이차 항체에 얼룩 : 어둠의 실온에서 1 H를위한 안티 마우스 알렉사 형석 488.
- PBS로 샘플을 세 번 씻고 물 방출 x60 목표 렌즈를 사용 공촛점 현미경으로 관찰합니다.
- 형광단 알렉사 형석 488은 타악기 레이저로 488 nm의에서 흥분한다. Volocity 5.3.2 소프트웨어는 이후의 이미지 분석에 사용될 수 있습니다.
- 흐름 cytometer (FC)의 세포 분석하기 전에 검출에 해당 immunofluorescence 항체와 관심 세포에 라벨을 달고. 샘플의 수를 검출을위한 선택된 항체에 따라 준비가되어 있습니다. MNC 검출 항체의 경우 다음과 같은 조합이 사용됩니다 : CD45-FITC/CD71-PE/CD235a-PE-Cy5.
- 다른 시간 지점과 원심에 있던 발판에서 세포를 기음. 100 μl FC 완충액 (PBS + 0.1 % 나트륨 azide)에서 6 1x10 주변 세포의 세포 펠렛를 해산하고 각 항체 형광 색소의 10 μL를 추가합니다. 4에 30 분 ° C에 대해 세포를 품어, PBS로 두 번 씻어 마침내 FC 버퍼에 다시 일시 중지합니다.
- 항체 표현의 "부정적"를 설정하고 흐름 cytometer 컨트롤과 함께 검출 채널을 교정 isotype 제어 흐름 cytometer의 스테인드로 샘플을로드합니다.
- 샘플 스테인드 w 읽기 세 가지 다른 항체 ith 그리고 마지막 WinList 소프트웨어를 사용하는 데이터를 나타냅니다.
5. 대표 결과
외인성 성장 요인 이외없이 조혈 세포 성장 속도론의 예제는 그림 2에 표시됩니다. 조혈의 이질적인 성격, 서로 다른 두 가지 세포로 인해 : 정상과 비정상 조혈 세포는 그림하고 있습니다. 그림 2A에서 인간 CBMNC의 세포 증식은 문화가 28 일 후에 분명하다. 그림 2B는 인간의 기본 leukemic 세포를 사용하여 흉내의 성장 속도론을 보여줍니다. 세포의 증식은 흡광도와 관련하여 세포 신진 대사 활동을 측정하는 MTS 분석을 사용하여 평가된다. 두 경우 모두, 세포가 확산하고 모델에서 설립. 성장 속도론의 차이가 관찰되며, 문화를 구축 정상 조혈 세포를 빠르게 leukemic 세포보다.
공사장 공중 발판의 _content "> 외인성 성장 요인 부재의 문화의 28 일 정상 조혈 세포 (그림 3A)와 leukemic 세포 (그림 3B)의 전형이었다 후에도 수확 세포의 형태. 중앙 부분은 후 SEM으로 분석되었다 공사장 공중 발판은 문화에서 제거하고 클러스터에와 "틈새 같은"구조 (그림 3A '& B')에서 자신을 설립, 발판에 걸쳐 씨앗을 품고 세포의 확산을 보여주되었다. 그림 C는 보여준다 unseeded의 기공 크기와 분포 비계는 컨트롤로 사용됩니다. 28일 후 Multiphoton 현미경은 원래의 장소에 3D 발판 내에서 세포의 분포를 강조하기 위해 사용하고 마커의 표현에 의해 (그림 4) 비계의 중앙 섹션에 erythroid 섬의 존재를 보여주되었다 erythroblasts에 긍정적이다. CD71 이것은 성숙하고 성숙 세포 뒤의 중요성을 증명링 적혈구 조혈. 인간 CBMNCs 및 그림 5B 비정상 조혈 세포 설명 : 기본 leukemic 세포를 마지막으로, 세포 사전 시딩의 유동세포계측법 그래프는 그림 5A가 정상 조혈 세포를 대표하는 조혈 세포의 표현형의 차이를 보여줍니다. CD235a의 수준 + 및 CD45 + 각각 leukemias의 hemoblastic 성격을 강조 leukemic보다 일반적인 샘플에 높은 있습니다 적혈구 및 leukocytes에 대응.
그림 1. 우레탄 발판 제조 및 바이오 작용화에 관련된 프로세스의 삽화. ) 우레탄은 Dioxan (5wt %)에 녹아 있으며, 열 유도된 상 분리 공정 및 후속 용매 승화하여 발판 Safinia 외 13에서 설명한 바와 같이, 생산하고 있습니다. B) 비계 디스크는 다음 INT 절단되어O 장치의 큐브 0.5 X 0.5 엑스트라 셀룰러 매트릭스 (ECM) 단백질과 원심 분리에 의해 코팅 X 0.5 mm 후. C) MNC는 인간의 탯줄 CB이나 micropipette으로 밀도 구배 원심 분리 및 우레탄 공사장 공중 발판에 씨앗을 (2x10 6 셀 / 비계)를 사용 BM 흡출됨으로써 압축이 풀립니다.
. 그림 2 세포 증식은 MTS 분석을 사용하여 측정 :) 인간의 탯줄 혈액 MNCs 사용하는 인간의 기본 leukemic 세포를 사용하여) B를. 외인성 크린 시토킨의 추가없이 우레탄 공사장 공중 발판에 놓는 때 열은 시간에 따른 세포의 성장을 보여줍니다.
