Summary
Dit protocol wordt beschreven hoe u levensvatbaarheid van de cellen en de fluorescentie expressie assays met behulp van de Tali Image-Based Cytometer.
Abstract
Single-cell en de bevolking informatie worden over het algemeen ofwel verkregen door flowcytometrie of fluorescentie microscopie. Echter, deze twee methoden bieden verschillende informatie. Flowcytometrie geeft kwantitatieve multi-parametrische informatie over de fysieke kenmerken en vlekken of expressie, maar niet mogelijk voor visualisatie. Stand-alone fluorescentie microscopie biedt visuele gegevens, maar niet mogelijk voor eenvoudige kwantitatieve metingen 1.
Image-gebaseerde cytometrie overbrugt de kloof tussen deze twee methoden, waardoor de snelle visualisatie en gelijktijdige kwantitatieve analyse van duizenden cellen in heterogene populaties 2. Hier presenteren we een methode voor het uitvoeren van levensvatbaarheid van de cellen en de green fluorescent protein (GFP) expressie assays met behulp van de Tali Image-Based Cytometer 3. De Tali instrument is een 3-kanaals (helderveld, groene fluorescentie, rode fluorescentie) stationaire test platform dat biers een aantal voordelen ten opzichte van flowcytometrie en fluorescentie microscopie. De Tali cytometer is minder duur, neemt minder ruimte in de zuurkast, vereist minder onderhoud, en de workflow is vereenvoudigd, zodat de operatie en analyse is veel eenvoudiger en sneller. De Tali cytometer is in staat om een reeks van opschorting cel-gebaseerde testen, met inbegrip van GFP en rode fluorescente eiwit (RFP) expressie, apoptose 4-6 en levensvatbaarheid van de cellen analyse met propidiumjodide (PI) 7-11.
Hier laten we zien van het gebruik van de Tali instrument in het uitvoeren van een test levensvatbaarheid van de cellen in cellen die GFP. GFP-getransduceerde cellen worden gekleurd met behulp van de Tali Levensvatbaarheid Kit - Dead Cell Red. De cellen worden vervolgens gepipetteerd in een Tali Cellular Analyse Schuif en geladen in de cytometer. Helderveld, rode fluorescentie en groene fluorescentie beelden worden vastgelegd en geanalyseerd met behulp van test specifieke algoritmen. Histogrammen worden dan gegenereerd om celgrootte, PI fluo weer te gevenrescence intensiteit en GFP fluorescentie-intensiteit. Deze parameters kunnen vervolgens worden thresholded naar huis in op een specifieke cel populatie.
Een side-by-side vergelijking van de Tali Image-Based Cytometer en traditionele flowcytometrie toont aan dat de twee methodes vergelijkbare gegevens over levensvatbaarheid van de cellen en eiwit expressie te geven. Echter, de Tali instrument biedt extra visuele informatie over de cel bevolking dat niet kan worden verkregen met behulp van een flowcytometer.
Protocol
1. Kleuring Cellen met de Tali Levensvatbaarheid Kit - Dead Cell Red Reagens
- Begin deze procedure met U2OS cellen (American Type Culture Collection), die zijn getransduceerd met behulp van CellLight Nucleus-GFP * BacMam 2,0 *. (Opmerking: Cellen kunnen ook worden gecentrifugeerd en geresuspendeerd in medium of PBS).
- Om vlek dode cellen met PI, overdracht 100 pi van de cellen naar een nieuw microcentrifugebuis. Merk op dat een concentratie van 1 x 10 5 tot 1 x 10 7 cellen / ml wordt aanbevolen voor deze test, hoewel de concentratie niet te precies te zijn.
- Naast, om de dode cellen vlek, voeg 1 pi van de PI-based Tali Dead Cell Red reagens. Vortex kort om te mengen. Incubeer de Tali Dead Cell Red reagens en cel-mengsel bij kamertemperatuur in het donker voor 1-5 minuten.
