Evaluation de l'expression de GFP et viabilité en utilisant le Tali Image Based Cytomètre

Summary

Ce protocole décrit comment effectuer la viabilité cellulaire et des dosages d'expression de fluorescence en utilisant le Tali Image Based cytomètre.

Abstract

Une seule cellule et d'information de la population sont généralement obtenus soit par cytométrie de flux ou microscopie par fluorescence. Cependant, ces deux méthodes fournissent des informations différentes. La cytométrie en flux quantitative donne des informations multi-paramétriques sur les caractéristiques physiques et de la coloration ou l'expression, mais ne permet pas de visualisation. Stand-alone de microscopie par fluorescence fournit des données visuelles, mais ne permet pas de simples mesures quantitatives ^1.

À base d'images cytométrie comble le fossé entre ces deux méthodes, permettant la visualisation rapide et simultanée des analyses quantitatives de milliers de cellules dans des populations hétérogènes ^2. Ici, nous présentons une méthode pour réaliser la viabilité cellulaire et vert fluorescent des dosages d'expression de protéines (GFP) en utilisant le Tali Image Based Cytomètre ^3. L'instrument Tali est une plate-forme 3-canal (champ clair, fluorescence verte, fluorescence rouge) dosage de paillasse que Offeavantages rs plusieurs reprises cytométrie en flux et microscopie à fluorescence. Le cytomètre de Tali est moins cher, prend moins d'espace banc, nécessite moins d'entretien, et le flux de travail a été simplifié afin que l'opération et l'analyse est beaucoup plus simple et plus rapide. Le cytomètre de Tali est capable d'exécuter une gamme de suspension dosages cellulaires, y compris la GFP et une protéine fluorescente rouge (RFP) l'expression, l'apoptose ^4-6 et l'analyse de la viabilité cellulaire avec de l'iodure de propidium (PI) ^7-11.

Ici, nous démontrons l'utilisation de l'instrument de Tali en effectuant une analyse de viabilité cellulaire dans les cellules exprimant la GFP. GFP-cellules transduites sont colorées en utilisant le kit de viabilité Tali - Red Dead Cell. Les cellules sont ensuite à la pipette dans une diapositive Tali analyse cellulaire et chargé dans le cytomètre. Fond clair, fluorescence rouge et le vert des images de fluorescence sont capturés et analysés en utilisant des algorithmes de dosage précis. Les histogrammes sont ensuite générés à afficher la taille des cellules, PI fluocence d'intensité, et l'intensité de fluorescence de la GFP. Ces paramètres peuvent ensuite être seuillée à la maison dans une population cellulaire spécifique.

Un side-by comparaison côte du cytomètre de Tali à base d'images et cytométrie de flux traditionnels démontre que les deux méthodes fournissent des données comparables sur la viabilité cellulaire et l'expression des protéines. Toutefois, l'instrument Tali fournit des informations supplémentaires visuelles sur la population de cellules qui ne peuvent être obtenues en utilisant un cytomètre de flux.

Protocol

1. Cellules présentant une coloration avec le Kit viabilité Tali - Réactif Dead Cell Rouge

1. Commencez cette procédure avec les cellules U2OS (American Type Culture Collection) qui ont été transduites en utilisant CellLight Nucleus-GFP * BacMam 2,0 *. (Note: Les cellules peuvent également être centrifugé et resuspendu dans le milieu ou PBS).
2. Pour colorer des cellules mortes avec PI, transférer 100 uL des cellules à un nouveau tube. Notez que la concentration de 1 x 10 ⁵ à 1 x 10 ⁷ cellules / ml est recommandée pour ce test, si la concentration ne doit pas être exacte.
3. Ensuite, pour colorer les cellules mortes, ajoutez 1 uL de réactif à base d'IP Tali Dead Cell Rouge. Brièvement au vortex pour mélanger. Incuber les Tali réactif Red Dead Cell et le mélange de cellules à température ambiante dans l'obscurité pendant 1-5 minutes.
4. Après l'incubation, procéder immédiatement à une analyse de l'échantillon sur la base d'images Tali cytomètre.

