Vurdering av GFP Expression og Livskraftig Bruke Tali Bilde-Based cytometeret

Summary

Denne protokollen beskriver hvordan du utfører celleviabilitet og fluorescens uttrykk analyser med Tali Bilde-Based cytometeret.

Abstract

Encellede og befolkningen informasjon er vanligvis oppnås enten ved flowcytometri eller fluorescens mikroskopi. Men disse to metodene gir forskjellig informasjon. Flowcytometri gir kvantitative multi-parametriske informasjon om fysiske egenskaper og flekker eller uttrykk, men ikke tillater for visualisering. Stand-alone fluorescens mikroskopi gir visuell data, men ikke tillater for enkel kvantitative målinger ^1.

Bilde-baserte cytometri bro mellom disse to metodene, slik at rask visualisering og samtidig kvantitativ analyse av tusenvis av celler i heterogene populasjoner ^2. Her presenterer vi en metode for å utføre celleviabilitet og grønt fluorescerende protein (GFP) uttrykk analyser med Tali Bilde-Based cytometeret ^3. Den Tali instrument er et 3-kanal (lyse felt, grønn fluorescens, rød fluorescens) Borstemmaskin assay plattform som offers flere fordeler fremfor flow cytometri og fluorescens mikroskopi. Den Tali cytometeret er rimeligere, tar opp mindre benk plass, krever mindre vedlikehold, og arbeidet flow er forenklet slik at drift og analyse er mye enklere og raskere. Den Tali cytometeret er i stand til å utføre en rekke suspensjon celle-baserte analyser, herunder GFP og rødt fluoriserende protein (RFP) uttrykk, apoptose ^4-6 og celleviabilitet analyse med propidium jodid (PI) ^7-11.

Her demonstrerer vi bruken av Tali instrument i å utføre en celleviabilitet analysen i cellene uttrykker GFP. GFP-transduced celler er farget med Tali Livskraftig Kit - Dead Cell Red. Cellene blir deretter pipetteres til en Tali Cellular Analysis Skyv og lastet inn i cytometeret. Bright feltet, rød fluorescens og grønn fluorescens bildene er tatt og analysert ved analysen spesifikke algoritmer. Histogrammer er da genereres å vise celle størrelse, PI fluorescence intensitet, og GFP-fluorescens intensitet. Disse parametrene kan deretter thresholded å hjem på en bestemt celle befolkning.

En side ved side sammenligning av Tali Bilde-Based cytometeret og tradisjonelle flowcytometri viser at de to metodene gir sammenlignbare data om celleviabilitet og protein uttrykk. Gir imidlertid Tali instrumentet mer visuell informasjon om cellen befolkningen som ikke kan oppnås ved hjelp av en strømningscytometer.

Protocol

1. Flekker Celler med Tali Livskraftig Kit - Dead Cell Red Reagens

1. Begynn denne prosedyren med U2OS celler (American Type Culture Collection) som har blitt transduced bruker CellLight Nucleus-GFP * BacMam 2,0 *. (Merk: Cellene kan også være spunnet ned og resuspendert i medium eller PBS).
2. Å farge døde celler med PI, overføre 100 mL av cellene til en ny mikrosentrifuge tube. Merk at en konsentrasjon på 1 x 10 ⁵ til 1 x 10 ⁷ celler / ml er anbefalt for denne analysen, selv om konsentrasjonen ikke trenger å være nøyaktig.
3. Neste, å farge de døde cellene, tilsett 1 mL av PI-baserte Tali Død Cell Red reagens. Vortex kort å blande. Inkuber Tali død celle Red reagens og celle blandingen ved romtemperatur i mørke i 1-5 minutter.
4. Etter inkubasjon, umiddelbart videre til analyse av prøven på Tali Bilde-Based cytometeret.