- Na de incubatie, onmiddellijk overgaan tot analyse van het monster op de Tali Image-Based Cytometer.
2. Het uitvoeren van een levensvatbaarheid van de cellen test met behulp van eenTali Image-Based Cytometer
- De Tali cytometer maakt gebruik van de plastic wegwerp Tali Cellular Analysis Dia's die specifiek passen in de cytometer en kan twee 25μL monsters te houden in een aparte afgesloten kamers (A en B). Bij het hanteren van de dia, moet u altijd te houden aan de zijkanten.
- Aan de dia, pipet 25 ul monster laden langzaam in de halve maan-vormige sample laadruimte, en zorg ervoor dat de vorming van luchtbellen of terug spatten te vermijden. Niet boven of onder te vullen.
- Hier worden de controle-cellen (onbesmet, niet-getransduceerde) geladen in kamer A en de glas-GFP tot expressie brengen zijn geladen in de kamer van B. de te controleren steekproef zal helpen bij het bepalen van het niveau van autofluorescentie bij het analyseren van de gegevens.
- Voor het uitvoeren van een test levensvatbaarheid, raak GFP / RFP op het startscherm van de cytometer. De test opties verschijnt dan aan de rechterkant. Selecteer GFP + levensvatbaarheid.
- Naast, de naam van de sample-serie, Druk nu op Naam Opslaan. (Opmerking: Selecteer naam later om automatisch een naam toewijzen aan elk monster serie van datum en tijd.)
- Na het benoemen van de steekproef, zal de Tali cytometer automatisch door naar de Measure scherm. Druk op het tabblad Achtergrond aan de onderkant rechts half van de maatregel scherm.
- Vervolgens met de controle monster (A) naar afstand van de cytometer, plaatst u de dia in de laadhaven totdat deze stopt. Forceer de houder niet.
- Op de achtergrond Tik Druk op om de New onbesmet Cell besturingselement wilt invoegen. De dia wordt automatisch getrokken in de cytometer en een live beeld van de cellen wordt weergegeven op het scherm.
- Met behulp van de scherpstelknop, breng de cellen in de juiste vlak van te bekijken. De cellen moeten gelijkmatig donker met een heldere halo rond elke cel (Figuur 1, links).
- Cels kan worden undercounted wanneer de overgang tussen de achtergrond en de randen van de cellen is vaag, zodat de cel grenzen niet goed gedefinieerd (figuur 1, Center). Cellen kunnen worden overcounted als ze helder centra en donkere randen (figuur 1, rechts).
- Beter te kunnen bekijken van de cel bevolking waarbij de focus ligt, schuift de rode zoomindicator knop om 4x of 16x.
- Nadat de cellen zijn gebracht in beeld, aanraking Druk op om onbesmet Cel Controle op Uitvoeren om de achtergrond fluorescentie te meten.
- De cytometer zal automatisch vastleggen en analyseren van de beelden van het monster. Het duurt ongeveer 1 minuut vast te leggen en de beelden te analyseren in de standaard (9 image) mode.
- Miniaturen van elk gezichtsveld worden weergegeven zoals ze zijn vastgelegd en de voortgang bar biedt een voortdurende update. Na het vastleggen van beelden is voltooid, wordt de cytometer wordt automatisch uitgeworpen van de glijbaan en levert de gegevens uit de analyse van de opgenomen beelden.
- De opgeslagen gegevens worden weergegeven in het drop down menu van het tabblad Achtergrond op de cytometer. De achtergrond controlemonster worden toegewezen dezelfde naam als dat gegeven aan het experiment en zullen worden geïmporteerd in het drop down menu. Opmerking: Als een achtergrond controle is niet uitgevoerd, de cytometer wijst automatisch een fluorescentie drempel. Dit kan handmatig gewijzigd worden na het uitvoeren van de test.
- Voor het uitvoeren van de PI-gekleurde getransduceerde monster, verwijdert u de dia in de cytometer, draai het rond en plaats het met de getransduceerde monster afgekeerd van het instrument.
