Summary
Этот протокол описывает, как выполнить жизнеспособности клеток и флуоресцентных анализов выражения с помощью Тали на основе изображения Цитометр.
Abstract
Одно-клеток и демографической информации, как правило, получают либо проточной цитометрии или флуоресцентной микроскопии. Однако, эти два метода дают разную информацию. Проточная цитометрия дает количественную многопараметрических информацию о физических характеристиках и окрашивание или выражение, но не позволяет для визуализации. Автономные флуоресцентной микроскопии обеспечивает визуальные данные, но не допускает простых количественных измерений 1.
Изображение основе цитометрии мост через пропасть между этими двумя методами, что позволяет быстро визуализации и одновременного количественного анализа тысяч клеток в гетерогенной популяции 2. Здесь мы представляем метод для выполнения жизнеспособности клеток и зеленый флуоресцентный белок (GFP) анализы выражения с помощью Тали на основе изображения Цитометр 3. Инструмент Тали 3-канальный (светлое поле, зеленая флуоресценция, красная флуоресценция) настольный анализа платформу, которая ОффеRS несколько преимуществ по сравнению с проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии. Цитометр Тали дешевле, занимает меньше места на столе, требует меньше технического обслуживания, и рабочий процесс был упрощен настолько, что операция и анализ намного проще и быстрее. Цитометр Тали способен выполнять ряд суспензии клеток основе анализов, в том числе GFP и красный флуоресцентный белок (RFP) выражение, апоптоз 4-6 и жизнеспособность клеток анализ с йодистым пропидий (PI) 7-11.
Здесь мы демонстрируем использование Тали инструментом в проведении анализа жизнеспособности клеток в клетках, экспрессирующих GFP. GFP-трансдуцированных клетки окрашивали Kit Тали Жизнеспособность - Dead Red Cell. Затем клетки пипеткой в анализ Слайд Тали Сотовые и загружается в цитометр. Светлое поле, красной флуоресценции и зеленые флуоресцентные изображения будут захвачены и проанализированы с помощью специальных алгоритмов анализа. Гистограммы Затем генерируется для отображения размера ячейки, П. И. флуоресценциифлуоресценции интенсивности и интенсивность флуоресценции GFP. Эти параметры могут быть затем thresholded для перехода к конкретной популяции клеток.
Бок о бок сравнение Тали на основе изображения Цитометр и традиционных проточной цитометрии показывает, что два метода дают сопоставимые данные о жизнеспособности клеток и экспрессии белка. Тем не менее, инструмент Тали обеспечивает дополнительную визуальную информацию о популяции клеток, которые не могут быть получены с помощью проточного цитометра.
Protocol
1. Окрашивание Клетки с Kit Жизнеспособность Тали - Dead сотовый Красный Реагент
- Начните эту процедуру с клетками U2OS (Американская коллекция типовых культур), которые были трансдуцированных использованием CellLight Nucleus-GFP * BacMam 2,0 *. (Примечание: Клетки также могут быть остановлен и ресуспендировали в средней или PBS).
- Чтобы пятна отмерших клеток с П. И., передача 100 мкл клеток в новую пробирку микроцентрифужных. Обратите внимание, что концентрации 1 х 10 5 до 1 х 10 7 клеток / мл рекомендуется для этого теста, хотя концентрация не должна быть точной.
- Далее, чтобы пятна отмерших клеток, добавить 1 мкл PI основе Тали мертвых клеток красного реагента. Vortex коротко перемешать. Инкубируйте Тали Мертвого реагента Red Cell и клеточной смеси при комнатной температуре в темном месте в течение 1-5 минут.
- После инкубации, немедленно приступить к анализу пробы на Тали на основе изображения Цитометр.
2. Выполнение Анализ жизнеспособности клеток ИспользованиеТали на основе изображения Цитометр
- Цитометр Тали используются одноразовые пластиковые Тали Сотовая Анализ Слайды, которые конкретно вписывается в цитометр и может провести две 25 мкл образцов в отдельных закрытых камерах (и В). При обработке слайдов, убедитесь, что всегда держите его сторон.
- Для загрузки слайда, пипетка 25 мкл образца медленно в форме полумесяца область загрузки образцов, заботясь, чтобы избежать формирования пузырьков или назад брызг. Не над или под заливку.
