Summary
이 프로토콜은 Tali 이미지 기반 Cytometer를 사용하여 세포 생존 능력과 형광 표현 assays를 수행하는 방법을 설명합니다.
Abstract
단일 셀과 인구 정보는 일반적으로 유동세포계측법 또는 형광 현미경을 통해 얻을 수 있습니다. 그러나 이러한 두 가지 방법으로 다른 정보를 제공합니다. 유동세포계측법 물리적 특성과 얼룩이나 표현에 대한 정량 멀티 파라메 트릭 정보를 제공하지만, 시각화를 허용하지 않습니다. 독립 실행형 형광 현미경 시각 데이터를 제공하지만, 간단 양적 측정 1 허용하지 않습니다.
이미지 기반 cytometry는 이기종 인구 2 세포의 수천의 빠른 시각화 및 동시 정량 분석을 가능하게이 두 가지 방법 사이의 격차를 다리. 여기, 우리는 Tali 이미지 기반 Cytometer 3를 사용하여 세포 생존과 녹색 형광 단백질 (GFP) 표현식 assays을 수행하기위한 방법을 제시한다. Tali 악기는 3 채널 (명시야, 녹색 형광 빨강, 형광) benchtop 분석 플랫폼입니다 offe유동세포계측법 및 형광 현미경을 통해 RS 여러 장점. Tali의 cytometer은 저렴 적은 벤치 공간을 차지하고, 적은 유지 보수가 필요하고, 작업 흐름 작업 및 분석이 훨씬 더 간단하고 더 빨리되도록 간소화되었습니다. Tali의 cytometer은 GFP 형광 단백질과 빨간색 (RFP) 표현, apoptosis 4-6 및 propidium 요오드화물의와 세포 생존 능력 분석 (PI) 7-11 포함한 정지 셀 기반 assays의 범위를 수행할 수있다.
여기, 우리는 GFP를 표현 세포에서 세포 생존 능력 분석을 수행 Tali 악기의 사용을 보여줍니다. 죽은 세포 레드 - GFP - transduced 세포는 Tali의 생존 키트를 사용하여 얼룩 있습니다. 세포는 다음 Tali 셀룰러 분석 슬라이드로 pipetted 및 cytometer로로드됩니다. 명시야, 빨간 형광 녹색 형광 이미지 캡처 및 분석 특정 알고리즘을 사용하여 분석하고 있습니다. Histograms 그러면 셀 크기, PI fluo를 표시하려면이 생성됩니다rescence 강도 및 GFP 형광 강도. 이러한 매개 변수는 다음 특정 셀 인구에 고향 thresholded 수 있습니다.
사이드가로 Tali 이미지 기반 Cytometer 전통 유동세포계측법의 측면 비교 두 가지 방법이 세포 생존 및 단백질 표현에 관한 비교 가능한 데이터를 제공 보여줍니다. 그러나, Tali 악기는 흐름 cytometer를 사용하여 얻을 수없는 세포 인구에 대한 추가 시각 정보를 제공합니다.
Protocol
1. Tali의 생존 키트와 얼룩 셀 - 죽은 세포 레드 시약
- CellLight 본질 - GFP * BacMam 2.0을 사용 transduced되었습니다 U2OS 세포 (미국 유형 문화 수집)과이 절차를 시작 *. (참고 : 전지도 내려 버리고 중간 또는 PBS에 resuspended 수 있습니다.)
- PI와 죽은 세포를 얼룩, 새로운 microcentrifuge 튜브에 세포 100 μL를 전송합니다. 1 X 10월 5일에서 1일까지 X 10 7 세포 / ML의 농도는이 분석하는 것이 좋습니다 것을 참고하지만 농도는 정확하지 않습니다.
- 다음, 죽은 세포를 얼룩 PI 기반 Tali 죽은 세포 레드 시약 1 μL를 추가할 수 있습니다. 와류 간단히는 혼합 수 있습니다. 1-5분 동안 짙은 어둠 속에서 실온에서 Tali 죽은 세포 레드 시약 및 세포 혼합물을 품어.
- 부화 후, 즉시 Tali 이미지 기반 Cytometer에있는 샘플의 분석을 수행합니다.
2. 를 사용하여 세포 생존 능력 분석을 수행Tali 이미지 기반 Cytometer
- Tali의 cytometer은 특별히 cytometer에 맞게 별도의 동봉 회의소 (A 및 B) 두 25μL 샘플을 저장할 수있는 일회용 플라스틱 Tali 셀룰러 분석 슬라이드를 사용합니다. 슬라이드를 다룰 때, 항상 측면에서 그것을 보유해야합니다.