2. Utføre en celleviabilitet Assay Bruke enTali Bilde-Based cytometeret

1. Den Tali cytometeret bruker engangs plast Tali Cellular Analysis Slides som spesifikt passer inn i cytometeret og kan holde to 25μL prøver i separate lukkede kammer (A og B). Ved håndtering av raset, må du alltid holde det ved sidene.
2. For å laste raset, 25 pipette mL av prøven sakte inn den halve måneformet sample lasting området, ta vare å unngå å danne bobler eller tilbake splatter. Ikke over eller under fylling.
3. Her er kontroll celler (unstained, non-transduced) lagt i kammeret A og beiset GFP-uttrykker cellene er lagt i kammer B. kontrollutvalget vil bidra til å bestemme nivået på autofluorescence når analysere data.
4. For å utføre en levedyktighet analysen, berøring GFP / RFP på hjem skjermen på cytometeret. Analysen alternativene vil da vises på høyre side. Velg GFP + levedyktighet.
5. Neste, for å nevne prøven serien, trykker Name nå Lagre. (Merk: Velg navnet senere å automatisk tilordne et navn for hver prøve serie etter dato og klokkeslett.)
6. Etter navngi prøven, vil Tali cytometeret automatisk videre til Measure skjermen. Trykk kategorien Bakgrunn nederst til høyre halvdel av Measure skjermen.
7. Neste, med kontrollutvalget (A) vendt bort fra cytometer, setter du inn lysbildet i lasting porten til den stopper. Ikke bruk makt.
8. På bakgrunn skjermen, trykker Trykk for å sette inn nye Unstained Cell Control. Raset vil automatisk bli trukket inn cytometeret og et levende bilde av cellene vil bli vist på skjermen.
9. Bruk fokus knotten, bringe cellene i riktig plan view. Cellene skal være jevnt mørke med en lys glorie rundt hver celle (figur 1, Venstre).
10. CellS kan være undercounted når overgangen mellom bakgrunnen og kantene av cellene er uklart, slik at cellen grenser ikke er godt definert (figur 1, Center). Celler kan overcounted når de har lyst sentre og mørke utkant (Figur 1, Høyre).
11. For bedre å vise cellen befolkningen mens fokusering, skyv den røde zoomindikatoren knappen for å 4x eller 16x.
12. Når cellene har blitt brakt i fokus, berøring Trykk for å Run Unstained Cell Control for å måle bakgrunnsfluorescens.
13. Cytometeret vil automatisk fange opp og analysere bildene av utvalget. Det tar ca 1 minutt å registrere og analysere bildene i standard (9 bilder) modus.
14. Miniatyrbilder av hver synsfelt vises som de er fanget og fremdriftslinjen gir en løpende oppdatering. Etter at Image Capture er fullført, løses cytometeret automatisk gli og gir data fra analysen av bildene.
15. Den lagrede data vil bli vist i nedtrekksmenyen av kategorien Bakgrunn på cytometeret. Bakgrunnen kontroll prøven vil bli tildelt samme navn som det gitt til eksperimentet og vil bli importert i rullegardinmenyen. Merk: Hvis en bakgrunn kontroll ikke er kjørt, cytometeret automatisk tildeler en fluorescens terskel. Dette kan manuelt endres etter som utfører analysen.
16. Hvis du vil kjøre PI-farget transduced sample, fjerne lysbildet fra cytometer, snu det rundt og sett den med transduced sample vendt bort fra instrumentet.
17. Trykk på Sample kategorien, og deretter trykk for å sette ny prøve. Når bildet vises på skjermen, bruker bildejustering knotten for å bringe cellene i fokus som før. Deretter Trykk for å Run Sample.
18. Etter at Image Capture er fullført, vises data fra analysen under Sample fanen og cytometeret automatiskalliert kaster raset.
19. Passende kast Tali Cellular Analysis Slide som biologisk farlig avfall. Tali Cellular Analysis Lysbilder kan ikke gjenbrukes.