- Druk op het tabblad Sample, en vervolgens op Druk op om New Sample invoegen. Als het beeld op het scherm verschijnt, gebruikt u de afbeelding instelknop om de cellen in beeld te brengen als voorheen. Raak vervolgens Druk op om Sample Run.
- Na het vastleggen van beelden is voltooid, worden de gegevens uit de analyse verschijnt onder de Sample tab en de cytometer automatischebondgenoot werpt de dia.
- De juiste manier van de Tali Cellulaire Analysis Schuif als biologisch gevaarlijk afval. Tali Cellular Analyse Dia's kunnen niet worden hergebruikt.
3. Instellen Drempelwaarden en Gates
- Nadat het monster is uitgevoerd, kan de drempels nu worden toegepast om het monster naar huis in op een specifieke cel populatie. Hier zullen we de drempels aan te passen om het percentage van levende en dode cellen in GFP-getransduceerde cellen te bepalen.
- Onder het tabblad Sample, zijn het aantal en het percentage van de cellen die GFP, levende en dode cellen die GFP, totale leefbaarheid, gemiddelde celgrootte, aantal getelde cellen en cel de concentratie weergegeven.
- Daarnaast worden kavels histogram weergeven van celgrootte, groene fluorescentie, en rode fluorescentie (PI) weergegeven aan de onderkant van het scherm.
- Het instellen van de celgrootte hek, raakt u de Celgrootte miniatuur om de celgrootte histogram te openen. Terwijl de gekweekte cellen zelden debris, kunnen andere monsters bevatten afval dat groter of kleiner dan de cellen.
- Om uit te sluiten dit puin, schuift u de blauwe knoppen op de schuifbalk voor zowel grote als kleine evenementen uit te sluiten. Raak vervolgens op Toepassen om opnieuw analyseren van de gegevens en update van de resultaten.
- Naast, aan de GFP-fluorescentie toe te voegen aan de analyse, raak de GFP histogram miniatuur om deze te openen. Schuif de blauwe balk op de drempel alleen maar om het recht van de zwakste piek, met behulp van de te controleren steekproef als een gids.
- Hierdoor kan de analyse tot de GFP-positieve cellen omvatten, maar autofluorescente cellen uit te sluiten. Autofluorescentie wordt vaak waargenomen bij biologische moleculen in de cellen zijn opgewonden.
- Raak Toepassen op te bevestigen en naar het vorige scherm terug te keren. De gegevens die worden weergegeven onder de tab Sample moet nu worden nagedacht de poorten en de drempels voor beide fluorescentie kanalen.
- Vervolgens naar de PI gekleurde cellen van autofluorescentie, drukt u op t scheidenHij PI histogram miniatuur om de PI-histogram te openen.
- Nogmaals, de te controleren steekproef piek worden weergegeven als een grijze piek in het histogram. De rode piek is het monster fluorescentie. De achtergrond fluorescentie wordt weergegeven als een piek die het dichtst bij de 0 RFU waarde op deze cytometer.
- Het elimineren van de achtergrond fluorescentie in de PI-kanaal, plaatst u de blauwe knop op de schuifbalk om de drempel aan te passen aan de top die achtergrond fluorescentie uit te sluiten, met behulp van de grijze piek van de te controleren steekproef als een referentie. Raak Toepassen op te bevestigen en naar het vorige scherm terug te keren.
- Naast, om visueel te bevestigen dat elke cel de juiste is toegewezen, selecteert u een vastgelegd gebied van de weergave voor toetsing door op de miniatuur van de afbeelding in het tabblad Zoom, vervolgens op het tabblad Lagen.
- Druk vervolgens op de GFP-of PI-toets, om het beeld vastgelegd door middel van dat specifieke kanaal weer te geven. Druk nogmaals op dezelfde knop om de laag te verwijderen van het scherm, of, op lagen samenvoegen, raakt u de Multiple Layer knop.