- Здесь, контрольных клеток (неокрашенные, не трансдуцированных) загружаются в камеру и окрашенных GFP-экспрессирующие клетки загружаются в камере В. контрольном образце поможет определить уровень флуоресценции при анализе данных.
- Для выполнения анализа жизнеспособности, сенсорный GFP / RFP на главном экране цитометр. Анализ вариантов появится справа. Выберите GFP + жизнеспособности.
- Далее, чтобы назвать образцом серии, нажмите Имя Теперь Сохранить. (Примечание: Выбрать Название Позже для автоматического назначения имен для каждого образца серии по дате и времени.)
- После присвоения образца, цитометр Тали автоматически перейдет к Мера экране. Пресс вкладку Фон на половину нижней правой части экрана мера.
- Далее, с контрольной пробы (А) в сторону от цитометр, вставить слайд в порту погрузки до упора. Не применяйте силу.
- На фоне экрана, сенсорный Нажмите, чтобы Вставить новый Неокрашенные управления Cell. Слайдов будет автоматически втягивается в цитометр и прямое изображение клетки будут отображаться на экране.
- Использование фокус ручку, принесите клеток в надлежащее плоскости зрения. Камеры должны быть равномерно темно с ярким ореолом вокруг каждой ячейки (рис. 1, слева).
- Ячейкаа может быть занижались, когда переход между фоном и краев клеток нечеткие, так что клетка границы четко не определены (рис. 1, Центр). Ячейки могут быть overcounted когда у них есть яркие и темные центры периметров (рис. 1, справа).
- Для лучшего обзора клеточной популяции, сосредотачиваясь, слайд-красный индикатор кнопки изменения масштаба для 4X или 16X.
- Как только клетки были приведены в фокусе, сенсорный Нажмите для запуска Неокрашенные управления сотовый для измерения фоновой флуоресценции.
- Цитометр будет автоматически фиксировать и анализировать изображения образца. Она занимает около 1 минуты для захвата и анализа изображения по умолчанию (9 изображение).
- Миниатюры каждого поля зрения отображаются как они захватили и индикатор обеспечивает текущие обновления. После захвата изображения завершена, цитометр автоматически извлекается слайдов и содержит данные анализа снимков.
- Сохраненные данные будут отображаться в выпадающем меню вкладку Фон на цитометр. Образец фона контроль будет присвоен тем же именем, что, учитывая в эксперименте и будут импортированы в выпадающем меню. Примечание: Если фон контроля он не запущен, цитометр автоматически назначает флуоресценции порога. Это может быть изменен вручную после выполнения теста.
- Для запуска PI-окрашенных трансдуцированных образец, удалить слайд из цитометр, переверните его и снова вокруг его трансдуцированных образца в сторону от инструмента.
- Пресс Пример вкладки, а затем нажмите Нажмите для вставки нового образца. Когда изображение появляется на экране, используйте ручку настройки изображения для приведения клетки в центре внимания, как раньше. Затем нажмите Нажмите для запуска проб.
- После захвата изображения завершена, данные анализа появляется на вкладке Образец и цитометр автоматическоесоюзника выбрасывает слайда.
- Надлежащим распоряжаться Анализ Тали Сотовая Слайд как биологически опасные отходы. Тали Слайды Сотовая анализ не может быть повторно использован.
3. Настройка пороговых значений и Гейтс
- Как только образец работать, пороги теперь могут быть применены к образцу для перехода к конкретной популяции клеток. Здесь, мы будем корректировать пороги, чтобы определить процент живых и мертвых клеток в GFP-трансдуцированных клеток.
- Под Пример вкладки, число и процент клеток, экспрессирующих GFP, живых и мертвых клеток, экспрессирующих GFP, общая жизнеспособность, средний размер ячейки, количество ячеек подсчитываются и концентрации клеток отображаются на дисплее.
- Кроме того, гистограмма участков отображения размера ячейки, зеленая флуоресценция, и красной флуоресценции (PI), отображаются в нижней части экрана.
- Для установки ворот размер ячейки, сенсорный миниатюрами Размер ячейки, чтобы открыть гистограммы размера ячейки. Хотя культуре клеток редко гebris, другие образцы могут содержать мусор, который больше или меньше, чем клеток.
