Summary
We hebben 3D coculture modellen voor live-cell imaging in real-time van de interacties tussen borsttumor cellen en andere cellen in hun micro-omgeving die van invloed zijn progressie naar een invasieve fenotype. Deze modellen kunnen dienen als preklinisch schermen voor drugs te paracriene-geïnduceerde proteolytische, chemokine / cytokine en kinase pathways die betrokken zijn bij invasiviteit richten.
Abstract
We hebben 3D coculture modellen, die we term MAME (m ammary een rchitectuur en m icroenvironment e ngineering), en ze gebruikt voor live-cell imaging in real-time van de cel: cel interacties. Onze algemene doel was om modellen die de architectuur van preinvasive laesies van borst om hun progressie te bestuderen om een invasieve fenotype recapituleren te ontwikkelen. In het bijzonder hebben we modellen ontwikkeld om de interacties tussen de pre-maligne borst epitheelcellen varianten en andere celtypes van de tumor micro-omgeving die zijn betrokken bij het verbeteren of het verminderen van de progressie van preinvasive borst epitheelcellen van invasieve ductale carcinomen te analyseren. Andere celtypen onderzocht tot nu toe zijn myo-cellen, fibroblasten, macrofagen en bloed-en lymfestelsel microvasculaire endotheelcellen. Naast de MAME modellen, die zijn bedoeld om de cellulaire interacties in de borst vatten tijdensde voortgang van kanker, hebben we vergelijkbare modellen voor de progressie van prostaatkanker.
Hier illustreren we de procedures voor het vaststellen van de 3D-cocultures samen met het gebruik van live-cell imaging en een functionele proteolyse test om de overgang van cocultures van de borst ductaal carcinoma in situ (DCIS) cellen en fibroblasten tot een invasieve fenotype loop van de tijd volgen, in dit geval over drieëntwintig dagen in kweek. De MAME cocultures bestaan uit meerdere lagen. Fibroblasten zijn ingebed in de onderste laag van type I collageen. Op die bevindt zich een laag van gereconstitueerde basaal membraan (RBM), waarop DCIS cellen worden gezaaid. Een laatste toplaag van 2% RBM is opgenomen en aangevuld met elke verandering van de media. Om het beeld proteolyse geassocieerd met een toename van een invasieve fenotype we kleurstof-gehard (DQ) fluorescerende matrixeiwitten (DQ-collageen I gemengd met de laag van collageen I en DQ-collageen IV gemengd met de middelste laag van rBM) en observeer levende culturen met behulp van confocale microscopie. Optische onderdelen worden vastgelegd, verwerkt en gereconstrueerd in 3D met Volocity visualisatie-software. In de loop van 23 dagen in MAME cocultures, de DCIS-cellen prolifereren en samenvloeien tot grote invasieve structuren. Fibroblasten migreren en opgenomen worden in deze invasieve structuren. Fluorescente proteolytische fragmenten van collageen zijn die samen met het oppervlak van DCIS structuren intracellulair, en gedispergeerd door de omgevende matrix. Geneesmiddelen die op proteolytische, chemokine / cytokine en kinase-routes of wijzigingen in de cellulaire samenstelling van de cocultures kan het invasieve verminderen, wat suggereert dat MAME modellen worden gebruikt preklinische schermen voor nieuwe therapeutische methoden.
Protocol
1. Bereid DQ-substraten
- Laat gevriesdroogd DQ-substraten tot kamertemperatuur opwarmen voor het openen van flesjes, stock oplossing van 1 mg / ml DQ-substraat voor te bereiden in gedeïoniseerd water, verdeel het in 50 ul aliquots en bewaar bij 4 ° C.
Het kan noodzakelijk DQ-substraat roeren in een ultrasoon waterbad ~ 5 min en verhit tot 50 ° C dispersie te vergemakkelijken.
- Ontdooien RBM op ijs gedurende de nacht bij 4 ° C; RBM worden behandeld op ijs allen tijde.
- Om 10X fosfaat te gebufferde zoutoplossing (PBS), los 80 g NaCl (1,37 M), 2 g KCl (0,027 M), 14,4 g Na 2 HPO 4 (1 M) en 2,4 g KH PO 2 4 (0,02 M) 800 ml ultrapuur water. De pH van PBS buffer tot 7,4 met 1,0 M HCl. Breng het volume op 1 liter, steriliseer door filtratie.
- Bereid collageen I oplossing op ijs gekoeld 8 delen collageen I 1 deel gekoeld 10X PBS. Pas de pHmengsel bij 7.2-7.6 met steriele 0,1 M NaOH. Controleer de pH met pH en corrigeer het eindvolume 10 delen met steriel water.
- Bereid DQ-collageen I: I collageen matrix door verdunnen DQ-collageen I collageen I oplossing in een prechilled buis tot een eindconcentratie van 25 ng / ml en 2,4 mg / ml.
- Bereid DQ-collageen IV bereide basaalmembraan (RBM) matrix door verdunnen DQ-collageen IV in RBM (Cultrex of Matrigel) in een prechilled buis tot een eindconcentratie van 25 ng / ml en 12-15 mg / ml. Meng op het ijs met zachte pipetteren om te voorkomen dat het creëren van bubbels.
