Summary
Et 3D dyrkningssystem for hematopoiese er beskrevet under anvendelse af humant navlestrengsblod og leukæmiske knoglemarvsceller. Fremgangsmåden er baseret på anvendelsen af en porøs syntetisk polyurethan skelet overtrukket med ekstracellulære matrix-proteiner. Dette skelet kan tilpasses til at rumme en lang række celler.
Abstract
Hæmatopoietiske stamceller kræver en unik mikromiljø for at opretholde blodlegemer dannelse 1 knoglemarven (BM) er en kompleks tredimensional (3D) væv, hvori hæmatopoiese reguleres ved rumligt arrangeret cellulære mikromiljøer betegnet nicher 2-4. Organiseringen af BM nicher er afgørende for funktionen eller dysfunktion af normal eller ondartet BM 5. Derfor er en bedre forståelse af in vivo mikromiljø ved hjælp af et ex vivo mimicry ville hjælpe os med at belyse de molekylære, cellulære og microenvironmental determinanter for leukemogenesis 6.
Dag, er hæmatopoietiske celler dyrket in vitro i todimensionale (2D) vævskulturkolber / brønd plader 7, som kræver enten co-kultur med allogen eller xenogene stromale celler eller tilsætning af exogene cytokiner 8. Disse betingelser er kunstige og adskiller sig fra in vivo 9,10.
Heri, præsenterer vi en hidtil ukendt 3D knoglemarv kultur, der simulerer in vivo-3D vækst og understøtter multilineage hæmatopoiese i fravær af exogene vækstfaktorer. Den meget porøse stillads anvendes i dette system er fremstillet af polyurethan (PU), letter høj tæthed cellevækst over et større specifikt overfladeareal end det konventionelle monolagskultur i 2D 11. Vores arbejde har vist, at denne model understøttede væksten af humant navlestrengsblod (CB) mononukleære celler (MNC) 12 og primære leukæmiske celler i fravær af exogene cytokiner. Denne hidtil ukendte 3D mimicry tilvejebringer en platform for udviklingen af et humant eksperimentel model til at studere hæmatopoiese og til at undersøge hidtil ukendte behandlinger for leukæmi.
Protocol
1. Stillads Fremstilling og Bio-funktionalisering af Stilladser
- Til fremstilling af PU scaffolds (porestørrelse 100-250 mm, porøsitet 90-95%) i form af petriskålen diske, anvende termisk induceret faseseparation 13 processen ved fremstilling af en polymeropløsning (5 vægt% i dioxan) efterfulgt af frysning og efterfølgende Opløsningsmidlet sublimation (figur 1A).
- Skær stilladset disken i terninger på 0,5 x 0,5 x 0,5 mm før coating med ECM-proteiner (figur 1B).
- Præ-befugte scaffolds ved at neddyppe dem i ethanol (70%) i 1 minut og derefter overføre i phosphatbufret saltvand (PBS) i 20 min. Centrifugeres i 10 minutter ved 3630 x g, og der tilsættes proteinopløsningen.
- Centrifuger stilladser i proteinindhold opløsningen ved 1420 xg i 20 minutter.
- For at fjerne blokeringen af overfladeporer, og tillader celler podet til at trænge dybere ind i stilladset, centrifugeres skeletterne endnu en gang ved 910 x g i 10 minutteri PBS.
- Sterilisere scaffolds ved hjælp af en kombination af 8 min eksponering ved 230 V, 50 Hz, 0,14 A, UV-lampe med nedsænkning i 2 timer i ethanol (70%). Efter at vaske stilladser to gange i PBS før tilsætning af Iscoves modificerede Dulbeccos medium (IMDM) suppleret med 30% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin og streptomycin (P / S). Placere stilladser i en befugtet inkubator i 3 dage ved 37 ° C og 5% CO2 før brug. Sterile stilladser er placeret i en 24-brønds-vævskulturplader (et stillads per brønd).
2. Mononukleære celler Isolering og Scaffold Seeding
- Uddrag human MNC fra navlestrengsblod eller leukæmiske knoglemarvsceller prøver under anvendelse af Ficoll-Paque densitetsgradient centrifugering (35 minutter ved 1500 rpm) (figur 1C).
- Resuspender MNC i IMDM indeholdende 30% FBS og 1% P / S.
- Frø 100 pi af MNC suspension (2 x 10 6 celler / stilladsdele) på stilladserne anvendelse af en mikro-pipette.
- Inkubér podede scaffolds ved 37 ° C under 5% CO2 i 10 minutter for cellerne at løse i skeletterne.
- Påfyldning hver brønd med 1,5 ml IMDM indeholdende 30% FBS og 1% P / S og anbringes brøndsplader i inkubatoren ved 37 ° C og 5% CO2 i eksperimentets varighed.
