Summary
Hematopoiesis के लिए एक 3 डी संस्कृति प्रणाली मानव गर्भनाल रक्त और leukemic अस्थि मज्जा की कोशिकाओं का उपयोग वर्णित है. विधि बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के साथ लेपित एक झरझरा सिंथेटिक polyurethane पाड़ का उपयोग पर आधारित है. इस पाड़ कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला को समायोजित करने के लिए अनुकूलनीय है.
Abstract
Hematopoietic स्टेम कोशिकाओं को एक अद्वितीय microenvironment की आवश्यकता है क्रम में रक्त कोशिका 1 गठन को बनाए रखने, अस्थि मज्जा (बी एम) एक जटिल तीन आयामी (3 डी) ऊतक जिसमें hematopoiesis है niches के है स्थानिक सेलुलर microenvironments संगठित द्वारा विनियमित 2-4 करार दिया. बी.एम. niches के संगठन समारोह या सामान्य या घातक 5 बी.एम. की शिथिलता के लिए महत्वपूर्ण है. इसलिए vivo में एक पूर्व vivo अनुकरण का उपयोग microenvironment में की एक बेहतर समझ में मदद मिलेगी हमें 6 leukemogenesis की आणविक, सेलुलर और microenvironmental निर्धारकों स्पष्ट है.
वर्तमान में, hematopoietic कोशिकाओं इन विट्रो में दो आयामी (2 डी) टिशू कल्चर बोतल / 7 अच्छी तरह प्लेटें या तो allogenic या xenogenic stromal कोशिकाओं के साथ सह - संस्कृति या बहिर्जात 8 साइटोकिन्स के अलावा की आवश्यकता में संवर्धित कर रहे हैं. इन शर्तों कृत्रिम और vivo में से अलग 9,10 pluripotency के भेदभाव नुकसान में परिणाम कर सकते हैं करने के लिए कोशिकाओं को उजागर कर रहा हूँ.
इस के साथ साथ, हम एक उपन्यास 3D अस्थि मज्जा संस्कृति प्रणाली है कि vivo में 3 डी विकास पर्यावरण में simulates और बहिर्जात वृद्धि कारकों का अभाव में multilineage hematopoiesis का समर्थन करता है प्रस्तुत करते हैं. अत्यंत झरझरा पाड़ इस polyurethane (पु) से बना प्रणाली में इस्तेमाल किया, उच्च घनत्व एक उच्च विशिष्ट सतह क्षेत्र भर में 11 2d में पारंपरिक monolayer की संस्कृति की तुलना में सेल के विकास की सुविधा. हमारा काम संकेत दिया है कि यह मॉडल मानव कॉर्ड (सीबी) रक्त mononuclear कोशिकाओं (एमएनसी) 12 और बहिर्जात साइटोकिन्स के अभाव में प्राथमिक leukemic कोशिकाओं के विकास का समर्थन किया है. इस उपन्यास 3 डी अनुकरण hematopoiesis अध्ययन और लेकिमिया के लिए उपन्यास उपचार का पता लगाने के लिए एक मानव प्रयोगात्मक मॉडल के विकास के लिए एक व्यवहार्य मंच प्रदान करता है.
Protocol
1. पाड़ निर्माण और scaffolds जैव functionalization
- पेट्री डिश डिस्क के रूप में पु scaffolds के (ध्यान में लीन होना आकार 100-250 मिमी, porosity के 90-95%) बनाना, thermally प्रेरित चरण जुदाई एक बहुलक समाधान (Dioxan में 5wt%) की तैयारी के बाद 13 प्रक्रिया का उपयोग ठंड और बाद में विलायक उच्च बनाने की क्रिया (चित्र 1 ए).
- पाड़ डिस्क 0.5 0.5 x 0.5 x ईसीएम प्रोटीन (चित्रा 1 बी) के साथ कोटिंग से पहले मिमी की cubes में कटौती.
- पूर्व गीला इथेनॉल (70%) में 1 मिनट और फिर फॉस्फेट में स्थानांतरण के लिए उन्हें डुबो कर scaffolds के 20 मिनट के लिए खारा (पीबीएस) बफर. फिर 3630 XG में 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र और प्रोटीन समाधान जोड़ें.