2. Bereid MAME cocultures
Zie Figuur 1 een schematisch diagram van cocultures.
- Plaats twee rechthoekige plastic dekglaasjes (gesteriliseerd in alcohol 70% gedurende 10 minuten en aan de lucht gedroogd) in een 35-mm cultuur schotel of gebruik een IbiTreat 35-mm μ-schotel. Routebeschrijving hier zijn voor zowel de dekglaasjes en μ-gerechten, die we gebruiken voor studentensterft rechtop microscoop. Voor studies over een omgekeerde microscoop, gebruiken we alleen μ-gerechten.
- Meng het gewenste aantal fibroblasten met DQ-collageen I: I collageen matrix. Voor langdurige cocultures in figuren 2 en 3, we 500 fibroblasten in 10 ul medium plus 60 ul DQ-collageen I: I collageen matrix.
- Een 100-il micropipettor zorgvuldig pipet verdeeld 70 pi fibroblast: DQ-collageen I: collageen I matrix over het gehele oppervlak van elk dekglaasje en bij 37 ° C in een bevochtigde incubator verlaten zonder CO 2 gedurende 30 minuten tot stollen.
- Transfer 35-mm schaaltjes met dekglaasjes tot 37 ° C incubator met 5% CO2 gedurende 10 minuten in evenwicht.
- Verwijderen uit incubator en laat de 35-mm schaaltjes onder de kap totdat ze op kamertemperatuur komen.
- Voeg 60 pi DQ-collageen IV: RBM matrix bovenop de gestolde DQ-collageen I: collageen I matrix met ingebedde fibroblasten. Met pipetpunt, carefully verspreid DQ-collageen IV: RBM matrix gelijkmatig, het vermijden van krassen op de fibroblast: DQ-collageen I: I collageen matrix.
- Transfer 35-mm schaaltjes met dekglaasjes tot 37 ° C incubator met 5% CO2 gedurende 10 min te stollen. Terwijl de DQ-collageen IV: RBM matrix wordt hard maken, trypsinize en tel epitheelcellen.
- Plaats 50 ul van een epitheliale / tumorcel schorsing op dekglaasjes bedekt met DQ-collageen IV: RBM matrix. Plaats 35-mm schaaltjes met de dekglaasjes in een 37 ° C incubator. Laat 40 tot 60 min voor de cellen te hechten aan DQ-collageen IV: RBM matrix. Voor langdurige cocultures in figuren 2 en 3, we 2500 epitheelcellen of tumorcellen.
- Voeg 2 ml kweekmedium dat 2% RBM voor elke 35-mm schotel. Als op een behandelingen met geneesmiddelen, moeten deze worden toegevoegd op dit moment.
- Incubeer gedurende gewenste periode van tijd is voordat beeldvorming. Voor de lange termijn culturen, dient de pers worden veranderd om de 3-4 dagen. De cellen kunnen worden gehandhaafdin hun normale kweekmedium. Voor MAME cocultures van borst-cellijnen gebruiken we Epitheliale basismedium (MEBM-PRF), aangevuld met MEGM SingleQuots.
3. Voer 4D (3D + tijd) beeldvorming van levende MAME cocultures door confocale microscopie
- Voor de geïllustreerde proof-of-principle studie, werden MAME cocultures gelabeld met een fluorescerende cel tracking kleurstof volgens onze gepubliceerde procedure 1. Na wassen met PBS, werden cocultures geïncubeerd met 5 pM CellTracker Orange MEGM medium gedurende 45 minuten in een 37 ° C incubator, opnieuw gewassen met PBS en geïncubeerd met voorverwarmde MEGMmedium gedurende 30 minuten bij 37 ° C met 5% CO2 incubator voor beeldvorming .
- Afbeelding MAME cocultures leven in een lage vergroting (10x, water dompelen lens) op een Zeiss LSM-510 META confocale microscoop.
- Optische delen vastgelegd met tussenpozen gedurende de gehele diepte van de structuren. Voor onze studies hebben we vast te leggen optische secties op 10urn intervallen.
- Gebruik optische secties om beelden te reconstrueren in 3D. We maken gebruik van Volocity software om 3D-reconstructies te genereren.
- Maak films van de 3D-reconstructies, zodat structuren, cel: cel interacties en interacties met de omgeving matrices kunnen worden gevisualiseerd. We hebben films met QuikTime Player 7.
