Bedömning av GFP uttryck och livskraft Använda Tali bildbaserade flödescytometer

Summary

Detta protokoll beskriver hur du utför cellviabiliteten och fluorescens analyser uttryck med Tali bildbaserade flödescytometer.

Abstract

Encelliga och befolkning information är ofta fås antingen med flödescytometri eller fluorescensmikroskopi. Men dessa två metoder ger olika information. Flödescytometri ger kvantitativa multi-parametrisk information om fysiska egenskaper och färgning eller uttryck, men inte tillåter visualisering. Fristående fluorescensmikroskopi ger visuell data, men inte tillåter enkla kvantitativa mätningar ^1.

Bildbaserade Cytometry överbryggar gapet mellan dessa två metoder, vilket möjliggör snabb visualisering och samtidig kvantitativ analys av tusentals celler i heterogena populationer ^2. Här presenterar vi en metod för att utföra cellviabiliteten och grönt fluorescerande protein (GFP) analyser uttryck med Tali bildbaserade flödescytometer ^3. Den Tali instrumentet är en 3-kanals (ljust fält, grön fluorescens, röd fluorescens) bänk analys plattform som OffeRS flera fördelar jämfört med flödescytometri och fluorescensmikroskopi. Den Tali flödescytometer är billigare, tar mindre bänken utrymme, kräver mindre underhåll och arbetsflödet har förenklats så att drift och analys är mycket enklare och snabbare. Den Tali flödescytometer kan utföra en rad fjädring cellbaserade analyser, inklusive GFP och röda fluorescerande protein (RFP) uttryck, apoptos ^4-6 och cellviabiliteten analys med propidiumjodid (PI) ^7-11.

Här visar vi användning av Tali instrumentet att utföra en analys cellviabiliteten i celler som uttrycker GFP. GFP-transduced cellerna färgas med Tali livskraft Kit - Dead Cell Röd. Cellerna är sedan pipetteras till en Tali Mobil Analys Skjut och lastas in i cytometern. Ljusa fält, röd fluorescens och grön fluorescens bilder fångas upp och analyseras med hjälp av analys specifika algoritmer. Histogram är då skapas för att visa cellstorlek, PI fluorescence intensitet och GFP fluorescensintensiteten. Dessa parametrar kan sedan thresholded till hem på en specifik cell befolkning.

En sida-vid sida jämförelse av Tali bildbaserade flödescytometer och traditionella flödescytometri visar att de två metoderna ger jämförbara uppgifter om cellernas livskraft och protein uttryck. Ger dock Tali instrumentet ytterligare visuell information om den cell befolkningen som inte kan erhållas med hjälp av en flödescytometer.

Protocol

1. Färgning Celler med Tali livskraft Kit - Dead Cell Röd Reagens

1. Börja här proceduren med U2OS celler (American Type Culture Collection) som har transduced med CellLight Nucleus-GFP * BacMam 2,0 *. (OBS: Celler kan också snurrade ner och suspenderade i medium eller PBS).
2. För att färga döda celler med PI, överföring 100 mikroliter av cellerna till en ny mikrocentrifugrör. Observera att en koncentration av 1 x 10 ⁵ till 1 x 10 ⁷ celler / ml rekommenderas för denna analys, även om koncentrationen inte har att vara exakt.
3. Nästa, att färga döda celler, tillsätt 1 ìl av PI-baserad Tali Dead Cell Red reagens. Vortex kort att blanda. Inkubera Tali Dead reagens Cell Röd och cell-blandning vid rumstemperatur i mörker i 1-5 minuter.
4. Efter inkubationen omedelbart vidare till analysen av provet på Tali bildbaserade flödescytometer.