- De podede stilladser gennemgår daglig skift af alle medier.
3 I situ celledeling og Morfologi:. MTS, SEM og cytospiner
- MTS analysen: Fjern fra kultur en un-seedede og to seedede stilladser og anbringes i en ren ny 24 vel-plade. Tilsæt 1 ml medium og 200 ul af MTS opløsningen og inkuberes i 3 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Tage 8 x 100 ul prøver fra supernatanten; sted i en 96-brønds plade og måling af absorbansen ved 490 nm under anvendelse af en mikropladelæser.
- Scanningselektronmikroskopi (SEM): På forskellige tidspunkter i the kultur fjernes scaffolds podet med MNC fra medierne, og fastgøres med 2,5% PBS-bufret glutaraldehyd-opløsning i 40 minutter ved 4 ° C, derefter vaskes to gange med PBS.
- Dehydreret stilladserne på en gradueret serie af ethanol (25, 50, 70, 80, 90, 95 og 100%), hver i 10 minutter og tørres i et aseptisk miljø i 4 timer.
- § prøver og derefter sputter-coat dem med guld i en argon atmosfære i 2 min før SEM evaluering, skal du bruge en acceleration spænding på 20 kV.
- Cytospins: Collect 2,0 x 10 4 celler / objektglas ved sugning cellerne fra stilladset på forskellige tidspunkter i kulturen.
- Centrifugeres cellerne på et objektglas i 3 minutter ved 1500 rpm.
- Plet objektglassene med Wright-Giemsa-farve Modificerede og observere ved anvendelse af et optisk mikroskop. F-se Soft Imaging System kan bruges til at tage billeder.
- Vask glider før mikroskop observation.
- M ultiphoton analyse: Fix stilladser på forskellige tidspunkter med ethanol damp (70%) natten over og derefter tørre og opbevares ved -20 ° C indtil videre analyse. Forud for visualisering med multiphoton mikroskopet afsnittet stillads til 30 um tykke slides og våd med PBS.
- Blokere podede skeletter i PBS med 10% føtalt bovint serum i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Inkuber scaffolds natten over ved 4 ° C i mørke med en 1:50 fortynding af primært monoklonalt antistof: muse anti-human CD71.
- Vaskes prøverne tre gange i PBS og farves med det sekundære antistof: anti-muse Alexa Fluor 488 i 1 time ved stuetemperatur i mørke.
- Vaskes prøverne tre gange med PBS og observere med et konfokalt mikroskop under anvendelse af en vand-emission x60 objektiv.
- Fluoroforen Alexa Fluor 488 er begejstret ved 488 nm af den pulserende lasere. Volocity 5.3.2 software kan anvendes til efterfølgende billedanalyse.
- Før celleanalyse i flowcytometer (FC), mærke cellerne af interesse med de tilsvarende immunofluorescens antistoffer til påvisning. En række prøver fremstillet ifølge de valgte antistoffer til påvisning. For MNC detektion følgende kombination af antistoffer anvendes: CD45-FITC/CD71-PE/CD235a-PE-Cy5.
- Indsuges celler fra stilladset på forskellige tidspunkter og centrifugeres. Opløse en cellepellet på ca 1x10 6 celler i 100 pi FC-puffer (PBS + 0,1% natriumazid), og der tilsættes 10 uL af hvert antistof fluorescerende farvestof. Inkubér cellerne i 30 minutter ved 4 ° C, vaskes to gange med PBS og til slut fornyet suspension i FC-puffer.
- Indlæse prøven i flowcytometret farvet med isotypekontrol at indstille "negativitet" af antistofekspression og kalibrere påvisning kanaler med flowcytometer kontrol.
- Læs prøven farves w i'te de tre forskellige antistoffer og endelig repræsenterer dataene i vha. WinList software.
5. Repræsentative resultater
Et eksempel på hæmatopoietiske cellulære vækstkinetik uden tilsætning af exogene vækstfaktorer, er vist i figur 2. På grund af den heterogene karakter af hæmatopoiese, to forskellige celler: normale og unormale hæmatopoietiske celler illustreret. I figur 2A er cellulær proliferation af human CBMNC tydelig efter 28 dage i kultur. Figur 2B viser vækstkinetik i mimicry anvendelse af humane primære leukæmiske celler. Cellulær proliferation vurderes ved anvendelse af MTS-assay, der måler cellulær metabolisk aktivitet i forhold til absorbans. I begge tilfælde, prolifererede cellerne og er etableret i modellen. Forskelle i vækst kinetik overholdes; normale hæmatopoietiske celler etablerer kulturen hurtigere end de leukæmiske celler.
