タリイメージベースのメ​​ーターを用いたGFPの発現と生存率の評価

Summary

このプロトコルは、細胞の生存と距骨イメージベースサイトメーターを用いて蛍光発現アッセイを実行する方法について説明します。

Abstract

シングルセルと人口情報は、一般的にフローサイトメトリーや蛍光顕微鏡法のいずれかによって得られる。しかし、これら2つの方法が異なる情報を提供しています。フローサイトメトリーは、物理的特性と染色や表現に関する定量的なマルチパラメトリック情報を提供しますが、可視化のために許可されていません。スタンドアロンの蛍光顕微鏡は、視覚的なデータを提供しますが、簡単な定量的な測定が¹のため許可されません。

画像ベースのサイトメトリーは迅速に可視化し、不均一な集団²の細胞の数千の同時定量分析を可能にする、これら二つのメソッドの間のギャップを埋めます。ここで、我々は細胞の生存と距骨イメージベースメーター^3を用いて緑色蛍光タンパク質（GFP）発現アッセイを行うための手法を提案する。タリの楽器は、3チャンネル（明視野、緑色蛍光、赤色蛍光）ベンチのアッセイプラットフォームですオッフェフローサイトメトリーや蛍光顕微鏡法上のRSいくつかの利点。タリサイトメーターは、低コストで少ないベンチスペースを占有、以下のメンテナンスを必要とし、作業の流れは、操作と分析がはるかに簡単かつ迅速になるように簡略化されています。タリサイトメーターは、GFPと赤色蛍光タンパク質（RFP）の発現、アポトーシス^4-6およびヨウ化プロピジウム^{（PI）7月11日}で細胞の生存率の分析を含む懸濁細胞ベースアッセイ、の範囲を行うことが可能です。

ここで、我々はGFPを発現する細胞において、細胞生存度アッセイを行うことで距骨の楽器の使用を示します。死細胞の赤 - GFP遺伝子導入細胞は距骨の生存キッ​​トを用いて染色されています。次に、細胞をタリ細胞分析のスライドにピペッティングし、サイトメーターにロードされます。明視野、赤色蛍光と緑色の蛍光画像がキャプチャされ、アッセイ特定のアルゴリズムを用いて分析している。ヒストグラムは、セルサイズ、PI蛍光を表示するために生成されます。rescence強度、およびGFP蛍光強度。これらのパラメータは、特定の細胞集団上で自宅に閾値処理することができます。

並べタリイメージベースのメ​​ーターと伝統的なフローサイトメトリーの側面の比較は、2つのメソッドは、細胞の生存率と蛋白質の発現に関する比較可能なデータを提供することを示している。しかし、タリの楽器は、フローサイトメーターを使用して取得することができる細胞集団についての追加の視覚的な情報を提供します。

Protocol

1。タリの生​​存キッ​​トと染色細胞 - 死細胞レッド試薬

1. CellLight核- GFP * BacMam 2.0を使用して形質導入されているU2OS細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション）に、この手順を開始する* （注：細胞はまた、スピンダウンし、培地またはPBSに再懸濁しすることができます）。
2. PIと死細胞を染色するために、新しいマイクロ遠心チューブに細胞を100μLを転送する。 1 × 10 ^5〜1 × 10 ⁷細胞/ mLの濃度はこのアッセイのために推奨されていることに注意し、かかわらず、濃度は正確である必要はありません。
3. 次に、死細胞を染色するために、PIベースのタリ死細胞レッド試薬の1μLを加える。軽くボルテックスして混和する。 1〜5分間暗所に室温で距骨死細胞レッド試薬と細胞の混合物をインキュベートする。
4. インキュベーション後、直ちにタリイメージベースのメ​​ーターでサンプルの分析に進みます。