- Чтобы исключить этот мусор, слайд-синих кнопок на ползунок, чтобы исключить большие и малые события. Затем, сенсорный Применить к повторный анализ данных и обновления результатов.
- Далее, чтобы добавить GFP флуоресценции для анализа, сенсорный миниатюрами GFP гистограммы, чтобы открыть его. Слайд синяя полоса установить порог, который находится справа от тусклой пика, используя контрольный образец в качестве ориентира.
- Это позволяет включить анализ GFP-положительных клеток, но не включают autofluorescent клеток. Аутофлюоресценция часто наблюдается, когда биологических молекул внутри клеток рады.
- Сенсорный Apply для подтверждения и возврата к предыдущему экрану. Данные, отображаемые под Пример вкладка теперь должна отражать ворота и порогов, установленных для обоих каналов флюоресценции.
- Далее, для отдельных PI окрашенных клеток из аутофлюоресценция нажмите тОн PI гистограммы на миниатюру для открытых П. И. гистограммы.
- Опять же, пиком контрольной пробы будут отображаться как серый пик на гистограмме. Красный пик образец флуоресценции. Фоновой флуоресценции отображается в виде пика ближе к 0 значение РФС на этой цитометр.
- Для устранения фоновой флуоресценции в канале П. И., перемещать синюю кнопку на ползунок для регулировки порога, чтобы исключить пик представляющих фоновой флуоресценции, используя серые пик от контрольного образца в качестве эталона. Сенсорный Apply для подтверждения и возврата к предыдущему экрану.
- Далее, чтобы визуально подтвердить, что каждая ячейка правильно назначены, выберите захваченных полем зрения для рассмотрения, нажав эскиз изображения в Увеличить вкладке, а затем нажать вкладку Layers.
- Далее, нажмите GFP или PI кнопку, чтобы отобразить изображение, снятое через это определенный канал. Нажмите ту же кнопку еще раз, чтобы удалить слой с дисплея, или, накладывать слои, сенсорного Несколько кнопку слой.
- Чтобы определить, каким образом клетки считаются через определенный канал, сенсорный кругов. Клетки, которые были подсчитаны только через светлого поля канал, который не выражают флуоресценции будет обведена синим. Это указывает на то, что именно эта ячейка жить (т.е. PI отрицательный).
- Клетки, экспрессирующие GFP будет видно в канале GFP, и будет обведена зеленым. Мертвые клетки окрашиваются Мертвого Red Cell будет видно в канале П.И., и будет обведено красным.
- Клетки учитываться и в красный и зеленый канал будет обведено желтым, это говорит о том, что клетка выражает GFP, но и окрашивали PI и поэтому умер.
- Иногда, черные кружки появится на экране, это объекты, которые были выявлены, но были исключены из анализа, основанного на размер ячейки.
- Продолжайте Fiпе настроить порог на флуоресценцию гистограммы, используя шаги, только что описал, пока каждая ячейка, выразив флуоресценции окружен с соответствующим цветом.
- Все параметры анализа автоматически сохраняются на вкладке Данные. Цитометр Тали может хранить файлы данных из примерно 500 работает образца.
- Каждый файл хранится в закладке данные доступны для повторного анализа. Выбрав файл из вкладки Данные он будет открыт, и все гистограмм и слои становятся активными.
- Для архивирования данных и создания отчетов, данные, хранящиеся в цитометр могут быть переданы на компьютер с помощью диска USB.
4. Представитель Результаты:
На основе изображения Тали Цитометр был использован для измерения флуоресцентного уровня экспрессии белка в клетках, которые были трансдуцированных с ядерным целевых GFP BacMam построить выражения 2.0. Четыре представителя типов клеток были трансдуцированных (U2OS, 293MSR, HEKn и СНО-S).Для этих клеточных линий, количество ячеек, которые выражали GFP сообщили цитометр Тали и сравнивается с данными из тех же образцов проанализированы на проточный цитометр. Кроме того, клетки были окрашены мертвых клеток красного реагента использованием Kit Тали Жизнеспособность для выявления мертвых клеточной популяции как на цитометр Тали и на проточный цитометр.