- 성형 거품거나 튀기지 않도록 돌봐 천천히 반 달 모양의 샘플 로딩 영역으로 슬라이드, 샘플 피펫 25 μL를로드합니다. 이상 또는 이하 기입하지 마십시오.
- 여기, 컨트롤 전지 (흠없는, 비 transduced) 챔버에 로드된 및 스테인드 GFP - 표현 세포 제어 예제에서는 데이터를 분석하면 autofluorescence의 수준을 결정하는 데 도움이됩니다 챔버 B.에로드됩니다.
- cytometer의 홈 화면에 생존 분석, 터치 GFP / RFP를 수행합니다. 분석 옵션은 다음 오른쪽에 나타납니다. GFP + 생존을 선택합니다.
- 다음 샘플 시리즈 이름을 지금 이름을 누르십시오 저장합니다. (참고 : 선택 이름 나중에 자동으로 날짜와 시간별로 각각의 샘플 시리즈의 이름을 지정합니다.)
- 샘플 이름을 지정 후, Tali의 cytometer가 자동으로 측정 화면으로 진행합니다. 측정 화면의 오른쪽 아래 절반에 배경 탭을 누릅니다.
- 그것이 멈출 때까지 다음, (A) 떨어진 cytometer에서 마주 컨트롤 샘플,로드 포트에있는 슬라이드를 삽입합니다. 힘을 적용하지 마십시오.
- 배경 화면, 터치 새로운 흠없는 셀 컨트롤을 삽입하기 위해 버튼을 누르십시오. 슬라이드가 자동으로 cytometer로 뽑아되며 세포의 실제 이미지가 화면에 표시됩니다.
- 초점 손잡이를 사용하여보기의 적절한 비행기로 전지를 가져와. 세포는 각 세포 주위에 밝은 후광 (그림 1, 왼쪽)와 동일하게 어둠해야합니다.
- 세포배경과 세포의 가장자리 사이의 전환이 퍼지 때들 셀 경계가 잘 (그림 1, 센터) 정의되지 않도록 undercounted 수 있습니다. 그들은 밝은 센터 어두운 경계 (그림 1, 오른쪽)이있을 때 전지가 overcounted 수 있습니다.
- 집중하면서 더 셀 인구를 보려면, 4X 또는 16X에 빨간색 줌 표시기 단추를 슬라이드.
- 세포가 초점으로 데려되고 나면 배경 형광을 측정 흠없는 셀 컨트롤을 실행하기 위해 프레스 터치.
- cytometer은 자동으로 캡처 및 샘플의 이미지를 분석합니다. 그것은 기본적으로 (9 이미지) 모드에서 이미지를 캡처하고 분석하는 약 1 분 정도 소요됩니다.
- 보기의 각 필드의 작은 이미지들은이 체포 됐고로 표시되며 진행률 표시줄은 지속적으로 업데이 트를 제공하고 있습니다. 이미지 캡처가 완료되면, cytometer가 자동으로 슬라이드를 배출하고 캡처된 이미지의 분석에서 데이터를 제공합니다.
- 저장된 데이터는 cytometer에 배경 탭의 드롭 다운 메뉴에 표시됩니다. 그 실험에 주어진하고 드롭 다운 메뉴에서 가져옵니다로 배경 제어 예제는 동일한 이름을 할당됩니다. 참고 : 배경 컨트롤이 실행되지 않을 경우, cytometer가 자동 형광 임계값을 지정합니다. 이것은 수동 분석을 수행한 후 변경할 수 있습니다.
- PI - 묻은 transduced 예제를 실행하려면, cytometer에서 슬라이드를 제거 그것을 주변 플립과 transduced 예제에서는 악기 떨어져 직면 그것을 다시 삽입.
- 샘플 탭을 누른 후 새로운 예제를 삽입하기 위해 프레스 터치. 이미지가 화면에 나타나면, 이전과 초점으로 세포를 가지고 이미지 조정 손잡이를 사용합니다. 다음 예제를 실행하려면 누르십시오 만지지.
- 이미지 캡처가 완료되면 분석 데이터는 샘플 탭 및 cytometer 자동으로 아래에 나타납니다앨리 슬라이드를 배출.
- 적절하게 biohazardous 폐기물로 Tali 세포 분석 슬라이드 처분. Tali 셀룰러 분석 슬라이드는 다시 사용할 수 없습니다.