_content "> Morfologien af de høstede celler, selv efter 28 dages dyrkning i fravær af exogene vækstfaktorer var typisk for normale hæmatopoietiske celler (figur 3A) og leukæmiske celler (fig. 3B). centrale sektioner af skeletterne blev analyseret ved SEM efter stilladser blev fjernet fra kulturen og viste spredning af de podede celler i hele stilladset, etablere sig i klynger og i "niche-lignende" strukturer (fig. 3A '& B "). Figur C viser porestørrelse og distribution i en upodet stillads anvendt som en kontrol. multifoton mikroskopi efter 28 dage blev anvendt til at fremhæve fordelingen af cellerne i 3D stilladset in situ, og det viste tilstedeværelse af erythroide øer centrale sektioner af stilladset (fig. 4) ved ekspression af markøren CD71 hvilket er positivt i erytroblaster. Dette viser vigtigheden af at modne og forfaldne celler during erythropoiese. Endelig, flowcytometri grafer af celler før podning viser forskellen i fænotypen af hæmatopoietiske celler, hvor figur 5A repræsenterer normale hæmatopoietiske celler: humane CBMNCs og 5B illustrerer abnorme hæmatopoietiske celler: primære leukæmiske celler. Niveauer af CD235a + og CD45 + svarende til erythrocytter og leukocytter henholdsvis er højere i den normale prøve, end i leukæmiske fremhæve hemoblastic art leukæmier.
Figur 1. Illustration af de processer, der er involveret i PU stillads fremstilling og bio-funktionalisering. A) PU opløses i dioxan (5 vægt%) og med termisk induceret faseseparation og den efterfølgende opløsningsmiddel sublimation stilladset fremstilles som beskrevet af Safinia et al 13. B) Stilladset skive skæres derefter into terninger 0,5 x 0,5 x 0,5 mm og derefter overtrukket ved centrifugering med ekstra cellulære matrix (ECM)-proteiner. C) MNC er ekstraheret fra human umbilical CB eller BM aspiration med densitetsgradient centrifugering og podet (2x10 6 celler / stilladsdele) i PU stilladser med en mikropipette.
. Figur 2 Cellulær proliferation målt ved anvendelse af MTS-assay: A) under anvendelse af humant navlestrengsblod MNC'er, B) under anvendelse af humane primære leukæmiske celler. Søjlerne viser væksten af celler over tid, når podet i PU stilladser uden tilsætning af exogene cytokiner.
Figur 3: cellemorfologi og omkring de scaffolds ved hjælp cytospins, scanning elektronmikrofotografier. (AB) Repræsentative Wright-Giemsa-farvede cytospins af a) fra navlestrengsblod mononukleære celler opsamlet fra PU scaffolds efter 28 dages dyrkning, og B) ben aspireres leukæmiske celler opsamlet fra PU scaffolds efter 14 dages dyrkning. Begge eksperimenter blev udført i cytokin fri tilstand. (A'-B ") Repræsentative centrale dele af de PU scaffold SEM-mikrografer af A ') podet navlestrengsblod MNC'er og B') leukæmiceller Efter dyrkning i 28 dage, og C) kontrol skelet uden celler.
Figur 4. Multiphoton mikrograf af en PU stillads podet med navlestrengsblod multinationale selskaber efter 28 d i kultur og farvet med den erythroide markør CD71.
Figur 5. flowcytometri 3D dot-plots farves for CD45, CD71 og CD235a overflade udtryk markører. Den isotype opnåede kontrol præsenteres også til sammenligning af den relative fluorescensintensitet. Panel A viser humane navlestrengsblod mononukleære celler positive for disse markører; Panel B viser humane primære leukæmiske celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den ex vivo 3D-kultur-systemet præsenteres her, giver os mulighed for at etablere en 3D biomimetik af hæmatopoiese at rekapitulerer den oprindelige BM arkitektur og cellulær fænotype uafhængig af eksogene cytokiner. 3D-modellen tilvejebringer strukturen og mikromiljøet som muliggør normal og unormal hæmatopoietiske celler til at proliferere under betingelser svarende til dem, der findes in vivo.
Udvælgelsen af det polymere skelet materiale var et kritisk trin i biomimetik design. Vigtige fordele i biomaterialer have medført en stigende interesse for polymerer, der efterligner in vivo-miljøet ved at tilvejebringe den ønskede struktur, strukturelle egenskaber og de nødvendige biosignaler. Polymererne skal opfylde minimumskravene væsentlige for deres anvendelse i biomedicin, fordi de altid er i direkte kontakt med levende celler, som er følsomme over for deres umiddelbare omgivelser. I almindelighed vil enomhandler stillads være biokompatibelt, højporøst med tilstrækkelig mekanisk styrke til at opretholde en fastlagt 3D-struktur, højt overfladeareal per volumenforhold og reproducerbar fremstilling. PU omfatter alle disse egenskaber sammen, selv om den høje porøsitet og mekanisk styrke kan tilpasses og ændres afhængigt quenching temperatur under TIPS processen. Som et resultat kan denne biomimetik tilpasses til andre typer af celler ved at forøge eller formindske porøsitet og porestørrelse efter behov.