2. Effectuer un test de viabilité cellulaire utilisant unTali Image Based Cytomètre

1. Le cytomètre de Tali utilise le plastique jetables Diapositives Tali analyse cellulaire spécifiquement s'insérer dans le cytomètre et peut contenir deux échantillons de 25 pi chambres séparées ci-joint (A et B). Lors de la manipulation de la diapositive, assurez-vous de toujours le tenir par les côtés.
2. Pour charger la diapositive, une pipette 25 ul de l'échantillon lentement dans la demi-lune zone de chargement de l'échantillon, en prenant soin d'éviter la formation de bulles ou de retour éclaboussures. Ne pas sur-ou sous combler.
3. Ici, les cellules de contrôle (non coloré, non transduites) sont chargés dans la chambre A et le teint exprimant la GFP cellules sont chargées dans la chambre B. L'échantillon de contrôle vous aidera à déterminer le niveau d'autofluorescence dans l'analyse des données.
4. Pour effectuer un test de viabilité, toucher GFP / RFP sur l'écran d'accueil du cytomètre. Les options de test apparaîtra alors sur la droite. Sélectionnez la GFP + viabilité.
5. Ensuite, pour n'en citer la série d'échantillons, appuyez Nom maintenant Enregistrer. (Nota: Sélectionner Nom tard pour attribuer automatiquement un nom pour chaque série d'échantillons par date et l'heure.)
6. Après avoir nommé l'échantillon, le cytomètre Tali va automatiquement passer à l'écran Mesure. Appuyez sur l'onglet Historique dans la moitié inférieure droite de l'écran Mesure.
7. Ensuite, avec l'échantillon témoin (A) tourné vers le cytomètre, insérez la lame dans le port de chargement jusqu'à ce qu'il s'arrête. Ne forcez pas.
8. Sur le fond d'écran, tactile Appuyez pour insérer New Cell Control non colorées. La diapositive sera automatiquement tiré dans le cytomètre et une image en direct des cellules seront affichées sur l'écran.
9. En utilisant le bouton de mise, amener les cellules dans le plan approprié de vue. Les cellules doivent être uniformément sombre avec un halo lumineux autour de chaque cellule (figure 1, gauche).
10. Cellulaires peut être sous-estimées lors de la transition entre le fond et les bords des cellules est floue, de sorte que les limites des cellules ne sont pas bien définis (figure 1, Centre). Les cellules peuvent être surdénombrées quand ils ont des centres lumineux et sombres périmètres (figure 1, droite).
11. Pour mieux visualiser la population des cellules tout en se concentrant, faites glisser le bouton Zoom voyant rouge à 4X ou 16X.
12. Une fois les cellules ont été mis en évidence, le toucher de presse pour exécuter Cell Control non marqué pour mesurer la fluorescence de fond.
13. Le cytomètre automatiquement capturer et d'analyser les images de l'échantillon. Il faut environ 1 minute pour capturer et analyser les images dans le défaut (9 images) en mode.
14. Des miniatures de chaque champ de vue sont affichées comme elles sont capturées et la barre de progression permet une mise à jour permanente. Après la capture d'image est terminée, le cytomètre éjecte automatiquement la lame et fournit les données de l'analyse des images capturées.
15. Les données stockées seront affichés dans le menu déroulant de l'onglet Arrière-plan sur le cytomètre. L'échantillon de contrôle de fond sera attribué le même nom que celui donné à l'expérience et sera importé dans le menu déroulant. Remarque: Si un contrôle de fond n'est pas exécuté, le cytomètre attribue automatiquement un seuil de fluorescence. Ce peut être modifié manuellement après avoir effectué le test.
16. Pour exécuter l'exemple PI-tachés transduites, retirer la lame de la cytomètre, retournez autour et le réinsérer avec l'échantillon transduites face loin de l'instrument.
17. Appuyez sur l'onglet Sample, puis touchez Appuyez pour insérer nouvel échantillon. Lorsque l'image apparaît sur l'écran, utilisez le bouton de réglage d'image pour mettre les cellules en lumière comme avant. Ensuite, touchez la presse pour exécuter des échantillons.
18. Après la capture d'image est terminée, les données de l'analyse apparaît sous l'onglet des échantillons et l'automatique cytomètreallié éjecte la diapositive.
19. Disposer de façon appropriée le Slide Tali analyse cellulaire en tant que déchets biologiques dangereux. Diapositives Tali analyse cellulaire ne peut pas être réutilisé.