- Te bepalen hoe de cellen worden geteld door middel van een bepaald kanaal, aanraken Circles. De cellen die werden geteld door middel van alleen de bright-field-kanaal, die niet te uiten fluorescentie wordt omcirkeld in blauw. Dit geeft aan dat die bepaalde cel is live (dwz PI negatief).
- Cellen die GFP zal worden gezien in het GFP-kanaal, en zal worden omcirkeld in het groen. Dode cellen gekleurd met Dead Cell Red zal worden gezien in de PI-kanaal, en zal worden omcirkeld in het rood.
- Cellen geteld in zowel de rode en groene kanaal wordt omcirkeld in het geel, geeft dit aan dat de cel GFP tot uitdrukking brengt, maar is ook gekleurd met PI en is dus dood.
- Af en toe, zwarte cirkels op het scherm verschijnen, dit zijn voorwerpen die zijn geïdentificeerd, maar zijn uitgesloten van de analyse op basis van celgrootte.
- Blijf fine stemmen de drempel van de fluorescentie histogram met behulp van de stappen die hierboven beschreven tot elke cel die uitdrukt fluorescentie is omcirkeld met de juiste kleur.
- Alle analyse parameters worden automatisch opgeslagen onder het tabblad Gegevens. De Tali cytometer gegevens kan bewaren van ongeveer 500 monster loopt.
- Elk bestand dat is opgeslagen in het data tabblad is beschikbaar voor heranalyse. Door het selecteren van het bestand uit de Data tab zal worden geopend en alle histogrammen en lagen actief worden.
- Voor het archiveren van gegevens en het genereren van rapporten, kunnen de gegevens opgeslagen in de cytometer worden overgezet naar een computer via een USB-drive.
4. Representatieve resultaten:
De Tali Image-Based Cytometer werd gebruikt om het fluorescerende eiwit expressie niveau in cellen die werden getransduceerd met een nucleair gerichte GFP BacMam 2,0 expressie-construct te meten. Vier representatieve soorten cellen werden getransduceerd (U2OS, 293MSR, HEKn, en CHO-S).Voor deze cellijnen, was het aantal cellen die werden uitdrukken GFP gemeld door de Tali cytometer en vergeleken met de gegevens van dezelfde monsters geanalyseerd op een flowcytometer. Daarnaast werden de cellen gekleurd met Dead Cell Red reagens met behulp van de Tali Levensvatbaarheid Kit om de doden te celpopulatie te identificeren, zowel op de Tali cytometer en op een flowcytometer.
De grafische voorstellingen in figuur 2 tonen het percentage van de totale bevolking voor elke cel type dat waren uiten van GFP. Deze gegevens tonen aan dat de Tali cytometer gegevens te vergelijken met gegevens die zijn gegenereerd door een flowcytometer produceert.
Figuur 1. De cellen moeten vooraf goed worden gericht op analyse. Tali Cellular Analyse dia's met celconcentraties geschikt voor analyse (1 x 10 5 tot 1 x 10 7 cellen worden aanbevolen). (Links) in-focus cellen zijn gelijkmatig dark in de cel, met een heldere halo rond elke cel. (CENTER) Cellen kunnen worden undercounted wanneer de overgang tussen de achtergrond en de randen van de cellen zijn vage en de cellen hebben ongedefinieerde grenzen (RECHTS) Cellen misschien overcounted wanneer ze helder centra en donkere randen.
Figuur 2. Fluorescerend eiwit expressie data van de Tali Image-Based Cytometer is vergelijkbaar met die verkregen met behulp van flow cytometrie. Een side-by-side vergelijking van de berekende GFP-expressie resulteert in 4 verschillende cellijnen in levensvatbare cellen.
Discussion
We hebben net een gedetailleerde procedure voor het uitvoeren van levensvatbaarheid telt en het beoordelen van GFP expressie met behulp van de Tali Image-Based Cytometer. Volgens dezelfde procedure, is dit cytometer is in staat om een aantal andere testen, waaronder: apoptose, RFP en de levensvatbaarheid van de cellen analyse met behulp van niet-getransduceerde cellen.