- 20 मिनट के लिए 1420 XG में प्रोटीन समाधान में scaffolds के अपकेंद्रित्र.
- आदेश में सतह है pores को अप्रतिबंधित करने के लिए, और पाड़ में गहरी पैठ वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की अनुमति अपकेंद्रित्र, 910 XG में 10 मिनट के लिए एक और समय scaffoldsपीबीएस में.
- 230 वी, 50 हर्ट्ज, 0.14, यूवी दीपक, में इथेनॉल में 2 घंटे (70%) के लिए विसर्जन के साथ 8 मिनट जोखिम का एक संयोजन का उपयोग कर scaffolds के जीवाणुरहित. उसके बाद, scaffolds के पीबीएस में Iscove संशोधित Dulbecco मध्यम (IMDM) के 30% भ्रूण गोजातीय (FBS) सीरम और 1% पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) के साथ पूरक जोड़ने से पहले दो बार धोना. 3 दिन 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 के पहले का उपयोग करने के लिए एक humidified इनक्यूबेटर में scaffolds रखें. बाँझ scaffolds के एक 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट (एक अच्छी तरह से प्रति पाड़) में रखा जाता है.
2. Mononuclear सेल अलगाव और पाड़ सीडिंग
- गर्भनाल रक्त या leukemic अस्थि मज्जा के नमूनों से मानव बहुराष्ट्रीय कंपनी निकालें, Ficoll Paque घनत्व ढाल centrifugation (1500 rpm पर 35 मिनट) (चित्रा 1C) का उपयोग.
- Resuspend IMDM में बहुराष्ट्रीय कंपनियों के 30% FBS और% 1 पी / एस शामिल
- बहुराष्ट्रीय कंपनी के निलंबन के बीज एक सूक्ष्म विंदुक का उपयोग scaffolds पर (2 × 10 6 कोशिकाओं / पाड़) 100μl.
- 37 ° C पर वरीयता प्राप्त scaffolds के कोशिकाओं के लिए 10 मिनट scaffolds में बसने के लिए 5% सीओ 2 के तहत सेते हैं.
- प्रत्येक अच्छी तरह से IMDM की 1.5 मिलीलीटर 37 में 30% FBS और इनक्यूबेटर में% 1 पी / एस और जगह के अच्छी तरह प्लेटें युक्त के साथ शीर्ष पर डिग्री सेल्सियस और प्रयोग की अवधि के लिए 5% सीओ 2.
- वरीयता प्राप्त scaffolds के सभी मीडिया के दैनिक गुजरना बदलने की.
3 स्वस्थानी सेल प्रसार और आकृति विज्ञान:. टन SEM, और Cytospins
- टन परख: एक संयुक्त राष्ट्र वरीयता प्राप्त और दो वरीयता प्राप्त एक अच्छी तरह से साफ नई प्लेट 24 में और scaffolds जगह संस्कृति से निकालें. मीडिया के 1 मिलीग्राम और 37 में 200 टन समाधान और 3 घंटे के लिए सेते हैं μl जोड़ें डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.
- एक 96 अच्छी तरह से और 490 एनएम पर एक microplate पाठक का उपयोग कर उपाय absorbance के थाली में जगह है, सतह पर तैरनेवाला से 8 x 100 μl नमूने ले लो.
- वें के विभिन्न समय बिंदुओं पर स्कैन: इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM)ई संस्कृति, मीडिया से बहुराष्ट्रीय कंपनी के साथ वरीयता प्राप्त scaffolds को हटाने, और 2.5% पीबीएस 4 में 40 मिनट के लिए बफर glutaraldehyde समाधान डिग्री सेल्सियस के साथ तय, तो पीबीएस के साथ दो बार धोना.
- निर्जलित इथेनॉल के एक वर्गीकृत श्रृंखला (25, 50, 70, 80, 90, 95, और 100%), 10 और 4 घंटे के लिए एक सड़न रोकनेवाला वातावरण में शुष्क मिनट के लिए प्रत्येक में scaffolds.