2。使用して細胞生存率アッセイの実行TALIイメージベースメーター

1. タリサイトメーターは、特にサイトメーターに適合し、別の密閉チャンバー（AとB）の2つの25μlのサンプルを保持することができる使い捨てのプラスチック製タリ細胞解析のスライドを使用しています。スライドを取り扱う際は、必ず側面を持ってしてください。
2. 形成気泡やバックスプラッタをしないように注意しながら、徐々に半月状のサンプルのローディング領域にスライド、サンプルのピペット25μLをロードする。塗りつぶしの上または下にしないでください。
3. ここでは、コントロール細胞（染色、非形質導入）チャンバー内にロードされ、ステンドGFP発現細胞は、対照サンプルは、データを分析するときに自己蛍光のレベルを決めるのを助ける室Bにロードされます。
4. 生死判別試験を実行するには、サイトメーターのホーム画面にGFP / RFPをタッチします。アッセイのオプションは、右側に表示されます。 GFP +生存率を選択します。
5. 次に、サンプルのシリーズに名前を付けること、 今名前を押してください 保存します 。 （注意：自動的に日付と時間で各サンプルのシリーズの名前を割り当てることが後で名前を選択します 。）
6. サンプルを命名した後、タリサイトメーターは、自動的に測定画面に進みます。 測定画面の右下半分に[背景]タブを押してください。
7. それが止まるまで次の、コントロールサンプルが（）サイトメーターから離れて直面していると、ロードポートにスライドを挿入する。力を加えないでください。
8. 背景画面で、タッチは、 新しい無染色細胞のコントロールを挿入するときに押します 。スライドは自動的にサイトメーターに引き込まれると、細胞のライブ画像が画面に表示されます。
9. フォーカスノブを使用して、ビューの適切な面に細胞をもたらす。細胞は各細胞の周りに明るいハロー（図1、左）と一様に暗くしてください。
10. セル背景とセルのエッジ間の遷移がぼやけているときのはセルの境界線がよく（図1、センター）が定義されていないように、undercountedされることがあります。彼らは明るい中心と暗い周囲（図1、右）があるときに細胞がovercountedされることがあります。
11. 焦点を当てながら、より良い細胞集団を表示するには、4Xまたは16Xに赤のズーム表示ボタンをスライドさせます。
12. 細胞が焦点に持ち込まれていると、バックグラウンドの蛍光を測定するために無染色細胞の制御を実行するためのプレスに手を触れない。
13. サイトメーターは、自動的にサンプルの画像をキャプチャして分析します。それは、デフォルト（9画像）モードで画像をキャプチャし、分析するために約1分かかります。
14. ビューの各フィールドのサムネイルは、それらが取得されると表示され、プログレスバーが進行中のアップデートが提供されている。イメージのキャプチャが完了したら、サイトメーターは、自動的にスライドを排出し、撮影画像の分析からデータを提供します。
15. 保存されたデータは、サイトメーター上で[背景]タブのドロップダウンメニューに表示されます。バックグラウンドのコントロールのサンプルは、実験に与えられたものと同じ名前を割り当てられると、ドロップダウンメニューにインポートされます。注：バックグラウンドのコントロールが実行されていない場合は、フローサイトメーターは、自動的に蛍光しきい値を割り当てます。これは、手動で分析を実行した後で変更することができます。
16. PI染色形質導入サンプルを実行するには、フローサイトメーターからスライドを削除し、それを180度転換すると形質導入サンプルは楽器から離れて直面していると、それを再挿入します。
17. サンプルのタブを押して、 新しいサンプルを挿入するためのプレスに手を触れない。画面にイメージが表示されたら、以前のように焦点に細胞を持って来るために画像の調整ノブを使用してください。その後、 サンプルを実行するを押して手を触れない。
18. イメージのキャプチャが完了したら、分析からのデータは、 サンプルのタブとサイトメーター自動]の下に表示されます同盟国は、スライドを排出します。
19. 適切なバイオハザード廃棄物としてタリ細胞分析のスライドを処分。 TALI細胞解析のスライドは再利用できません。