Графическое представление на рисунке 2 показывает процент от общей численности населения для каждого типа клеток, которые выражали GFP. Эти данные показывают, что цитометр Тали производит данные сопоставимы с данными порожденный поток цитометр.
Рисунок 1. Клетки должны быть надлежащим образом сосредоточено до анализа. Тали Сотовая слайды анализ с клеточной концентрации подходят для анализа (1 х 10 5 до 1 х 10 7 клеток рекомендуется). (Слева) в фокусе клетки равномерно гКовчег по всей клетке, с ярким ореолом вокруг каждой ячейки. (CENTER) Ячейки могут быть занижались, когда переход между фоном и краями клетки нечеткие и неопределенные клетки границ (ПРАВЫЙ) клетки, может быть, overcounted, когда они имеют яркий центры и темно периметров.
Рисунок 2. Флуоресцентные экспрессии белка данные из Тали на основе изображения Цитометр сравнима с полученных с помощью проточной цитометрии. Бок о бок сравнение расчетных GFP-выражения результатов в 4 различных клеточных линий в жизнеспособных клеток.
Discussion
Мы только что подробные процедуры для выполнения рассчитывает жизнеспособность и оценки GFP выражение, использующее на основе изображения Тали Цитометр. Используя те же процедуры, это цитометр способен выполнять ряд других анализов в том числе: апоптоз, ППП и жизнеспособность клеток анализ с использованием не-трансдуцированных клеток.
Флуорометрические анализов жизнеспособности клеток, экспрессию генов и апоптоз стали ключевыми методологиями в области биомедицинских исследований 7-12. В прошлом, отдельных приборов были использованы для получения количественных и визуальную информацию о клетках. Хотя количественная информация о ячейках в гетерогенной популяции была получил с помощью проточной цитометрии, визуальных и качественная информация была собрана с помощью флуоресцентной микроскопии 1-4. Здесь мы представляем технологию, которая устраняет разрыв между численностью населения и отдельных исследованиях клетки. Использование Тали на основе изображения Цитометр, количественные дата и визуальных данных ячейки об отдельных клеток или клеточных популяций могут быть собраны одновременно. Тали инструмент может быть использован для широкого спектра приложений, включая оценку экспрессии генов, апоптозе анализы, исследования эффективности лекарств, а также оценки прогрессирования заболевания.
На основе изображения Тали фиксирует и анализирует Цитометр светлого поля, красная флуоресценция и зеленые флуоресцентные изображения, позволяя информацию о субпопуляции клеток, которые могут быть получены. Например, в этом анализе, мы были в состоянии отличить мертвых клеток у живых клеток в GFP-экспрессирующих клеточной популяции использованием мертвых клеток красного красителя. Это дает точность в измерении жизнеспособных клеток, экспрессирующих GFP, и определяет популяцию клеток пригодные для дальнейшей переработки. Важно отметить, что мертвые клетки в популяции могут возникнуть из различных источников, включая нормальный гибель клеток в культуре или гибель клеток вызвано экологическими условиями (например, трипсинизации или де-ATH индуцированных трансфекции / трансдукции выбранного метода).
Здесь показано использование Тали цитометр с клетками U2OS. Подобные методы могут быть выполнены с использованием самых млекопитающих и клетки насекомых. Для каждой клеточной линии, цитометр Тали получены количественные данные GFP выражение, которое не возможно при визуальном осмотре клеток с использованием стандартного флуоресцентного микроскопа. Хотя эти результаты сопоставимы с проточной цитометрии, они собираются в сжатые сроки. Цитометр способен точно подсчета клетки от 5 мкм до 60 мкм в диаметре, в идеале при концентрации 1 х 10 5 до 1 х 10 7 клеток / мл.
Важно отметить, что большинство стандартных протоколов окрашивания, в том числе мертвые клетки Красной протокол окрашивания, описанные здесь, используйте пропидий йодида различать живых и мертвых клеток. Это представляет проблему при оценке жизнеспособности клетки, которые были проницаемыми для гоaining внутриклеточных маркеров, так как П. И. окрасит любую ячейку с угрозой мембраны. Так как любая флуоресцентного красителя или белков, которые могут быть обнаружены с зеленой или красной флуоресценции каналы могут быть проанализированы на Тали на основе изображения Цитометр, будущие исследования могут изучить возможность использования альтернативных красителей, таких как амин активными красителями жизнеспособность 4. 2006 Исследование Perfetto и др. 12. Нашел эти красители должны быть просты в использовании и воспроизводимые в дискриминации живых и мертвых клеточных популяциях.