- अनुभाग नमूनों और फिर धूम कोट उन्हें एक argon वातावरण में 2 SEM के मूल्यांकन से पहले मिनट के लिए सोने के साथ, 20 केवी के एक त्वरण वोल्टेज का उपयोग करें.
- Cytospins: संस्कृति में अलग अलग समय बिंदुओं पर पाड़ से कोशिकाओं aspirating द्वारा 2.0 4 10 कोशिकाओं / स्लाइड एक्स लीजिए.
- 1500 rpm पर 3 मिनट के लिए एक गिलास स्लाइड पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र.
- राइट Giemsa संशोधित दाग और एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके निरीक्षण के साथ स्लाइड्स दाग. एफ देखने के लिए, शीतल इमेजिंग सिस्टम तस्वीरें लेने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- स्लाइड खुर्दबीन अवलोकन करने से पहले धो.
- एम ultiphoton विश्लेषण: आगे विश्लेषण जब तक इथेनॉल (70%) वाष्प रात भर और फिर सूखा और दुकान -20 डिग्री सेल्सियस के साथ अलग अलग समय बिंदुओं पर फिक्स scaffolds के. Multiphoton खुर्दबीन खंड में 30 माइक्रोन मोटी स्लाइड पाड़ और पीबीएस के साथ गीला के साथ दृश्य करने से पहले.
- पीबीएस में 10% कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ वरीयता प्राप्त scaffolds के ब्लॉक.
- विरोधी मानव माउस CD71: 4 डिग्री सेल्सियस अंधेरे में प्राथमिक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के 1:50 कमजोर पड़ने के साथ scaffolds के रातोंरात सेते हैं.
- नमूने पीबीएस में तीन बार धो और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ दाग: अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए विरोधी माउस एलेक्सा 488 Fluor है.
- नमूने पीबीएस के साथ तीन बार धो और एक confocal खुर्दबीन का उपयोग कर एक पानी के उत्सर्जन X60 उद्देश्य लेंस के साथ निरीक्षण.
- Fluorophore एलेक्सा Fluor 488 488 एनएम काँपने के गुणवाला लेज़रों से उत्साहित है. Volocity 5.3.2 सॉफ्टवेयर बाद में छवि विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- प्रवाह cytometer (एफसी) में सेलुलर विश्लेषण से पहले, पता लगाने के लिए इसी immunofluorescence एंटीबॉडी के साथ ब्याज की कोशिकाओं लेबल. नमूने के एक नंबर का पता लगाने के लिए चयनित एंटीबॉडी के अनुसार तैयार कर रहे हैं. बहुराष्ट्रीय कंपनी का पता लगाने के लिए एंटीबॉडी के निम्नलिखित संयोजन में उपयोग किया जाता है: CD45-FITC/CD71-PE/CD235a-PE-Cy5.
- पाड़ से अलग समय अंक और अपकेंद्रित्र में कोशिकाओं महाप्राण (व्यंजन). 100 μl एफसी बफर (पीबीएस 0.1 +% सोडियम azide) एक 1x10 लगभग 6 कोशिकाओं की एक गोली सेल भंग करने और हर प्रतिरक्षी प्रतिदीप्ति डाई के 10 μL जोड़ने. 30 मिनट में 4 डिग्री सेल्सियस के लिए कोशिकाओं को सेते हैं, पीबीएस के साथ दो बार धोने और अंत में फिर से एफसी बफर में निलंबित.
- प्रवाह cytometer दाग में निर्धारण के प्रतिरक्षी अभिव्यक्ति के "नकारात्मकता" सेट और जांचना प्रवाह cytometer नियंत्रण के साथ पता लगाने चैनलों पर नियंत्रण के साथ नमूना लोड करें.
- नमूना दाग डब्ल्यू पढ़ें तीन अलग अलग एंटीबॉडी के ith और अंत में WinList सॉफ्टवेयर का उपयोग करने में डेटा का प्रतिनिधित्व.