2. Utföra en analys cellviabiliteten Med hjälp av enTali bildbaserade flödescytometer

1. Den Tali flödescytometer använder disponibel plast Tali Mobil Analys bilder som specifikt passar in i cytometern och kan hålla två 25μL prov i separata slutna kammare (A och B). Vid hantering av bilden, se till att alltid hålla den av sidorna.
2. För att ladda bilden, pipett 25 mikroliter prov långsamt i Half Moon-formade prov lastutrymmet noga med att undvika att bilda bubblor eller rygg splatter. Inte över eller under fylla.
3. Här är kontroll celler (ofärgade, icke-transduced) laddade i kammare A och färgade GFP-uttryckande celler lastas i kammaren B. kontrollprov kommer att avgöra nivån på autofluorescens när man analyserar data.
4. För att utföra en livskraft analys pekar GFP / RFP på startskärmen på cytometern. Analysen alternativ visas sedan till höger. Välj GFP + livskraft.
5. Nästa, för att nämna provet serien, trycker namn nu Spara. (Obs: Välj Namn Senare automatiskt tilldela ett namn för varje provserie efter datum och tid.)
6. Efter att namnge urvalet, de Tali cytometern förväg automatiskt till åtgärden skärmen. Tryck på fliken Bakgrund i det nedre högra halvan av Mät skärmen.
7. Nästa, med kontrollprov (A) vänd bort från cytometern, sätter bilden i lastningshamnen tills det tar stopp. Applicera inte våld.
8. I bakgrunden trycker du Tryck för att infoga ny Obehandlat cellkontroll. Bilden kommer automatiskt att dras in i cytometern och en levande bild av cellerna kommer att visas på skärmen.
9. Med hjälp av fokus ratten, sätta cellerna i rätt plan vy. Cellerna skall vara enhetligt mörk med en ljus gloria runt varje cell (Figur 1, vänster).
10. CellS får undercounted när övergången mellan bakgrunden och kanterna av cellerna är otydlig, så att cellgränserna inte är väl definierade (figur 1, Center). Celler kan overcounted när de har ljusa center och mörka omkrets (Figur 1, Right).
11. För att bättre kunna se cellpopulation samtidigt som fokus, skjut den röda knappen Zoom-indikatorn till 4X och 16X.
12. När cellerna har kommit i fokus trycker Tryck på Kör Obehandlat cellkontroll att mäta bakgrundsfluorescens.
13. Cytometern kommer automatiskt att fånga och analysera bilderna av provet. Det tar ca 1 minut att fånga och analysera bilderna i standard (9 bilder) läge.
14. Miniatyrbilder av varje bildfält visas som de är fångade och förloppsindikatorn ger en pågående uppdatering. Efter att Bildinsamling är klar matas cytometern automatiskt bilden och ger data från analysen av de tagna bilderna.
15. Lagrade data kommer att visas i rullgardinsmenyn i fliken Bakgrund på cytometern. Bakgrunden stickprov kommer att tilldelas samma namn som den som ges till försöket och kommer att importeras i rullgardinsmenyn. Obs: Om en bakgrund kontroll inte köra, cytometern automatiskt tilldelar en fluorescens tröskel. Detta kan ändras manuellt efter att ha utfört analysen.
16. För att köra PI-färgade transduced prov, ta bort bilden från cytometern, vänder runt och sätt tillbaka den med transduced prov vänd bort från instrumentet.
17. Tryck Sample fliken och sedan på Tryck för att infoga nytt prov. När bilden visas på skärmen, använd ratten bilden justering för att få cellerna i fokus som tidigare. Tryck sedan på Tryck på för att Run Sample.
18. Efter att Bildinsamling är klar visas data från en analys enligt Sample fliken och cytometern automatiskaallierad matar ut bilden.
19. Lämpligt avyttra Tali Cellular Analysis Skjut som biologiskt avfall. Tali Mobil Analys bilder kan inte återanvändas.