3。しきい値の設定とゲイツ

1. サンプルが実行されれば、しきい値は、現在、特定の細胞集団上で自宅にサンプルに適用することができます。ここで、我々は、GFP遺伝子導入細胞の生細胞と死細胞の割合を決定するしきい値を調整します。
2. サンプルタブの下で、GFPを発現する細胞、GFP、総生存率、平均セルサイズ、計数した細胞数、および細胞濃度を表現する生細胞と死細胞の数と割合が表示されます。
3. さらに、セルサイズ、緑色蛍光、および赤色蛍光（PI）を表示するヒストグラムプロットは、画面の下部に表示されます。
4. セルサイズのゲートを設定するには、セルサイズのヒストグラムを開くにはセルサイズのサムネイル ​​をタッチします。培養細胞はほとんどDを持っていないがebris、他のサンプルは、セルよりも大きいまたは小さい破片が含まれている場合があります。
5. この残骸を除外するには、大小のイベントを除外するには、スライダーバーの青色のボタンをスライドさせます。その後、再解析データに適用し、結果を更新触れない。
6. 次に、分析するためにGFPの蛍光を追加するには、それを開くためにGFPのヒストグラムのサムネイルをタッチします。ガイドとして、コントロールサンプルを使用して、ちょうど最も暗いピークの右側に閾値を設定するには、青色のバーをスライドさせます。
7. これによって、解析がGFP陽性細胞を含むが、自家蛍光細胞を除外することができます。細胞内の生体分子が励起されるときに自家蛍光が頻繁に観察される。
8. 確認し、前の画面に戻るには[適用]をタッチします。 サンプルのタブの下に表示されるデータは、現在、両方の蛍光チャネルに設定されたゲートとしきい値を反映している必要があります。
9. 次に、自家蛍光からPI染色された細胞を分離するために、Tキーを押し彼は、PIのヒストグラムのサムネイル ​​は、PIヒストグラムを開きます。
10. もう一度、コントロールサンプルのピークがヒストグラム上で灰色のピークとして表示されます。赤色ピークは試料の蛍光です。バックグラウンドの蛍光は、このサイトメーターで0 RFU値に最も近いピークとして表示されます。
11. PIチャネルにおけるバックグラウンド蛍光を除去するために、基準としてコントロールサンプルから灰色のピークを使用して、バックグラウンドの蛍光を表すピークを除外するしきい値を調整するスライダバーにある青色のボタンを移動します。確認し、前の画面に戻るには[適用]をタッチします。
12. 次に、視覚的に各細胞が適切に割り当てられていることを確認し、その後レイヤーのタブを押すと、[ズーム]タブで画像のサムネイル ​​を押して、レビュー用のビューのキャプチャされたフィールドを選択します。
13. 次に、その特定のチャネルを介してキャプチャ画像を表示するために、GFPまたはPIのボタンを押してください。ディスプレイからレイヤーを削除するには、もう一度同じボタンを押す、または、レイヤーを重ね合わせ、複数レイヤのボタンをタッチします。
14. 細胞が特定のチャネルを介してカウントされる方法を特定する、タッチサークル 。蛍光を発現していない唯一の明視野チャネルを介してカウントされた細胞は、青色の丸で囲まれる。これは、その特定のセル（つまりPI陰性）のライブであることを示します。
15. GFPを発現する細胞は、GFPのチャンネルで見られるだろう、と緑の丸で囲まれる。死細胞のレッドで染色された死細胞がPIのチャンネルで見られるだろう、と赤の丸で囲まれる。
16. 赤と緑のチャンネルの両方で計数した細胞は、黄色の丸で囲んだされる、これは細胞がGFPを発現することを示しているだけでなく、PIで染色し、そのためデッドです。
17. 時折、黒い丸が画面に表示される、これらは特定されているオブジェクトですが、セルサイズに基づいて分析から除外されています。
18. fiに引き続きNEチューン蛍光を発現している各セルは、適切な色で丸で囲まれるまで、ここで説明した手順を使用して、蛍光ヒストグラムのしきい値。
19. すべての解析パラメータは、自動的にデータのタブの下に保存されます。タリサイトメーターは、約500サンプルの実行からデータファイルを格納することができます。
20. データのタブに保存されている各ファイルには、再分析可能です。 [データ]タブからファイルを選択することで、それが開き、すべてのヒストグラムとのレイヤーがアクティブにされます。
21. アーカイブデータにしてレポートを生成、サイトメーターに格納されたデータはUSBドライブを使用してコンピュータに転送される場合があります。

4。代表的な結果：

タリイメージベースのメ​​ーターは核をターゲットとしたGFP BacMam 2.0発現構築物で形質導入した細胞の蛍光タンパク質の発現レベルを測定するために使用されていました。 4つの代表の細胞型が（U2OS、293MSR、HEKn、およびCHO - S）導入した。これらの細胞株の場合は、GFPを発現した細胞の数は、タリサイトメーターによって報告され、フローサイトメーターで分析した同じサンプルからのデータと比較した。さらに、細胞は距骨のメーターで、フローサイトメーターで両方死んだ細胞集団を識別するためのTALI生存キットを用いて死細胞レッド試薬で染色した。

図2のグラフィック表現は、GFPを発現していた各細胞型のための総人口のパーセントを示しています。これらのデータはTALIサイトメーターはフローサイトメーターによって生成されるデータに匹敵するデータを生成することを示している。

図1。細胞は適切に分析前に集中するべきである。分析のために適切な細胞濃度と距骨細胞分析のスライドは、（1 × 10 ^5〜1 × 10 ^7個の細胞が推奨されている）。（左）オートフォーカスでは細胞は一様にDか各セルの周りに明るいハローを持つ細胞全体に箱舟、（CENTER）は明るいがあるとき、背景とセルの端との間の遷移があいまいであり、細胞が未定義の境界を持っている（右）のセルは多分overcounted時に細胞がundercountedされることがありますセンターと暗い周囲。

図2。タリイメージベースのメーターからの蛍光タンパク質の発現データは、フローサイトメトリーを使用して得られたものと同等です。生存細胞における4つの細胞株で計算されたGFP -発現の結果を並べて比較。

Discussion

私達はちょうど生存率カウントを実行すると距骨イメージベースサイトメーターを用いてGFPの発現を評価するための手順を詳しく説明している。アポトーシス、RFPおよび非形質導入細胞を用いた細胞の生存率の分析：同じ手順を使用して、このサイトメーターはを含む他の多くのアッセイを行うことができる。