3. Seuils de réglage et Gates

1. Une fois l'échantillon a été exécuté, les seuils peuvent maintenant être appliqués à l'échantillon à domicile sur une population de cellules spécifiques. Ici, nous allons ajuster les seuils pour déterminer le pourcentage de cellules vivantes et mortes dans la GFP cellules transduites.
2. Sous l'onglet de l'échantillon, le nombre et le pourcentage de cellules exprimant la GFP, les cellules vivantes et mortes exprimant la GFP, la viabilité totale, la taille moyenne d'une cellule, le nombre de cellules comptées, et la concentration de cellules sont affichées.
3. En outre, les parcelles histogramme affichant la taille des cellules, la fluorescence verte et rouge de fluorescence (PI) sont affichés au bas de l'écran.
4. Pour définir la taille des cellules de la porte, touchez la miniature taille de la cellule d'ouvrir l'histogramme taille des cellules. Alors que les cellules cultivées ont rarement debris, d'autres échantillons peuvent contenir des débris qui sont plus grands ou plus petits que les cellules.
5. Pour exclure ces débris, faites glisser les boutons bleus sur la barre de défilement pour exclure les événements petits et grands. Ensuite, le toucher Appliquer pour ré-analyser les données et mettre à jour les résultats.
6. Ensuite, pour ajouter la fluorescence de la GFP à l'analyse, touchez la miniature histogramme GFP pour l'ouvrir. Faites glisser la barre bleue de fixer le seuil juste à la droite de la plus obscur de pointe, en utilisant l'échantillon de contrôle comme un guide.
7. Cela permet l'analyse pour inclure les cellules GFP-positives, mais exclure les cellules autofluorescente. Autofluorescence est souvent observé lorsque les molécules biologiques dans des cellules sont excités.
8. Appliquer tactile pour confirmer et revenir à l'écran précédent. Les données affichées sous l'onglet échantillon devrait désormais refléter les portes et les seuils fixés pour les deux canaux de fluorescence.
9. Ensuite, pour séparer les cellules PI teinté d'autofluorescence, appuyez sur tIl miniature histogramme PI d'ouvrir l'histogramme PI.
10. Encore une fois, le pic de l'échantillon de contrôle sera affiché comme un pic gris sur l'histogramme. Le pic rouge est la fluorescence de l'échantillon. La fluorescence de fond est affiché comme un pic proche de la valeur 0 RFU sur ce cytomètre.
11. Pour éliminer la fluorescence de fond dans le canal PI, déplacez le bouton bleu de la barre de défilement pour régler le seuil d'exclure le pic représentant la fluorescence de fond, en utilisant le pic gris de l'échantillon de contrôle comme une référence. Appliquer tactile pour confirmer et revenir à l'écran précédent.
12. Ensuite, pour confirmer visuellement que chaque cellule est correctement affectée, sélectionnez un champ de vue capturé pour l'examen en appuyant sur ​​la vignette de l'image dans l'onglet Zoom, puis en appuyant sur ​​l'onglet Calques.
13. Ensuite, appuyez sur le bouton de la GFP ou PI, pour afficher l'image capturée par ce canal particulier. Appuyez sur le même bouton pour enlever la couche de l'écran, ou de superposer des couches, touchez le bouton multi-couche.
14. Pour déterminer comment les cellules sont comptées par un canal particulier, Cercles toucher. Les cellules qui ont été comptés par seulement le canal champ lumineux, qui n'expriment pas de fluorescence seront entourés en bleu. Ceci indique que cette cellule particulière est en direct (c.-pi négatif).
15. Les cellules exprimant la GFP sera vu dans le canal de la GFP, et sera entouré en vert. Les cellules mortes colorées au rouge Dead Cell sera vu dans le canal de PI, et il sera encerclé en rouge.
16. Cellules comptées dans le canal à la fois rouge et vert sera entouré en jaune, cela indique que la cellule exprime la GFP, mais est aussi teinté avec PI et est donc morte.
17. Parfois, les cercles noirs apparaissent à l'écran, ce sont des objets qui ont été identifiés, mais ont été exclus de l'analyse fondée sur la taille des cellules.
18. Continuer à fiNE syntoniser le seuil sur l'histogramme de fluorescence en utilisant les étapes décrites jusqu'à ce que chaque cellule qui exprime la fluorescence est encerclé avec la couleur appropriée.
19. Tous les paramètres d'analyse sont enregistrés automatiquement dans l'onglet données. Le cytomètre de Tali peut stocker des fichiers de données d'environ 500 passages de l'échantillon.
20. Chaque fichier stocké dans l'onglet de données est disponible pour la réanalyse. En sélectionnant le fichier depuis l'onglet Données, il sera ouvert et tous les histogrammes et les couches deviennent actifs.
21. Pour archiver les données et générer des rapports, les données stockées dans le cytomètre peut être transféré à un ordinateur via une clé USB.