5. प्रतिनिधि परिणाम
Hematopoietic बहिर्जात वृद्धि कारकों के अलावा बिना सेलुलर विकास कैनेटीक्स का एक उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया गया है. Hematopoiesis की विषम प्रकृति, दो अलग अलग कोशिकाओं के कारण सामान्य और असामान्य hematopoietic कोशिकाओं सचित्र हैं. चित्रा 2A, मानव CBMNC के सेलुलर प्रसार संस्कृति में 28 दिनों के बाद स्पष्ट चित्रा 2B है. मानव प्राथमिक leukemic कोशिकाओं का उपयोग कर अनुकरण में विकास कैनेटीक्स से पता चलता है. सेलुलर प्रसार टन परख जो absorbance के संबंध में सेलुलर चयापचय गतिविधि के उपाय का प्रयोग मूल्यांकन किया है. दोनों ही मामलों में, कोशिकाओं proliferated है और मॉडल में स्थापित है. विकास कैनेटीक्स में अंतर मनाया जाता है, संस्कृति की स्थापना सामान्य hematopoietic कोशिकाओं leukemic कोशिकाओं की तुलना में तेजी है.
SEM के द्वारा _content "> scaffolds के काटा कोशिकाओं की आकारिकी बहिर्जात वृद्धि कारक के अभाव में संस्कृति के 28 दिनों के बाद भी सामान्य hematopoietic कोशिकाओं (चित्रा 3A) और leukemic कोशिकाओं (3B चित्रा) की विशिष्ट था. केन्द्रीय वर्गों के बाद विश्लेषण किया गया scaffolds के संस्कृति से हटा दिया गया पाड़ भर वरीयता प्राप्त कोशिकाओं के प्रसार से पता चला है, खुद को समूहों में और "आला" की तरह संरचना (चित्र 3A एंड बी ') में स्थापित चित्रा सी से पता चलता है ध्यान में लीन होना आकार के गैरवरीय में एक वितरण पाड़ एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया 28 दिनों के बाद Multiphoton माइक्रोस्कोपी बगल में 3 डी पाड़ के भीतर कोशिकाओं के वितरण को उजागर किया गया था और यह मार्कर की अभिव्यक्ति द्वारा पाड़ के मध्य वर्गों में लाल रक्त कोशिकाओं सम्बन्धी द्वीपों की उपस्थिति (चित्रा 4) से पता चला है. CD71 जो erythroblasts में सकारात्मक है. यह परिपक्व और परिपक्व कोशिकाओं डु का महत्व साबित होता हैअंगूठी erythropoiesis. मानव CBMNCs और चित्रा 5B असामान्य hematopoietic कोशिकाओं दिखाता है:: प्राथमिक leukemic कोशिकाओं अंत में, कोशिकाओं पूर्व बोने के प्रवाह cytometry रेखांकन hematopoietic कोशिकाओं, जहां चित्रा 5A सामान्य hematopoietic कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है के phenotype में अंतर को दर्शाता है. CD235a के स्तर + और CD45 + एरिथ्रोसाइट्स और leukocytes क्रमशः सामान्य नमूने में उच्च के leukemic ल्यूकेमिया के hemoblastic प्रकृति पर प्रकाश डाला में से हैं करने के लिए इसी.
चित्रा 1 पु पाड़ निर्माण और जैव functionalization में शामिल प्रक्रियाओं का चित्रण. ए) पु (5wt%) Dioxan में भंग कर रहा है और thermally प्रेरित चरण जुदाई प्रक्रिया और बाद में विलायक उच्च बनाने की क्रिया द्वारा पाड़ का उत्पादन किया जाता है, के रूप में Safinia एट अल 13 द्वारा वर्णित है. बी) पाड़ डिस्क तो int कट जाता हैओ क्यूब्स 0.5 0.5 x 0.5 x मिमी और फिर अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स प्रोटीन (ईसीएम) के साथ centrifugation द्वारा लेपित. सी) बहुराष्ट्रीय कंपनी के मानव नाल की सीबी से या बी.एम. एक micropipette साथ में घनत्व ढाल centrifugation और पु scaffolds में वरीय (2x10 6 कोशिकाओं / पाड़) का उपयोग करते हुए आकांक्षा से निकाले जाते हैं.