Stilladset i dette eksperiment er belagt med ECM proteinet kollagen type I, hvilket protein blev sammen med andre ECM-proteiner testet som tidligere med vores 3D-model 11. Dette viste, at kollagen type I accelererede celle adhæsion og blev valgt af den grund. Overtrækket kan modificeres ved anvendelse af forskellige ECM-proteiner afhængig af typen af celler, der bliver undersøgt. Den fordel at indarbejde ECM-proteiner til det syntetiske stilladser is at ikke blot de giver cellebindende sekvens for celleadhæsion, men også giver sekundære interaktioner med andre ECM-proteiner og interaktioner med vækstfaktorer, der stabiliserer bindingen af cellerne og dermed øge celleadhæsion, hvilket resulterer i bedre celle vækst og modning.
Talrige undersøgelser er blevet udført på ex vivo bloddannelsen bruge både 2D og 3D-systemer og alle dem omfatter tilføjelsen af unormalt høje koncentrationer af eksogene cytokiner. Disse undersøgelser har bidraget til at belyse de molekylære determinanter for hematopoiese, men de cellulære og microenvironmental elementer udgør en del af denne proces har været vanskeligt at dechifrere baseret på begrænsningerne af de samme teknikker.
Den her beskrevne fremgangsmåde, en biomimetik af BM fremstillet af et højporøst polymert skelet koblet med ECM overtræk er optimal for opretholdelse og stabilisering af væksten af normale og unormale hæmatopoiese udenbehovet for nogen tilsætning af cytokiner. Den mimicry understøtter multi-lineær bloddannelsen gør det egnet til brug som en platform for lægemiddelforskning og videnskabelig undersøgelse af mekanismerne for normale og unormale hæmatopoese ex vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af Richard Thomas Leukæmi fonden, Lady Tata Memorial Trust, Northwick Park Hospital Leukæmi Research Trust Fund og National Institute of Health Research (NIHR), England.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dioxan | Invitrogen | D20,186-3 | |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-094 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440-053 | |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| MTS | Promega Corp. | G3580 | |
| Glutaraldehyde | Fluka | 49624 | |
| Wright-Giemsa | Sigma-Aldrich | WG32 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 10108-165 | |
| CD71 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-32272 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| CD45-FITC | BD Biosciences | 74895 | |
| CD71-PE | BD Biosciences | 555537 | |
| CD235a-PE-Cy5 | BD Biosciences | 555570 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S-8032 |
References
- Orkin, S., Zon, L. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
- Spradling, A., Drummond-Barbosa, D., Kai, T. Stem cells find their niche. Nature. 414, 98-104 (2001).
- Panoskaltsis, N., Mantalaris, A., Wu, D. Engineering a mimicry of bone marrow tissue ex vivo. J Biosci. Bioeng. 100, 28-35 (2005).
- Lo Celso, C. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
- Mantalaris, A., Bourne, P., Wu, J. Production of human osteoclasts in a three-dimensional bone marrow culture system. Biochem. Eng. J. 20, 189-196 (2004).
- Placzek, M. Stem cell bioprocessing: fundamentals and principles. J. R. Soc. Interface. 6, 209-232 (2009).
- Dexter, T., Testa, N. Methods in Cell Biology. Prescott, D. 14, Academic Press Inc. New York. 387-405 (1976).
- Piacibello, W. Differential growth factor requirement of primitive cord blood hematopoietic stem cell for self-renewal and amplification vs proliferation and differentiation. Leukemia. 12, 718-727 (1998).
- Yoshida, T., Takagi, M. Cell processing engineering for ex vivo expansion of hematopoietic cells: a review. Biochemical Engineering Journal. 20, 99-106 (2004).
- Lim, M. Intelligent bioprocessing for haemotopoietic cell cultures using monitoring and design of experiments. Biotechnol. Adv. 25, 353-368 (2007).
- Mortera-Blanco, T., Mantalaris, A., Bismarck, A., Panoskaltsis, N. The development of a three-dimensional scaffold for ex vivo biomimicry of human acute myeloid leukaemia. Biomaterials. 31, 2243-2251 (2010).
- Mortera-Blanco, T., Mantalaris, A., Bismarck, A., Aqel, N., Panoskaltsis, N. Long-term cytokine-free expansion of cord blood mononuclear cells in three-dimensional scaffolds. Biomaterials. 32, 9263-9270 (2011).
- Safinia, L., Datan, N., Hohse, M., Mantalaris, A., Bismarck, A. Towards a methodology for the effective surface modification of porous polymer scaffolds. Biomaterials. 26, 7537-7547 (2005).