3. 설정 임계값과 게이츠
- 예제가 실행되면, 임계값은 이제 특정 세포 인구에 집에 샘플에 적용할 수 있습니다. 여기, 우리는 세포를 transduced - GFP에 살고 죽은 세포의 비율을 결정하는 임계값을 조정합니다.
- 샘플 탭에서 GFP를 표현 세포, GFP, 총 생존, 평균 셀 크기, 집계 세포의 숫자, 그리고 세포 농도를 표현 살고 죽은 세포의 수와 비율이 표시됩니다.
- 또한, 세포 크기, 녹색의 형광, 붉은 형광 (PI)를 표시하는 히스토그램 플롯은 화면 하단에 표시됩니다.
- 셀 크기 게이트를 설정하려면, 셀 크기 히스토그램을 열 셀 크기 섬네일을 터치. 교양 세포는 거의 D도 없지만ebris 다른 샘플 크거나 세포보다 작은 파편을 포함할 수 있습니다.
- 이 파편 더미를 제외하려면, 크고 작은 이벤트를 제외하려면 슬라이더 막대에있는 파란색 버튼을 슬라이드. 그런 다음, 터치를 다시 분석 데이터에 적용하고 결과를 업데이 트합니다.
- 다음 분석에 GFP의 형광을 추가하려면, 그것을 여십시오 GFP 히스토그램의 축소판을 터치. 가이드로 제어 샘플을 사용하여 단지 dimmest 피크의 오른쪽에있는 임계값을 설정할 수있는 파란색 막대를 슬라이드.
- 이것은 분석 GFP 양성 세포를 포함하지만, autofluorescent 세포를 제외할 수 있습니다. 세포 내에서 생물 학적 분자가 흥분하는 경우 Autofluorescence가 자주 관찰됩니다.
- 확인하고 이전 화면으로 돌아가려면 적용을 터치. 샘플 탭 아래에 표시되는 데이터는 이제 모두 형광 채널에 대한 설정 게이츠와 임계값을 반영해야합니다.
- 다음 autofluorescence 키를 t에서 PI 스테인드 세포를 분리하는그는 PI 히스토그램의 미리보기 이미지 PI 히스토그램을 엽니다.
- 다시 컨트롤 샘플 피크는 히스토그램에 회색 피크로 표시됩니다. 붉은 정상은 샘플 형광입니다. 배경 형광이 cytometer에 0 RFU 값에 가장 가까운 피크로 표시됩니다.
- PI 채널에서 배경 형광을 제거하려면 참조로 제어 예제에서 회색 피크를 사용하여 배경 형광을 나타내는 정상을 제외하도록 임계값을 조정하려면 슬라이더 막대에있는 파란색 버튼을 이동합니다. 확인하고 이전 화면으로 돌아가려면 적용을 터치.
- 다음 시각 다음 레이어 탭을 누르면, 각각의 세포가 제대로 지정되어 있는지 확인 줌 탭에서 이미지의 축소판을 눌러 검토 볼 때 캡처한 필드를 선택합니다.
- 다음, 특정 채널을 통해 캡처한 이미지를 표시하려면 GFP 또는 PI 버튼을 누르십시오. 디스플레이에서 레이어를 제거하려면 다시 같은 버튼을 누르면하거나, 레이어를 추가 하시려면, 다중 레이어 버튼을 터치.
- 세포가 특정 채널, 터치 동아리를 통해 계산되는 방법을 확인하려면. 형광이 파란색으로 동그라미 것입니다 표현하지에만 밝은 필드 채널을 통해 계산되었다 세포. 이것은 특정 세포 (즉 PI 제외) 살고있다는 것을 나타냅니다.
- 셀 표현 GFP는 GFP 채널에서 볼 수 있으며, 녹색으로 선회한다. 죽은 세포 레드 물들일 죽은 세포는 PI 채널에서 볼 수 있으며, 빨간색 동그라미 것입니다.
- 빨간색과 녹색 채널을 모두 계산 세포가 노란색으로 동그라미 것입니다, 이것은 세포가 GFP를 표현하고 있음을 나타냅니다뿐만 아니라, PI 물들일 때문에 죽었입니다.
- 가끔, 검은색 동그라미가 화면에 나타납니다, 이들은 확인된 개체입니다하지만, 셀 크기에 따라 분석에서 제외되었습니다.
- Fi를 계속NE의 조정 형광을 표현하는 각 세포가 적절한 색상 동그라미 때까지 그냥 설명한 단계를 사용하여 형광 히스토그램에서 임계값.