4. Les résultats représentatifs:

L'Image-Based Tali Cytomètre a été utilisé pour mesurer le niveau d'expression protéine fluorescente dans les cellules qui ont été transduites avec une construction nucléaire ciblée GFP BacMam expression 2.0. Quatre types de cellules représentatives ont été transduites (U2OS, 293MSR, HEKn, et CHO-S).Pour ces lignées cellulaires, le nombre de cellules exprimant la GFP qui ont été rapportés par le cytomètre Tali et comparés aux données provenant des mêmes échantillons analysés sur un cytomètre en flux. En outre, les cellules ont été colorées avec le réactif cellulaire Red Dead utilisant le kit de viabilité Tali pour identifier la population de cellules mortes à la fois sur le cytomètre Tali et sur un cytomètre en flux.

Les représentations graphiques de la figure 2 montrent le pour cent de la population totale pour chaque type de cellule qui ont été exprimant la GFP. Ces données démontrent que le cytomètre Tali produit des données comparables aux données générées par un cytomètre en flux.

Figure 1. Les cellules doivent être correctement centré avant l'analyse. Diapositives Tali analyse cellulaire à des concentrations de cellules appropriées pour l'analyse (1 x 10 ⁵ à 1 x 10 ⁷ cellules sont recommandés). (Gauche) dans les cellules de mise au point sont uniformément dArche à travers la cellule, avec un halo lumineux autour de chaque cellule cellules. (CENTRE) peut être sous-estimées lors de la transition entre le fond et les bords des cellules sont floues et les cellules ont des limites indéfinies (DROITE) Cellules peut surdénombrées quand ils ont brillants centres et les périmètres sombre.

Figure 2. Fluorescent données d'expression de protéines à partir du cytomètre Tali Image-Based est comparable à celle obtenue en utilisant la cytométrie de flux. Une comparaison côte à côte des calculée GFP-expression des résultats en 4 lignées cellulaires différentes dans les cellules viables.

Discussion

Nous venons tout juste d'une procédure détaillée pour l'exécution et l'évaluation de la viabilité compte expression de la GFP en utilisant l'Image-Based Tali cytomètre. En utilisant la même procédure, ce cytomètre est capable d'effectuer un certain nombre de dosages d'autres, notamment: analyse de la viabilité apoptose, DP et cellulaire à l'aide non-cellules transduites.

Dosages fluorométriques de la viabilité cellulaire, l'expression des gènes et de l'apoptose sont devenus des principales méthodes de la recherche biomédicale ^7-12. Dans le passé, l'instrumentation distincte a été utilisée pour obtenir des informations quantitatives et visuelles sur les cellules. Alors que des informations quantitatives sur les cellules au sein d'une population hétérogène a été remporté par l'utilisation de la cytométrie de flux, l'information visuelle ou qualitatives ont été recueillies grâce à l'utilisation de la microscopie par fluorescence ^1-4. Ici, nous présentons une technologie qui comble le fossé entre la population et les études de cellules individuelles. Utilisation du Tali Image Based Cytomètre, quantitatives daTA et les données des cellules visuelles sur des cellules individuelles ou des populations de cellules peuvent être recueillies simultanément. L'instrument de Tali peut être utilisée pour une gamme d'applications incluant l'évaluation de l'expression génique, les essais apoptose, des études sur l'efficacité des médicaments, et l'évaluation de la progression de la maladie.