그림 3 : 공사장 공중 발판 주위 세포 형태학 및 유통이 scanni를 cytospins를 사용하여NG 전자 micrographs. (AB) 문화의 28 일 후에 우레탄 공사장 공중 발판에서 수집한) 코드 혈액 mononuclear 세포의 대표 라이트-Giemsa 스테인드 cytospins 및 B) 뼈 aspirated leukemic 세포 문화 날로부터 14 일 후 우레탄 공사장 공중 발판에서 수집했습니다. 두 실험 시토킨 자유로운 상태로 진행되었다. (A'-B ')) 씨앗을 품고 코드 혈액 MNCs와 B') 28 일 동안 배양해 거쳐 leukemic 세포없이 세포와 C) 제어 비계의 우레탄 발판 SEM의 micrographs 대표 중앙 섹션 '.
그림 4. erythroid 마커 CD71과 문화와 스테인드 28 D 후 탯줄 혈액 MNCs와 우레탄 발판 씨앗의 Multiphoton의 현미경.
그림 5. 유동세포계측법 3D 도트 플롯은 CD45, CD71 및 CD235a 표면 발현 마커에 대해 묻다. 얻은 isotype 컨트롤도 상대 형광 강도의 비교를 위해 제공됩니다. 패널은 위의 마커에 대한 긍정적인 인간 코드 혈액 mononuclear 세포를 보여줍니다, 패널 B는 인간의 기본 leukemic 세포를 보여줍니다.
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Discussion
여기서 제시 전직 생체내 3D 문화 시스템은 우리가 조혈의 3D biomimicry를 확립 수 있도록 그 recapitulates 원래 BM 건축과 외인성 크린 시토킨의 독립 세포 표현형. 3D 모델은 구조와 정상 및 비정상 조혈 세포가 생체내에 발생한 것과 유사한 조건에서 분아 따위에 의해 중식 수 microenvironment를 제공합니다.
고분자 비계 재료의 선택 biomimicry 디자인에 중요한 단계를 나타낸다. biomaterials의 중요 장점은 필요한 건축, 구조적 속성과 필요한 biosignals을 제공하여 생체내 환경을 모방 고분자에 점점 관심을 이끌고있다. 그들의 즉각적인 환경에 민감 살아있는 세포와 직접 접촉에 항상 있기 때문에 고분자는 biomedicine 그들의 응용에 필수적인 최소 요구 사항을 충족해야합니다. 일반적으로 전거래 발판이 정의된 3 차원 구조, 부피 비율 및 재현성 제조 당 높은 표면적을 유지할 수있는 충분한 기계적 강도와 높은 다공성, biocompatible 있어야합니다. 높은 다공성과 기계적 강도가 적응과 팁 과정에서 담금질 온도에 따라 변경될 수 있지만 우레탄 함께 모든 속성으로 구성됩니다. 결과적으로,이 biomimicry이 증가하거나 필요에 따라 다공성 및 기공 크기를 감소시킴으로써 세포의 다른 유형에 적응하실 수 있습니다.
본 실험의 발판 ECM 단백질 콜라겐 유형 I로 코팅되어,이 단백질은 서로 다른 ECM 단백질과 우리의 3D 모델 11과 함께 이전에 테스트되었습니다. 이것은 콜라겐 유형 I은 세포 접착을 가속하고 그 이유로 선정되었다 보여주었다. 코팅 연구되고있는 세포의 종류에 따라 서로 다른 ECM 단백질을 사용하여 수정할 수 있습니다. 합성에 ECM 단백질을 통합할 수있는 이점은 내가이 공사장 공중 발판의 그뿐만 아니라 그들이 세포 접착을위한 셀 바인딩 순서를 제공할뿐만 아니라, 다른 ECM 단백질을하기 때문에 더 나은 세포의 성장과 성숙시킨 결과 세포 접착력을 향상시키는 세포의 바인딩을 안정 성장 요인과 상호 작용과 이차 상호 작용을 제공합니다.
많은 연구는 2D 및 3D 시스템 모두를 사용하는 예 생체내의 조혈이 완료되었습니다, 그리고 그들 모두는 외인성 크린 시토킨의 비정상적으로 높은 농도를 추가할 수 있습니다. 이러한 연구는 조혈의 분자 determinants을 명료하게하다하는 데 도움이 있지만,이 과정에 필수적인 세포와 microenvironmental 요소는 다음과 같은 기술의 한계를 기반으로 해독할 어렵게되었습니다.
방법은 여기서 설명, BM의 biomimicry는 ECM 코팅과 더불어 높은 다공성 고분자 비계로 만든 것은 유지하며없이 정상과 비정상 조혈의 성장을 안정화 최적입니다크린 시토킨의 이외의 필요성. 흉내는 정상과 비정상 조혈 전직의 생체내의 메커니즘으로 약물 발견과 과학적 연구를위한 플랫폼으로 사용하는 데 적합한 체제를 렌더링 멀티 직계 조혈을 지원합니다.
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Disclosures
우리는 공개 할게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 리처드 토마스 Leukaemia 기금, 레이디 타타 기념관 신탁, Northwick 공원 병원 Leukaemia 연구 신탁 기금 및 건강 연구의 국립 연구소 (NIHR), 영국에 의해 재정 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dioxan | Invitrogen | D20,186-3 | |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-094 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440-053 | |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| MTS | Promega Corp. | G3580 | |
| Glutaraldehyde | Fluka | 49624 | |
| Wright-Giemsa | Sigma-Aldrich | WG32 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 10108-165 | |
| CD71 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-32272 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| CD45-FITC | BD Biosciences | 74895 | |
| CD71-PE | BD Biosciences | 555537 | |
| CD235a-PE-Cy5 | BD Biosciences | 555570 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S-8032 |
References
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