- 모든 분석 매개 변수는 자동으로 데이터 탭 아래에 저장됩니다. Tali의 cytometer은 약 500 예제 실행에서 데이터 파일을 저장할 수 있습니다.
- 데이터 탭에서 저장된 각 파일 reanalysis 사용할 수 있습니다. 데이터 탭에서 파일을 선택하여 그것을 열어 모든 histograms와 레이어가 활성화 될 것입니다.
- 아카이브 데이터 및 보고서를 생성, cytometer에 저장된 데이터는 USB 드라이브를 사용하여 컴퓨터에 전송할 수 있습니다.
4. 대표 결과 :
Tali 이미지 기반 Cytometer은 핵 타겟 GFP BacMam 2.0 표현 구조와 transduced되었습니다 세포에 형광 단백질 발현 수준을 측정하는 데 사용되었다. 네 대표 세포 종류 (U2OS, 293MSR, HEKn, 그리고 CHO - S) transduced되었습니다.이러한 세포 라인에, GFP를 표현했다 세포의 숫자는 Tali의 cytometer로보고하고 흐름 cytometer에 분석 동일한 샘플의 데이터와 비교했다. 또한, 세포는 Tali의 cytometer와 흐름 cytometer에 모두 죽은 세포 인구를 식별하는 Tali의 생존 키트를 사용하여 죽은 세포 레드 시약로 얼룩진했다.
그림 2의 그래픽 표현이 GFP를 표현했다 각 세포 유형에 대한 전체 인구의 비율을 보여줍니다. 이러한 데이터는 Tali의 cytometer은 흐름 cytometer에 의해 생성된 데이터에 대한 비교 데이터를 생성 보여줍니다.
그림 1. 세포가 제대로 분석하기 전에 집중해야합니다. Tali 세포 분석 슬라이드는 (1 X 10월 5일부터 1일까지 X 10 7 세포가 권장됩니다) 분석을 위해 적절한 세포 농도와 함께. (왼쪽) 포커스에 세포가 균일하게 D 아르배경과 세포의 가장자리 사이의 전환이 퍼지이며 세포들이 밝은 경우 세포가 아마도 overcounted 정의되지 않은 경계를 (오른쪽)이있을 때 각 셀에. (사진 중앙) 셀 주위에 밝은 후광과 함께 세포에 걸쳐 방주는 undercounted 수 있습니다 센터와 어두운 경계.
그림 2. Tali 이미지 기반 Cytometer에서 형광 단백질 표현 데이터 유동세포계측법를 사용하여 얻은 그 비교할 수 있습니다. 유력한 세포에 4 개의 세포 라인에 계산 GFP 표현 결과 나란히 비교.
Discussion
우리는 생존 카운트를 수행하고 Tali 이미지 기반 Cytometer를 사용하여 GFP 발현을 평가하기위한 절차를 상세있다. 동일한 절차를 사용하여,이 cytometer을 포함한 다른 assays의 숫자를 수행 가능합니다 : 비 transduced 세포를 사용하여 apoptosis, RFP 및 세포 생존 능력 분석.
세포 생존, 유전자 발현 및 apoptosis의 Fluorometric assays는 생물 의학 연구 7-12의 주요 방법론되고 있습니다. 과거, 별도의 장비에있는 세포에 대한 양적 및 시각 정보를 얻는 데 사용되었습니다. 이종 인구 내에서 세포에 대해서 양적 정보 유동세포계측법의 사용을 통해 얻고있는 동안, 영상 또는 질적 정보는 형광 현미경 1-4 사용을 통해 수집되었습니다. 여기, 우리는 인구 및 개별 세포 연구 사이의 격차를 다리 기술을 제시한다. Tali 이미지 기반 Cytometer, 양적 다를 사용하여타 개별 셀 또는 셀 집단에 대한 시각적 셀 데이터를 동시에 수집하실 수 있습니다. Tali 악기는 유전자 표현의 평가, apoptosis의 assays, 마약 효능 연구 및 질병 진행의 평가를 포함하여 응용 프로그램의 범위에 사용될 수 있습니다.
Tali 이미지 기반 Cytometer 캡처하고 세포의 subpopulations에 대한 정보를 얻을 수 있도록, 밝은 필드 빨강, 형광 녹색 형광 이미지를 분석합니다. 예를 들어,이 분석에서 우리는 죽은 세포 빨간 염료를 사용하여 GFP - 표현 세포 인구 내에서 라이브 세포에서 죽은 세포를 구별할 수 있었다. 이 GFP를 표현 가능한 세포의 측정 정확도를 제공하고, 다운 스트림 처리를위한 유용한 세포의 인구를 나타냅니다. 인구에있는 죽은 세포가 환경 조건 (예 : trypsinization 또는 취소로 인한 정상적인 문화의 세포 사망 또는 세포 사망 등 다양한 소스로부터 발생할 수있는 점에 유의하는 것이 중요하다) 선택한 transfection / 도입 방법으로 유도 ath.