. चित्रा 2 सेलुलर प्रसार टन परख का उपयोग करके मापा) मानव गर्भनाल रक्त बहुराष्ट्रीय कंपनियों का उपयोग, बी) मानव प्राथमिक leukemic कोशिकाओं का उपयोग कर. कॉलम समय के साथ कोशिकाओं के विकास को दिखाने के लिए जब बहिर्जात साइटोकिन्स के अलावा बिना पु scaffolds में वरीयता प्राप्त है.
चित्रा 3: सेल और scaffolds के आसपास आकारिकी वितरण cytospins का उपयोग करते हुए, scanniएनजी इलेक्ट्रॉन micrographs. ए) गर्भनाल रक्त mononuclear संस्कृति के 28 दिनों के बाद पु scaffolds से एकत्र की कोशिकाओं के प्रतिनिधि (एबी) राइट - Giemsa दाग cytospins, और बी) हड्डी से aspirated leukemic कोशिकाओं संस्कृति के 14 दिनों के बाद पु scaffolds से एकत्र की. दोनों प्रयोगों बाहर के साइटोकाइन मुक्त शर्त में किए गए. (A'- बी)) वरीयता प्राप्त गर्भनाल रक्त बहुराष्ट्रीय कंपनियों और बी) के बाद 28 दिनों के लिए सभ्य leukemic कोशिकाओं, और सी) कोई कोशिकाओं के साथ नियंत्रण पाड़ की पु पाड़ SEM के micrographs के प्रतिनिधि केंद्रीय वर्गों '.
चित्रा 4 erythroid मार्कर CD71 के साथ संस्कृति और दाग में 28 घ के बाद गर्भनाल रक्त बहुराष्ट्रीय कंपनियों के साथ पु पाड़ वरीयता प्राप्त Multiphoton माइक्रोग्राफ.
5 चित्रा प्रवाह cytometry 3 डी डॉट भूखंडों CD45, CD71 और CD235a सतह अभिव्यक्ति मार्करों के लिए दाग. निर्धारण प्राप्त नियंत्रण भी सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता की तुलना के लिए प्रस्तुत किया है. पैनल एक मानव गर्भनाल रक्त mononuclear ऊपर मार्करों के लिए सकारात्मक कोशिकाओं से पता चलता है, पैनल बी मानव प्राथमिक leukemic कोशिकाओं से पता चलता है.
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Discussion
पूर्व vivo 3D संस्कृति यहाँ प्रस्तुत प्रणाली हमें hematopoiesis के एक 3 डी biomimicry स्थापित करने के लिए सक्षम बनाता है कि का स्मरण दिलाता है मूल बी.एम. वास्तुकला और सेलुलर बहिर्जात साइटोकिन्स की स्वतंत्र फेनोटाइप. 3D मॉडल संरचना और microenvironment कि सामान्य और असामान्य hematopoietic कोशिकाओं vivo में आई उन लोगों के लिए इसी तरह की परिस्थितियों में पैदा करने के लिए सक्षम बनाता है प्रदान करता है.