細胞の生存率、遺伝子の発現とアポトーシスの蛍光アッセイは、生物医学研究^7-12の主要な手法となっています。過去、別の計測で細胞に関する定量的視覚情報を取得するために使用されています。異質集団内の細胞についての定量的な情報がフローサイトメトリーの使用によって獲得されているが、視覚的または定性的な情報は、蛍光顕微鏡^1〜4の使用を通じて収集されています。ここで、我々は人口と個々の細胞の研究の間のギャップを埋める技術を提示する。タリイメージベースメーター、定量的なDAを使用して個々の細胞または細胞集団についてのTAと視細胞のデータを同時に収集することができます。タリの楽器は、遺伝子発現の評価、アポトーシスアッセイ、薬効の研究、および疾患の進行の評価を含むアプリケーションの範囲に使用できます。

タリのイメージベースのメ​​ーターのキャプチャとは、細胞の亜集団に関する情報を取得できるように、明視野、赤蛍光と緑の蛍光画像を解析。例えば、このアッセイでは、我々は、死細胞赤の色素を用いてGFP発現細胞集団内で生細胞から死細胞を区別することができた。これは、GFPを発現する生細胞の測定で精度を与え、下流の処理のための有用な細胞の集団を識別します。人口の死んだ細胞が環境条件（例えば、トリプシンまたは解除されることによって発生する通常の培養中の細胞死や細胞死を含むさまざまなソースから生じる可能性があることに注意することが重要です選択されたトランスフェクション/伝達方法）により誘導されるヘッドホンATH。

ここでは、U2OS細胞と距骨サイトメーターの使用を示します。同様のメソッドはほとんどの哺乳類と昆虫細胞を用いて行うことができる。各細胞株の場合は、タリサイトメーターは、標準的な蛍光顕微鏡を用いた細胞の目視検査では不可能な定量的なGFPの発現データを、作り出した。これらの結果はフローサイトメトリーに匹敵するものですが、それらは時間の割合で収集されます。サイトメーターは、理想的には1 × 10 ^5〜1 × 10 ⁷細胞/ mLの濃度で、直径60ミクロン〜5ミクロンの間で正確にカウントする細胞の能力です。

それは、死細胞レッド染色プロトコールここで説明するなど、そのほとんどの標準的な染色プロトコールを、指摘することが重要だ、生細胞と死細胞を区別するために、ヨウ化プロピジウムを使用してください。 STのために透過処理された細胞の生存性を評価する際にこれが課題を提示PIが危険にさらさ膜で任意のセルを染色するので、細胞内のマーカーのaining。緑色または赤色の蛍光チャネルで検出することができる任意の蛍光色素やタンパク質が距骨イメージベースのメーターで分析することができますので、今後の研究では、アミン反応性可能性の色素⁴として、代替染料の使用を、探検することがあります。 Perfetto らによる2006年の調査^。12は、これら^の色素は生と死細胞集団を区別することで使いやすく、再現性であることがわかった。

タリはそれが実行できるアッセイの種類に関して制限があることに注意してください。楽器が使用する目的は4Xですので、例えば、、カウント動作は、より大きなセルのタイプに制限されています：このようなミトコンドリアや小胞などのサブ細胞構造、および細菌細胞を定量することができます。また、距骨の検出チャネルはチャネル内で励起し、放出する蛍光物質に限定されていることに注意してください。一方、YFPと明るいmCherry信号C検出され、調光器mCherry信号はできません。最後に、タリは懸濁液中の細胞を分析。それは正確にスライドに接着した細胞をカウントされません。また、いくつかの酵母および初代培養細胞を含む不規則な形の細胞を、カウントするための限られた能力がある間。

さらに、今後の研究は、おそらく細胞内マーカーの発現を評価する上でこのシステムの使用に対処します。個々の染料は、Invitrogenのオンラインスペクトルビューアーツールを（使用して、隣接チャンネルとのスペクトルの重複をチェックすることができますwww.invitrogen.com /スペクトルビューアー ）。この技術の新しさを考えると、アプリケーションの完全な範囲は、まだ発見されています。

要約すると、ここに示したタリイメージベースのメ​​ーターは、個々のセルの評価だけでなく、セルを可能にする、細胞集団の同時可視化と分析を可能にする新しい技術を紹介シンプルなワークフローで、コンパクトな形式でlの集団。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tali Image-Based Cytometer	Invitrogen	T10796
Tali Cellular Analysis Slides, 50 Slides	Invitrogen	T10794
Tali Cellular Analysis Slides, 500 slides	Invitrogen	T10795
Tali Viability Kit - Dead Cell Red	Invitrogen	A10786
Tali Viability Kit - Dead Cell Green	Invitrogen	A10787
Tali Apoptosis Kit	Invitrogen	A10788
U2OS cells