Fluorometrische testen van de levensvatbaarheid van de cel, genexpressie en apoptose zijn belangrijke methodieken in biomedisch onderzoek 7-12. In het verleden aparte instrumentatie is gebruikt om kwantitatieve en visuele informatie over de cellen te verkrijgen. Terwijl de kwantitatieve informatie over de cellen binnen een heterogene populatie is vergaard door het gebruik van flowcytometrie, is visuele of kwalitatieve informatie is verzameld door het gebruik van fluorescentie microscopie 1-4. Hier presenteren we een technologie die de kloof tussen bevolking en de individuele cel studies bruggen. Met behulp van de Tali Image-Based Cytometer, kwantitatieve data en visuele cel gegevens over individuele cellen of celpopulaties kunnen gelijktijdig worden verzameld. De Tali instrument kan worden gebruikt voor een scala van toepassingen, waaronder de beoordeling van de genexpressie, apoptose assays, studies van geneesmiddelen de werkzaamheid en de beoordeling van de progressie van de ziekte.
De Tali Image-Based Cytometer opvangt en analyseert bright-field, rode fluorescentie en groene fluorescentie beelden, zodat informatie over subpopulaties van cellen te verkrijgen. Bijvoorbeeld, in deze test waren we in staat om dode cellen te onderscheiden van levende cellen in het GFP-expressie celpopulatie met behulp van Dead Cell rode kleurstof. Dit geeft de nauwkeurigheid bij het meten van levensvatbare cellen die GFP, en identificeert de populatie van cellen bruikbaar is voor verdere verwerking. Het is belangrijk op te merken dat de dode cellen in de bevolking zou kunnen ontstaan uit verschillende bronnen, waaronder de normale celdood in cultuur of celdood veroorzaakt door omgevingsfactoren (zoals trypsinebehandeling of death geïnduceerd door de gekozen transfectie / transductie-methode).
Hier laten we zien het gebruik van de Tali cytometer met U2OS cellen. Gelijkaardige methodes kan worden uitgevoerd met de meeste zoogdieren en insecten cellen. Voor elke cellijn, de Tali cytometer geproduceerd kwantitatieve GFP-expressie gegevens, die niet mogelijk is met een visuele inspectie van de cellen met behulp van een standaard fluorescentie microscoop. Hoewel deze resultaten zijn vergelijkbaar met flow cytometrie, worden ze verzameld in een fractie van de tijd. De cytometer is in staat om nauwkeurig tellen van cellen tussen de 5 micrometer tot 60 micrometer in diameter, idealiter op een concentratie van 1 x 10 5 tot 1 x 10 7 cellen / ml.
Het is belangrijk erop te wijzen dat de meeste standaard vlekken protocollen, waaronder de Dode Cell Red kleuringsprotocol hier beschreven, gebruik propidiumjodide om te wonen en dode cellen te onderscheiden. Dit betekent een uitdaging bij de beoordeling van de levensvatbaarheid in cellen die zijn gepermeabiliseerde voor staining van intracellulaire markers, aangezien PI zal elke cel vlek met een gecompromitteerd membraan. Aangezien elke fluorescerende kleurstof of eiwit dat kan worden gedetecteerd met de groene of rode fluorescentie-kanalen kunnen worden geanalyseerd op de Tali Image-Based Cytometer, kunnen toekomstige studies onderzoeken het gebruik van alternatieve kleurstoffen, zoals amine reactieve levensvatbaarheid kleurstoffen 4. Een studie uit 2006 door Perfetto et al.. 12 gevonden van deze kleurstoffen aan eenvoudig te gebruiken en reproduceerbaar zijn discriminerend levende en dode celpopulaties.