polymeric पाड़ सामग्री का चयन biomimicry डिजाइन में एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व किया. Biomaterials में महत्वपूर्ण लाभ है कि vivo में पर्यावरण में आवश्यक वास्तुकला, संरचनात्मक गुणों और आवश्यक biosignals के द्वारा प्रदान की नकल पॉलिमर में एक बढ़ती रुचि के लिए नेतृत्व किया है. पॉलिमर biomedicine में अपने आवेदन के लिए आवश्यक न्यूनतम आवश्यकताओं को पूरा क्योंकि वे जीवित कोशिकाओं है, जो उनके तत्काल पर्यावरण के प्रति संवेदनशील हैं के साथ सीधे संपर्क में हमेशा से रहे हैं. सामान्य में, मैं एकसौदा पाड़ biocompatible है, अत्यधिक झरझरा पर्याप्त यांत्रिक शक्ति के लिए एक परिभाषित 3D संरचना, मात्रा अनुपात और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य निर्माण के प्रति उच्च सतह क्षेत्र को बनाए रखने के साथ होना चाहिए. पु उन सभी गुण एक साथ शामिल हैं, हालांकि उच्च porosity और यांत्रिक शक्ति और अनुकूलित किया जा सकता टिप्स प्रक्रिया दौरान शमन तापमान पर निर्भर करता है बदला. एक परिणाम के रूप में, इस biomimicry बढ़ाने या कम porosity और ध्यान में लीन होना आकार के रूप में की जरूरत के द्वारा कोशिकाओं के अन्य प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
इस प्रयोग में पाड़ ECM प्रोटीन कोलेजन प्रकार मैं के साथ लेपित है, इस प्रोटीन, अन्य ईसीएम प्रोटीन के साथ मिलकर पहले हमारे 3D 11 मॉडल के साथ परीक्षण किया गया. यह मैं कोशिका आसंजन त्वरित और कि कारण के लिए चुना गया था कि कोलेजन प्रकार से पता चला है. कोटिंग अलग ईसीएम प्रोटीन कोशिकाओं है कि अध्ययन किया जा रहा है के प्रकार पर निर्भर करता है का उपयोग करके संशोधित किया जा सकता है. मैं करने के लिए कृत्रिम ईसीएम प्रोटीन को शामिल लाभ scaffoldsहै कि न केवल वे कोशिका आसंजन के लिए सेल बाध्यकारी अनुक्रम प्रदान करते हैं, लेकिन भी अन्य ईसीएम प्रोटीन और वृद्धि कारकों है कि इस प्रकार कोशिका आसंजन, बेहतर सेल के विकास और परिपक्वता में जो परिणाम को बढ़ाने कोशिकाओं के बंधन को स्थिर करने के साथ बातचीत के साथ माध्यमिक बातचीत की पेशकश करते हैं.
कई अध्ययनों से पूर्व vivo hematopoiesis पर दोनों 2d और 3 डी सिस्टम का उपयोग किया है, और उन सभी को बहिर्जात साइटोकिन्स का असामान्य रूप से उच्च सांद्रता के अलावा शामिल हैं. इन अध्ययनों hematopoiesis की आणविक निर्धारकों को स्पष्ट करने के लिए मदद की है, लेकिन सेलुलर और microenvironmental इस प्रक्रिया का अभिन्न अंग तत्वों को समझने के लिए मुश्किल ही इन तकनीकों की सीमाओं के आधार पर किया गया है.
विधि यहाँ वर्णित है, बी.एम. की biomimicry एक अत्यंत झरझरा polymeric पाड़ ईसीएम कोटिंग के साथ मिलकर बनाया बनाए रखने और बिना सामान्य और असामान्य hematopoiesis के विकास को स्थिर करने के लिए इष्टतम हैसाइटोकिन्स के किसी भी अतिरिक्त की जरूरत है. अनुकरण बहु - नज़दीकी प्रतिपादन hematopoiesis दवा और सामान्य और असामान्य hematopoiesis पूर्व vivo के तंत्र में वैज्ञानिक अध्ययन की खोज के लिए एक मंच के रूप में इस्तेमाल के लिए उपयुक्त प्रणाली का समर्थन करता है.
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस काम रिचर्ड थॉमस Leukaemia फंड, लेडी टाटा मेमोरियल ट्रस्ट, Northwick पार्क अस्पताल Leukaemia रिसर्च ट्रस्ट फंड और राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (NIHR), ब्रिटेन द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dioxan | Invitrogen | D20,186-3 | |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-094 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440-053 | |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| MTS | Promega Corp. | G3580 | |
| Glutaraldehyde | Fluka | 49624 | |
| Wright-Giemsa | Sigma-Aldrich | WG32 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 10108-165 | |
| CD71 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-32272 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| CD45-FITC | BD Biosciences | 74895 | |
| CD71-PE | BD Biosciences | 555537 | |
| CD235a-PE-Cy5 | BD Biosciences | 555570 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S-8032 |
References
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