3. Ange tröskelvärden och Gates

1. När provet är slut, kan trösklar nu tillämpas på provet till hemmet på en specifik cell befolkning. Här kommer vi att anpassa de trösklar för att bestämma den andel av levande och döda celler i GFP-transduced celler.
2. Under Exempel fliken är antalet och andelen celler som uttrycker GFP, levande och döda celler som uttrycker GFP, total överlevnad, genomsnittlig cell storlek, antal räknade celler, och cellkoncentrationen visas.
3. Dessutom är histogram tomter visar cellstorleken, grön fluorescens, och röd fluorescens (PI) visas längst ned på skärmen.
4. För att ställa in porten cellstorleken, tryck på miniatyren Cellstorlek att öppna histogrammet cellstorlek. Samtidigt odlade celler har sällan debris kan andra prover innehålla skräp som är större eller mindre än cellerna.
5. För att utesluta detta skräp, skjut de blå knapparna på reglaget för att utesluta både stora och små händelser. Sedan trycker du på Använd på nytt analysera data och uppdatera resultaten.
6. Därefter lägga GFP fluorescens till analysen pekar på miniatyren GFP histogrammet för att öppna den. Skjut det blå fältet för att ställa in tröskeln precis till höger om dimmest topp, med hjälp av kontrollprov som guide.
7. Detta gör analysen att inkludera GFP positiva celler, men inte autofluorescent celler. Autofluorescens ofta iakttas när biologiska molekyler i cellerna är glada.
8. Tryck på Verkställ för att bekräfta och återgå till föregående skärm. De data som visas under Sample fliken ska nu återspegla de grindarna och trösklarna för båda fluorescens kanalerna.
9. Nästa, att separera PI färgade celler från autofluorescens, tryck på tHan PI histogram bild för att öppna PI histogrammet.
10. Återigen kommer det stickprov topp visas som en grå topp i histogrammet. Den röda toppen är provet fluorescens. Bakgrunden fluorescens visas som en topp närmast 0 RFU värdet på denna flödescytometer.
11. För att eliminera bakgrundsfluorescens i PI-kanal, flytta den blå knappen på reglaget för att justera tröskeln för att utesluta topp representerar bakgrundsfluorescens, med grå topp från referensprovet som referens. Tryck på Verkställ för att bekräfta och återgå till föregående skärm.
12. Nästa, för att visuellt bekräfta att varje cell är rätt tilldelad, välj en fångad synfält för granskning genom att trycka på miniatyren av bilden i Zoom fliken och sedan trycka på fliken Lager.
13. Sedan trycker du på GFP eller PI-knappen för att visa bilden fångas genom att särskild kanal. Tryck på samma knapp igen för att ta bort lagret från skärmen, eller att överlagra lager, tryck på flera lager knappen.
14. För att identifiera hur cellerna räknas via en särskild kanal, beröring cirklar. De celler som räknades genom att endast den ljusa fält kanalen, som inte uttrycker fluorescens kommer att vara inringat i blått. Detta tyder på att just den cellen är live (dvs PI negativ).
15. Celler som uttrycker GFP kommer att ses i GFP-kanal, och kommer att vara inringade i grönt. Döda celler färgade med Dead Cell Red kommer att ses i PI kanalen, och kommer att vara inringad i rött.
16. Celler räknas i både röda och gröna kanalen inringat i gult, betyder det att cellen uttrycker GFP, men är också färgas med PI och därför är död.
17. Ibland, svarta cirklar kommer att visas på skärmen, dessa är objekt som har identifierats, men har uteslutits från analysen bygger på cellstorlek.
18. Fortsätt till FIne låt den tröskel på fluorescens histogrammet med hjälp av stegen just beskrivit tills varje cell som uttrycker fluorescens är inringade med lämplig färg.
19. Alla analysparametrar sparas automatiskt under fliken Data. Den Tali flödescytometer kan lagra datafiler från cirka 500 prov körs.
20. Varje fil som lagras i data-fliken är tillgänglig för ny analys. Genom att välja filen från fliken Data kommer det att öppnas och alla histogram och lager blir aktiva.
21. Att arkivera data och generera rapporter kan data som lagrats i cytometern överföras till en dator via en USB-enhet.

4. Representativa resultat:

Den Tali bildbaserade cytometern användes för att mäta fluorescerande nivå proteinuttryck i celler som var transduced med kärnvapen riktade GFP BacMam 2,0 uttryck konstruktion. Fyra representativa celltyper var transduced (U2OS, 293MSR, HEKn, och Cho-S).För dessa cellinjer, var antalet celler som uttrycker GFP rapporterats av Tali cytometern och jämfördes med data från samma prover analyseras på en flödescytometer. Dessutom var cellerna färgas med Dead Cell Red reagens med Tali livskraft Kit för att identifiera den döda cellen befolkningen både på Tali cytometern och på en flödescytometer.

Den grafiska representationer i Figur 2 visar hur stor procentandel av den totala befolkningen för varje celltyp som uttrycker GFP. Dessa data visar att Tali cytometern producerar data som är jämförbara med data som genereras av en flödescytometer.

Figur 1. Celler korrekt bör inriktas före analys. Med cell koncentrationer lämpliga för analys (1 x 10 ⁵ till 1 x 10 ⁷ celler rekommenderas) Tali Cellular Analysis bilder. (Vänster) i fokus cellerna är jämnt darken i hela cellen, med en ljus gloria runt varje cell. (CENTER) Celler kan undercounted när övergången mellan bakgrunden och kanterna av cellerna är suddiga och cellerna har odefinierade gränser (HÖGER) Celler kanske overcounted när de har ljusa centra och mörka omkrets.

Figur 2. Fluorescerande proteinet uttryck data från Tali bildbaserade cytometern är jämförbar med den som erhålls med flödescytometri. En sida-vid-sida jämförelse av beräknade GFP-uttryck resulterar i 4 olika cellinjer i livskraftiga celler.

Discussion

Vi har precis detaljerat förfarande för att utföra livskraft räknas och bedöma GFP uttryck med Tali bildbaserade flödescytometer. Med samma förfarande, skall den cytometern kan utföra ett antal andra analyser, bland annat: apoptos, RFP och cellviabiliteten analys med hjälp av icke-transduced celler.