3. Innstilling terskler og Gates

1. Når prøven har kjørt, kan terskler nå påføres prøven å hjem på en bestemt celle befolkning. Her vil vi justere terskler for å avgjøre hvor stor prosentandel av levende og døde celler i GFP-transduced celler.
2. Under Sample kategorien, antall og prosentandel av celler som uttrykker GFP, levende og døde celler som uttrykker GFP, total levedyktighet, gjennomsnittlig celle størrelse, antall celler telles, og cellekonsentrasjonen vist.
3. I tillegg er histogram tomter vise celle størrelse, grønn fluorescens, og rød fluorescens (PI) vises nederst på skjermen.
4. Slik angir cellen størrelsen gate, berører Cellestørrelse miniatyrbildet for å åpne cellestørrelsen histogrammet. Mens dyrkede celler sjelden har debris, kan andre prøvene inneholder rusk som er større eller mindre enn cellene.
5. For å utelukke denne rusk, skyver de blå knappene på glidebryteren for å utelukke både store og små arrangementer. Deretter trykker du på Apply for å re-analysere dataene og oppdatere resultatene.
6. Deretter å legge til GFP fluorescens til analysen, berøre GFP histogrammet thumbnail å åpne den. Skyv den blå linjen for å sette terskelen like til høyre for dimmest topp, med kontrollutvalget som en guide.
7. Dette gjør analysen å inkludere GFP positive celler, men utelukke autofluorescent celler. Autofluorescence er ofte observert når biologiske molekyler i cellene er spente.
8. Trykk Bruk for å bekrefte og gå tilbake til forrige skjermbilde. Dataene vises under Sample kategorien skal nå reflektere porter og terskler sett for begge fluorescens kanaler.
9. Neste, til å skille PI fargede celler fra autofluorescence, trykker than PI histogram miniatyrbilde for å åpne PI histogrammet.
10. Igjen, vil kontrollutvalget peak bli vist som en grå peak på histogrammet. Den røde toppen er prøven fluorescens. Bakgrunnen fluorescens vises som en topp nærmest 0 RFU verdien på denne cytometer.
11. For å eliminere bakgrunnsfluorescens i PI kanalen, flytte den blå knappen på glidebryteren for å justere terskelen for å utelukke topp representerer bakgrunnsfluorescens, med den grå topp fra kontrollutvalget som referanse. Trykk Bruk for å bekrefte og gå tilbake til forrige skjermbilde.
12. Neste, for å visuelt bekrefte at hver celle er riktig tildelt, velger du en fanget synsfelt for gjennomgang ved å trykke på miniatyrbildet av bildet i Zoom fanen, deretter trykke på fanen Lag.
13. Deretter trykker du på GFP eller PI-knappen, for å vise bildet som fanges inn gjennom den aktuelle kanalen. Trykk på samme knappen igjen for å fjerne lag fra displayet, eller, å legger seg lag, berører Multiple Layer knappen.
14. Å identifisere hvordan cellene telles gjennom en bestemt kanal, berøring sirkler. Cellene som ble talt gjennom bare de lyse-feltet kanal, som ikke uttrykker fluorescence vil bli innringet i blått. Dette indikerer at den aktuelle cellen er live (dvs. PI negative).
15. Celler som uttrykker GFP vil bli sett i GFP kanalen, og vil bli sirklet i grønt. Døde celler farget med døde celler Red vil bli sett i PI kanalen, og vil bli sirklet i rødt.
16. Celler telles i både røde og grønne kanalen vil bli sirklet i gult, indikerer dette at cellen uttrykker GFP, men er også farget med PI og derfor er død.
17. Noen ganger svarte sirkler vises på skjermen, dette er objekter som har blitt identifisert, men har vært ekskludert fra analysen basert på celle størrelse.
18. Fortsett å fine tune terskelen på fluorescens histogrammet ved hjelp av trinnene nettopp har beskrevet inntil hver celle som uttrykker fluorescens er sirklet inn med riktig farge.
19. Alle analyseparametere blir automatisk lagret under kategorien Data. Den Tali cytometeret kan lagre data filer fra ca 500 sample går.
20. Hver fil lagret i kategorien Data er tilgjengelig for reanalyse. Ved å velge filen fra kategorien Data vil det bli åpnet og alle histogrammer og lag blir aktive.
21. Å arkivere data og generere rapporter, kan dataene lagret i cytometeret bli overført til en datamaskin med en USB-stasjon.