Merk op dat de Tali beperkingen heeft met betrekking tot de aard van de testen kan uitvoeren. Bijvoorbeeld, aangezien de doelstelling die door het instrument is 4X, tellen tijdelijke acties om grotere soorten cellen: sub-cellulaire structuren zoals mitochondriën of blaasjes, en bacteriële cellen kunnen niet worden gekwantificeerd. Merk ook op dat de detectie kanalen in Tali zijn beperkt tot fluoroforen dat zal prikkelen en uit te stoten in de kanalen. Terwijl YFP en helder mCherry signalen ceen worden gedetecteerd, dimmer mCherry signalen kunnen niet. Ten slotte is de Tali analyses enige cellen in suspensie. Het zal niet nauwkeurig te tellen cellen vast te houden aan een dia. Bovendien, terwijl er slechts beperkte mogelijkheden voor het tellen van cellen die onregelmatig worden gevormd, waaronder enkele gist en primaire cellen.
Daarnaast zullen toekomstige studies waarschijnlijk het adres van het gebruik van dit systeem bij de beoordeling van de expressie van intracellulaire markers. Individuele kleurstoffen kan worden gecontroleerd spectrale overlap met aangrenzende kanalen, het gebruik van online SpectraViewer Invitrogen's tool ( www.invitrogen.com / spectraviewer ). Gezien de nieuwheid van deze technologie, het volledige scala van toepassingen moet nog worden ontdekt.
Kortom, de Tali Image-Based Cytometer toonde hier presenteert een nieuwe technologie die het mogelijk maakt voor gelijktijdige visualisatie en analyse van celpopulaties, zodat de beoordeling van individuele cellen en cell populaties in een compact formaat met een eenvoudige workflow.
Disclosures
Krissy Remple en Laurel Stone zijn medewerkers van Life Technologies, die de geproduceerde instrument gebruikt in dit artikel. Life Technologies heeft gesponsord voor de productie van deze video-artikel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tali Image-Based Cytometer | Invitrogen | T10796 | |
| Tali Cellular Analysis Slides, 50 Slides | Invitrogen | T10794 | |
| Tali Cellular Analysis Slides, 500 slides | Invitrogen | T10795 | |
| Tali Viability Kit - Dead Cell Red | Invitrogen | A10786 | |
| Tali Viability Kit - Dead Cell Green | Invitrogen | A10787 | |
| Tali Apoptosis Kit | Invitrogen | A10788 | |
| U2OS cells |
References
- Godfrey, W. L., Hill, D. M., Kilgore, J. A., Buller, G. M., Bradford, J. A., Gray, D. R., Ignatius, M. J., Janes, M. S. Complementarity of Flow Cytometry and Fluorescence Microscopy. Microsc. Microanal. 11, 246-247 (2005).
- Mittag, A., Pinto, F. E., Endringer, D. C., Tarnok, A., Lenz, D. Cellular analysis by open-source software for affordable cytometry. Scanning. 33, 33-40 (2011).
- Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophys. J. 73, 2782-2790 (1997).
- Smyth, P. G., Berman, S. A. Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system. Biotechniques. 32, 648-654 (2002).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).
- Koopman, G. Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood. 84, 1415-1420 (1994).
- Tanke, H. J., van der Linden, P. W., Langerak, J. Alternative fluorochromes to ethidium bromide for automated read out of cytotoxicity tests. J. Immunol. Methods. 52, 91-916 (1982).
- King, M. A. Detection of dead cells and measurement of cell killing by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 243, 155-166 (2000).
- Jones, K. H., Kniss, D. A. Propidium iodide as a nuclear counterstain for immunofluorescence studies on cells in culture. J. Histochem. Cytochem. 35, 123-125 (1987).
- Dell'Arciprete, R. High-efficiency expression gene cloning by flow cytometry. J. Histochem. Cytochem. 44, 629-640 (1996).
- Lamm, G. M., Steinlein, P., Cotten, M., Christofori, G. A rapid, quantitative and inexpensive method for detecting apoptosis by flow cytometry in transiently transfected cells. Nucleic. Acids. Res. 25, 4855-4857 (1997).
- Perfetto, S. P. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).