L'Image-Based Tali capte et analyse Cytomètre champ lumineux, la fluorescence rouge et le vert des images de fluorescence, permettant ainsi des informations sur les sous-populations de cellules à obtenir. Par exemple, dans cet essai, nous avons été en mesure de distinguer les cellules mortes de cellules vivantes au sein du exprimant la GFP de la population de cellules en utilisant Morte Red Cell colorant. Cela donne une précision dans la mesure des cellules viables exprimant la GFP, et identifie la population de cellules utilisables pour le traitement en aval. Il est important de noter que les cellules mortes de la population pourrait provenir de sources diverses, y compris la mort des cellules normales en culture ou la mort cellulaire provoquée par les conditions environnementales (par exemple, la trypsine ou deATH induite par la méthode de transfection / transduction choisi).

Ici nous démontrer l'utilisation du cytomètre de Tali avec des cellules U2OS. Des méthodes similaires peuvent être effectuées en utilisant la plupart des cellules de mammifères et d'insectes. Pour chaque lignée cellulaire, le cytomètre Tali produit des données quantitatives expression de la GFP, ce qui n'est pas possible avec une inspection visuelle des cellules en utilisant un microscope standard à fluorescence. Bien que ces résultats sont comparables à la cytométrie de flux, ils sont collectés en une fraction de l'époque. Le cytomètre est capable de précision comptage des cellules entre 5 um à 60 um de diamètre, idéalement à une concentration de 1 x 10 ⁵ à 1 x 10 ⁷ cellules / ml.

Il est important de souligner que la plupart des protocoles de coloration standard, y compris le protocole de coloration cellulaire Red Dead décrit ici, l'utilisation d'iodure de propidium pour distinguer les cellules vivantes et mortes. Ceci présente un défi lors de l'évaluation de viabilité des cellules qui ont été perméabilisées pour staining des marqueurs intracellulaires, puisque PI tacher toute cellule avec une membrane compromise. Comme tout colorant fluorescent ou de protéines qui peuvent être détectés avec les canaux de fluorescence verte ou rouge peut être analysée sur la base d'images Tali Cytomètre, les études futures pourraient explorer l'utilisation de colorants suppléant, tels que la viabilité d'amine teintures réactives ^4. Une étude menée en 2006 par Perfetto et al. ¹² trouvé ces colorants pour être facile à utiliser et reproductible pour discriminer les populations de cellules vivantes et mortes.

Notez que le Tali a des limites à l'égard des types de tests qu'il peut effectuer. Par exemple, puisque l'objectif utilisé par l'instrument est 4X, les opérations de comptage sont limités à des types de cellules plus grandes: les structures sub-cellulaires comme les mitochondries ou des vésicules, et des cellules bactériennes ne peuvent pas être quantifiés. A noter également que les canaux de détection dans Tali sont limitées à des fluorophores qui fera vibrer et émettre dans les canaux. Alors que la YFP et lumineux signaux mCherry cune être détecté, gradateur signaux mCherry ne peut pas. Enfin, le Tali analyses uniquement les cellules en suspension. Il ne sera pas de compter exactement les cellules adhérant à une diapositive. De plus, alors il ya seulement une capacité limitée pour le comptage des cellules qui sont de forme irrégulière, dont certaines levures et cellules primaires.

En outre, les études à venir seront probablement aborder l'utilisation de ce système dans l'évaluation de l'expression des marqueurs intracellulaires. Colorants individuels peuvent être vérifiés de chevauchement spectral avec les canaux adjacents, en utilisant l'outil d'Invitrogen SpectraViewer ligne ( www.invitrogen.com / spectraviewer ). Etant donné la nouveauté de cette technologie, la gamme complète d'applications n'a pas encore été découvert.

En résumé, le Tali Image Based Cytomètre démontré ici présente une nouvelle technologie qui permet la visualisation simultanée et l'analyse de populations cellulaires, permettant l'évaluation des cellules individuelles ainsi que celL populations dans un format compact avec un workflow simple.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tali Image-Based Cytometer	Invitrogen	T10796
Tali Cellular Analysis Slides, 50 Slides	Invitrogen	T10794
Tali Cellular Analysis Slides, 500 slides	Invitrogen	T10795
Tali Viability Kit - Dead Cell Red	Invitrogen	A10786
Tali Viability Kit - Dead Cell Green	Invitrogen	A10787
Tali Apoptosis Kit	Invitrogen	A10788
U2OS cells