Fluorometriska analyser av cellviabiliteten, genuttryck och apoptos har blivit viktiga metoder inom biomedicinsk forskning ^7-12. I det förflutna separata instrument har använts för att erhålla kvantitativa och visuell information om celler. Medan kvantitativ information om celler i en heterogen befolkning har samlat med hjälp av flödescytometri, har visuell eller kvalitativ information samlats in med hjälp av fluorescensmikroskopi ^1-4. Här presenterar vi en teknologi som överbryggar klyftan mellan befolkningen och enskilda studier cell. Använda Tali bildbaserade cytometer, kvantitativa daTA och visuell datacell om enskilda celler eller populationer cell kan samlas samtidigt. Den Tali Instrumentet kan användas för en rad tillämpningar inklusive bedömning av genuttryck, analyser apoptos, studier av läkemedlets effektivitet, och bedömning av sjukdomsprogress.

Den Tali bildbaserade cytometern fångar och analyser ljusa fält, röd fluorescens och grön fluorescens bilder, vilket gör att information om subpopulationer av celler skall erhållas. Till exempel i denna analys, kunde vi urskilja döda celler från levande celler i GFP-uttryckande celler befolkningen som använder Dead Cell röd färg. Detta ger noggrannhet i mätningen av livskraftiga celler som uttrycker GFP, och identifierar befolkningen i cellerna användbar för vidareförädlingen. Det är viktigt att notera att döda celler i befolkningen kan uppstå från olika källor, inklusive normal celldöd i kultur eller celldöd orsakas av miljömässiga förhållanden (t ex trypsinization eller death induceras av det valda transfektion / transduktion metod).

Här kan vi demonstrera användningen av Tali cytometern med U2OS celler. Liknande metoder kan utföras med de flesta däggdjur och insektsceller. För varje cellinje producerade Tali cytometern kvantitativa data GFP uttryck, vilket inte är möjligt med en visuell kontroll av cellerna med en vanlig fluorescensmikroskop. Även om dessa resultat är jämförbara med flödescytometri, de samlas i en bråkdel av tiden. Cytometern är kapabel att exakt räkna celler mellan 5 ìm till 60 mikrometer i diameter, helst vid en koncentration på 1 x 10 ⁵ till 1 x 10 ⁷ celler / ml.

Det är viktigt att påpeka att de flesta vanliga fläckar protokoll, inklusive the Dead Cell Röda färgningsprotokollet beskrivs här, använd propidiumjodid att skilja levande och döda celler. Detta är en utmaning vid bedömningen av lönsamheten i celler som har permeabilized för Staining av intracellulära markörer, eftersom PI kommer fläcken någon cell med en komprometterad membran. Eftersom alla fluorescerande färg eller protein som kan detekteras med den gröna eller röda fluorescens kanaler kan analyseras på Tali bildbaserade cytometer kan framtida studier undersöka användningen av alternativa färgämnen, såsom amin reaktiva livskraft färgämnen ^4. En undersökning från 2006 av Perfetto et al. ¹² hittade dessa färgämnen för att vara enkel att använda och reproducerbar i diskriminera levande och döda cellpopulationer.

Observera att Tali har begränsningar vad gäller vilka typer av analyser kan utföra. Till exempel, eftersom målet används av instrumentet är 4X, räknar verksamheten begränsas till större celltyper: sub-cellulära strukturer såsom mitokondrier eller blåsor, och bakteriella celler kan inte kvantifieras. Observera också att upptäcka kanaler i Tali är begränsade till fluoroforer som exciterar och släpper inom kanaler. Medan YFP och ljus mCherry signaler Cen detekteras, dimmer mCherry signaler inte kan. Slutligen analyserar Tali enda celler i suspension. Det kommer inte att exakt räkna celler som ansluter sig till en bild. Samtidigt som det bara finns begränsade möjligheter för att räkna celler som oregelbundet formade, däribland en del jäst och primära celler.

Dessutom kommer framtida studier adress sannolikt att använda detta system för att bedöma uttryck av intracellulära markörer. Individuella färgämnen kan kontrolleras spektral överlappning med intilliggande kanaler, med hjälp av Invitrogen online SpectraViewer verktyg ( www.invitrogen.com / spectraviewer ). Med tanke på det nya i denna teknik har det fulla spektrum av tillämpningar ännu inte upptäckt.

Sammanfattningsvis visade Tali bildbaserade cytometern presenterar här en ny teknik som möjliggör samtidig visualisering och analys av cellpopulationer, vilket gör att bedömningen av enskilda celler samt CELl populationer i ett kompakt format med ett enkelt arbetsflöde.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tali Image-Based Cytometer	Invitrogen	T10796
Tali Cellular Analysis Slides, 50 Slides	Invitrogen	T10794
Tali Cellular Analysis Slides, 500 slides	Invitrogen	T10795
Tali Viability Kit - Dead Cell Red	Invitrogen	A10786
Tali Viability Kit - Dead Cell Green	Invitrogen	A10787
Tali Apoptosis Kit	Invitrogen	A10788
U2OS cells