Fire. Representant Resultater:

Den Tali Bilde-Based cytometer ble brukt til å måle fluorescerende protein uttrykket nivå i celler som var transduced med et kjernefysisk målrettet GFP BacMam 2,0 uttrykk konstruere. Fire representative celletyper var transduced (U2OS, 293MSR, HEKn og CHO-S).For disse cellelinjer, var antallet celler som ble uttrykker GFP rapportert av Tali cytometeret og sammenlignet med data fra de samme prøvene analysert på et flowcytometer. I tillegg ble cellene farget med døde celler Red reagens med Tali Livskraftig Kit for å identifisere de døde cellen befolkningen både på Tali cytometeret og på et flowcytometer.

Den grafiske fremstillinger i figur 2 viser prosent av den totale befolkningen for hver celletype som ble uttrykker GFP. Disse dataene viser at Tali cytometeret produserer data sammenlignes med data generert av et flowcytometer.

Figur 1. Cellene skal være riktig fokusert før analyse. Tali Cellular Analysis lysbilder med cellekonsentrasjonene egnet for analyse (1 x 10 ⁵ til 1 x 10 ⁷ celler anbefales). (Venstre) i fokus cellene er jevnt darken hele cellen, med en lysende glorie rundt hver celle. (CENTER) Celler kan undercounted når overgangen mellom bakgrunnen og kantene av cellene er uklar og cellene har udefinerte grenser (HØYRE) Celler kanskje overcounted når de har lyst sentre og mørke utkant.

Figur 2. Fluorescerende protein uttrykk data fra Tali Bilde-Based cytometeret er sammenlignbar med den som oppnås ved hjelp av flowcytometri. En side-by-side-sammenligning av beregnet GFP-uttrykk resulterer i 4 forskjellige cellelinjer i levedyktige celler.

Discussion

Vi har nettopp detaljert en prosedyre for å utføre levedyktighet teller og vurdere GFP uttrykk med Tali Bilde-Based cytometeret. Bruk samme fremgangsmåte, er dette cytometer stand til å utføre en rekke andre tester, inkludert: apoptose, RFP og celleviabilitet analyse ved hjelp av non-transduced celler.

Fluorometric analyser av celle levedyktighet, genuttrykk og apoptose har blitt viktige metoder i biomedisinsk forskning ^7-12. I det siste, separate instrumentering har blitt brukt til å innhente kvantitative og visuell informasjon om celler. Mens kvantitativ informasjon om celler i en heterogen befolkning har blitt høstet gjennom bruk av flowcytometri, har visuell eller kvalitativ informasjon er innhentet gjennom bruk av fluorescens mikroskopi ^1-4. Her presenterer vi en teknologi som bygger bro mellom befolkningen og enkelt celle studier. Bruke Tali Bilde-Based cytometer, kvantitative daTA og visuell celle data om individuelle celler eller celle populasjoner kan samles samtidig. Den Tali Instrumentet kan brukes for en rekke programmer, inkludert vurdering av genekspresjon, apoptose analyser, studier av legemidlets effekt, og vurdering av sykdomsprogresjon.

Den Tali Bilde-Based cytometeret fanger opp og analyserer lyse-feltet, rød fluorescens og grønn fluorescens bilder, slik at informasjon om subpopulasjoner av celler som skal innhentes. For eksempel i denne analysen, var vi i stand til å skille døde celler fra levende celler i GFP-uttrykke celle befolkningen bruker Død Cell rødt fargestoff. Dette gir nøyaktighet i måling av levedyktige celler uttrykker GFP, og identifiserer befolkningen i cellene brukbar for nedstrøms behandling. Det er viktig å merke seg at de døde cellene i befolkningen kan oppstå fra forskjellige kilder, inkludert normal celledød i kultur eller celledød forårsaket av miljømessige forhold (f.eks trypsinization eller deATH indusert av transfeksjon / transduksjon metoden som velges).