여기 U2OS 세포와 Tali의 cytometer의 사용을 보여줍니다. 비슷한 방법은 대부분의 포유 동물과 곤충 세포를 사용하여 수행할 수 있습니다. 각 세포주의 경우 Tali의 cytometer은 양적 GFP 발현 데이터 표준 형광 현미경을 사용하여 세포의 육안 검사와 수 없습니다을 생산. 이러한 결과는 유동세포계측법 비교할 수 있지만, 그들은 시간의 일부 수집하고 있습니다. cytometer은 이상 한 X 10월 5일부터 1일까지 X 10 7 세포 / ML의 농도에서 직경 60 μm의 5 μm의 사이에 정확하게 계산 세포 수있다.
그것은 죽은 세포 붉은 얼룩 프로토콜 여기에 설명된 내용을 포함한 대부분의 표준 얼룩 프로토콜을 지적하는 것이 중요합니다, 라이브와 죽은 세포를 구별할 propidium 요오드화물을 사용합니다. 세인트에 대한 permeabilized되었습니다 세포의 생존 능력을 평가 때 도전을 선물PI가 손상된 멤브레인있는 모든 세포를 얼룩 때문에, 세포 마커 aining. 녹색 또는 빨간색 형광 채널로 감지할 수있는 형광 염료이나 단백질이 Tali 이미지 기반 Cytometer에서 분석할 수 있기 때문에 미래의 연구는 아민 반응 생존의 염료 4와 같은 대체 염료의 사용을, 탐험 수 있습니다. Perfetto 외에 의해 2006 년 연구. 12이 염료가 생활하고 죽은 세포 인구를 차별에서 사용하기 쉽고 재현할 수 발견했습니다.
Tali 그것이 수행할 수있는 assays의 종류에 관한 제한을 가지고 있습니다. 악기가 사용하는 목적 4X이기 때문에 예를 들어, 계산 작업은 큰 세포 유형으로 제한됩니다 같은 mitochondria 또는 vesicles 같은 하위 세포 구조 및 박테리아 세포는 계량하실 수 없습니다. 또한 Tali에서 감지 채널 Excite와 채널 내에서 방출됩니다 fluorophores로 제한됩니다. 동안 YFP 밝은 mCherry 신호 C가 감지, 주차 mCherry 신호 수 없습니다. 마지막으로, Tali은 정지 세포를 분석합니다. 그것은 정확하게 슬라이드에 준수 세포를 카운트하지 않습니다. 또한, 일부 효모 및 기본 세포를 포함하여 불규칙 모양 세포를 계수에 대해서만 제한 기능이있는 동안.
또한, 향후 연구 가능성이 세포 마커의 표현을 평가하는이 시스템의 사용을 주소로합니다. 개인 염료는 Invitrogen의 온라인 SpectraViewer 도구 (사용하는 인접 채널 스펙트럼 중복에 대해 확인하실 수 있습니다 www.invitrogen.com / spectraviewer을 ). 이 기술의 새로움 감안할 때, 애플 리케이션의 전체 범위는 발견되지 않았다.
요약에서 Tali 이미지 기반 Cytometer 여기서 보여주는 개별 세포의 평가뿐만 아니라 cel을 활성화, 세포 인구의 동시 시각화 및 분석을위한 수있는 새로운 기술을 제시간단한 워크플로우와 소형 형식으로 내 인구.
Disclosures
Krissy Remple와 로렐 돌이 문서에서 사용되는 악기를 만들어 생활 기술 직원입니다. 생명 기술이 비디오 문서의 생산을 후원하고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tali Image-Based Cytometer | Invitrogen | T10796 | |
| Tali Cellular Analysis Slides, 50 Slides | Invitrogen | T10794 | |
| Tali Cellular Analysis Slides, 500 slides | Invitrogen | T10795 | |
| Tali Viability Kit - Dead Cell Red | Invitrogen | A10786 | |
| Tali Viability Kit - Dead Cell Green | Invitrogen | A10787 | |
| Tali Apoptosis Kit | Invitrogen | A10788 | |
| U2OS cells |
References
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