Обратите внимание, что Тали имеет ограничения в отношении типов анализов он может выполнять. Например, с целью используется инструмент 4X, считая операций ограничены в более крупные типы клеток: субклеточных структур, таких как митохондрии или пузырьки, и бактериальные клетки не могут быть определены количественно. Также отметим, что обнаружение каналов в Тали ограничиваются флуорофоров, что будет волновать и излучают в пределах каналов. Хотя YFP и яркие mCherry сигналы сбыть обнаружен, диммер mCherry сигналы не могут. Наконец, Тали только анализ клеток в суспензии. Это не будет точного подсчета клетки придерживаясь слайда. Более того, пока есть лишь ограниченные возможности для подсчета клеток, неправильной формы, в том числе дрожжей и первичных ячеек.
Кроме того, будущие исследования, скорее всего, рассмотрены вопросы использования этой системы в оценке выражения внутриклеточных маркеров. Индивидуальные красители могут быть проверены на спектральные совпадают с соседних каналов, с помощью онлайн-инструмент SpectraViewer Invitrogen (в www.invitrogen.com / spectraviewer ). Учитывая новизну этой технологии, полный спектр применения до сих пор не обнаружены.
Таким образом, Тали на основе изображения Цитометр продемонстрировали здесь представляет новую технологию, которая позволяет одновременно визуализации и анализа клеточных популяций, что позволяет оценки отдельных клеток, а также челл населения в компактном формате с простой рабочий процесс.
Disclosures
Крисси Ремпле и Лорел Камень являются сотрудниками Life Technologies, кто создал прибор, используемый в этой статье. Life Technologies спонсировал производство этого видео-статьи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tali Image-Based Cytometer | Invitrogen | T10796 | |
| Tali Cellular Analysis Slides, 50 Slides | Invitrogen | T10794 | |
| Tali Cellular Analysis Slides, 500 slides | Invitrogen | T10795 | |
| Tali Viability Kit - Dead Cell Red | Invitrogen | A10786 | |
| Tali Viability Kit - Dead Cell Green | Invitrogen | A10787 | |
| Tali Apoptosis Kit | Invitrogen | A10788 | |
| U2OS cells |
References
- Godfrey, W. L., Hill, D. M., Kilgore, J. A., Buller, G. M., Bradford, J. A., Gray, D. R., Ignatius, M. J., Janes, M. S. Complementarity of Flow Cytometry and Fluorescence Microscopy. Microsc. Microanal. 11, 246-247 (2005).
- Mittag, A., Pinto, F. E., Endringer, D. C., Tarnok, A., Lenz, D. Cellular analysis by open-source software for affordable cytometry. Scanning. 33, 33-40 (2011).
- Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophys. J. 73, 2782-2790 (1997).
- Smyth, P. G., Berman, S. A. Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system. Biotechniques. 32, 648-654 (2002).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).
- Koopman, G. Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood. 84, 1415-1420 (1994).
- Tanke, H. J., van der Linden, P. W., Langerak, J. Alternative fluorochromes to ethidium bromide for automated read out of cytotoxicity tests. J. Immunol. Methods. 52, 91-916 (1982).
- King, M. A. Detection of dead cells and measurement of cell killing by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 243, 155-166 (2000).
- Jones, K. H., Kniss, D. A. Propidium iodide as a nuclear counterstain for immunofluorescence studies on cells in culture. J. Histochem. Cytochem. 35, 123-125 (1987).
- Dell'Arciprete, R. High-efficiency expression gene cloning by flow cytometry. J. Histochem. Cytochem. 44, 629-640 (1996).
- Lamm, G. M., Steinlein, P., Cotten, M., Christofori, G. A rapid, quantitative and inexpensive method for detecting apoptosis by flow cytometry in transiently transfected cells. Nucleic. Acids. Res. 25, 4855-4857 (1997).
- Perfetto, S. P. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).