Her skal vi demonstrere bruken av Tali cytometeret med U2OS celler. Lignende metoder kan utføres ved hjelp fleste pattedyrs og insekt celler. For hver celle linje, produsert Tali cytometeret kvantitative GFP uttrykket data, som ikke er mulig med en visuell inspeksjon av cellene ved hjelp av en standard fluorescens mikroskop. Selv om disse resultatene er sammenlignbare med flowcytometri, de er samlet i en brøkdel av tiden. Cytometeret er i stand til nøyaktig telle celler mellom 5 mikrometer til 60 mikrometer i diameter, ideelt i en konsentrasjon på 1 x 10 ⁵ til 1 x 10 ⁷ celler / ml.

Det er viktig å påpeke at de fleste standard flekker protokoller, inkludert the Dead Cell Røde flekker protokoll som beskrives her, bruk propidium jodid å skille levende og døde celler. Dette er en utfordring ved vurdering av levedyktighet i celler som har blitt permeabilized for staining av intracellulære markører, siden PI vil farge som helst celle med en kompromittert membran. Siden noen fluorescerende fargestoff eller protein som kan oppdages med det grønne eller røde fluorescens kanaler kan analyseres på Tali Bilde-Based cytometer, kan fremtidige studier undersøke bruk av alternative fargestoffer, slik som amin reaktive levedyktighet fargestoffer ^fire. En studie fra 2006 av Perfetto et al. ¹² fant disse fargestoffer å være enkel å bruke og reproduserbar i diskriminerende levende og døde celler populasjoner.

Merk at Tali har begrensninger med hensyn til hvilke typer analyser det kan utføre. For eksempel, siden målet brukes av instrumentet er 4X, regner operasjoner begrenset til større celletyper: sub-cellulære strukturer som mitokondrier eller blemmer, og bakterieceller kan ikke kvantifiseres. Også oppmerksom på at påvisning kanalene i Tali er begrenset til fluorophores som vil opphisse og avgir innen kanalene. Mens YFP og lyse mCherry signaler cen bli oppdaget, dimmer mCherry signalene ikke kan. Til slutt analyserer Tali eneste celler i suspensjon. Det vil ikke nøyaktig telle celler fester seg til et lysbilde. Videre, mens det er kun begrenset mulighet for å telle celler som er uregelmessig formet, inkludert noen gjær og primære celler.

I tillegg vil fremtidige studier sannsynlig adresse bruken av dette systemet i å vurdere uttrykket av intracellulære markører. Individuelle fargestoffer kan kontrolleres for spektral overlapp med tilstøtende kanaler, ved hjelp av Invitrogen er online SpectraViewer verktøyet ( www.invitrogen.com / spectraviewer ). Gitt newness av denne teknologien, har hele spekteret av applikasjoner ennå ikke er oppdaget.

I sammendraget, de Tali bilde-Based cytometeret demonstrert her presenterer en ny teknologi som gjør det mulig for samtidig visualisering og analyse av celle populasjoner, slik at vurdering av individuelle celler samt cell populasjoner i et kompakt format med en enkel arbeidsflyt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tali Image-Based Cytometer	Invitrogen	T10796
Tali Cellular Analysis Slides, 50 Slides	Invitrogen	T10794
Tali Cellular Analysis Slides, 500 slides	Invitrogen	T10795
Tali Viability Kit - Dead Cell Red	Invitrogen	A10786
Tali Viability Kit - Dead Cell Green	Invitrogen	A10787
Tali Apoptosis Kit	Invitrogen	A10788
U2OS cells