4. Representatieve resultaten
De MAME cocultures dat we ontwikkeld zijn van een soepel experimenteel model voor live-cell imaging in real-time van de interacties tussen de verschillende cellulaire bestanddelen die een borsttumor en de micro-omgeving omvatten. Hier laten we zien het vermogen van MAME modellen naar cel recapituleren: cel interacties tijdens borstkanker progressie en van live-cell imaging aan die interacties in de tijd te volgen. We illustreren de mogelijkheid om beeld interactie tussen een preinvasive MCF10.DCIS menselijke borst cellijn en een menselijke borstkanker-geassocieerde fibroblasten lijn, WS-12Ti, meer daneen periode van meer dan drie weken in de cultuur. De cocultures werden afgebeeld op 3, 16 en 23 dagen. Optische delen door het totale volume van de cocultures werden gereconstrueerd 3D en representatieve voorbeelden gegeven van elk van de drie tijdstippen in figuur 2. De rode fluorescentie in Figuur 2 de MCF10.DCIS en WS-12Ti cellen. Onderscheid te maken tussen de twee celtypen en voor de lange termijn cocultures, kan men transfecteren of individuele cel-typen hadden transduceren met fluorescerende eiwitten om tot oprichting van de culturen. Een MAME coculture van MCF10.DCIS en WS-12Ti cellen die differentieel voorzien fluorescente eiwitten voor identificatie wordt in figuur 3.
Door het opnemen van substraten, in dit geval DQ-collageen, in de MAME cocultures kunnen we beoordelen en veranderingen kwantificeren tijd in Proteolyse verbonden overgang naar een invasieve fenotype. We hebben werkwijzen voor het kwantificeren van de fluorescerende splitsingsprodukten die resulterenvan DQ-collageenafbraak 2,3. We normaliseren afbraakproducten in de hele 3D-volume van de MAME cocultures op een per cel basis van het energieverbruik en het tellen van celkernen. Bovendien kunnen we lokaliseren van de degradatie van extracellulaire en intracellulaire compartimenten en kwantificeren van het totaal, intracellulaire en extracellulaire afbraakproducten zoals we al eerder 2 beschreven. De groene fluorescentie in de figuren 2 en 3 is klievingsproducten van de twee DQ-collageen substraten. Op dit moment verschillend gelabeld collageen is niet zou kunnen we onderscheiden afbraak van type IV collageen en afbraak van type I collageen.
De interacties in de MAME cocultures zijn dynamisch en de tijd kunnen veranderen. Om temporele en dynamische informatie te verkrijgen, kunnen dezelfde beeldveld worden afgebeeld en optische onderdelen die door de gehele monster van het volume continu gedurende een periode van minuten tot wekendus het verzamelen van gegevens in 4-D. In figuur 2 illustreren we nogal dramatische veranderingen die zich voordoen meer dan 23 dagen: veranderingen in het aantal cellen, celmigratie en cel interacties, structuur volumes, structuur vormen, afwijkingen van de structuren van de bolvorm, invasieve uitwassen en proteolyse. Verder hebben we ook aantonen een totale verandering in volume als gevolg van de MAME cocultures vernederende hun omgeving extracellulaire matrix in deze periode. Op drie dagen in figuur 2A, het volume 110000 um 3. In tegenstelling, het volume van de MAME cocultures bij 16 en 23 dagen slechts 46.250 pm 3, zoals weergegeven in figuren 2B en C.
Figuur 1. Schematische weergave van MAME cocultures. Plastic dekglaasje is bekleed met collageen I, met DQ-collageen I en fibroblasten (magenta). Een 2e laag van gereconstitueerde basaal membraan (RBM) met DQ-collagen IV wordt toegevoegd. Tumorcellen (rood) worden uitgeplaat aan de bovenkant en 2% RBM in cultuur media is bedekt (witte stippen) met elke verandering van de media. Groen vertegenwoordigt de fluorescerende splitsingsproducten van DQ-collageen I en IV.
Figuur 2. MAME cocultures van MCF10.DCIS menselijke borst cellen en WS-12Ti mensen in de moedermelk fibroblasten. De fibroblasten zijn ingebed in collageen I / DQ-collageen I en bedekt met RBM met DQ-collageen IV. De DCIS cellen werden vervolgens uitgezaaid op de RBM-en bedekt met media die 2% RBM. In de 23 dagen in coculture hier weergegeven er celproliferatie, afbraak van DQ-collageen IV en I (groen) en collageen matrices als aangegeven door de beperking van de omvang van de cocultures. De cellen werden gelokaliseerd door middel van etikettering met CellTracker Oranje in situ voor de beeldvorming (rood). Dezelfde live-cocultures werden gemeten over de 23 dagen met beelden die door confocal microscopie op 3, 16 en 23 dagen van coculture. De resulterende optische schijfjes werden gereconstrueerd 3D met Volocity software. Vergroting, 10X.
Figuur 3. MAME 16 dagen cocultures van MCF10.DCIS menselijke borst cellen en WS-12Ti de moedermelk fibroblasten die express RFP (rood) en YFP (wit), respectievelijk. Cocultures opgericht en geanalyseerd als in figuur 2. De beide celtypen hier was echter is verschillend zodat aangegeven dat zij kunnen worden onderscheiden van elkaar. De hogere vergroting beelden in deze figuur in vergelijking met die in figuur 2 illustreren Proteolyse van DQ-collageen IV aan het oppervlak van de DCIS cellen en diffuse Proteolyse van DQ-collageen I in gebieden bij de fibroblasten. Vergroting, 20X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zoals blijkt kan de MAME cocultures worden gebruikt voor levende cellen beeldvorming in real-time van wisselwerking tussen de celbestanddelen een borsttumor en micro omvatten. In lopende studies in ons laboratorium gebruikten we MAME cocultures om proteolytische verbonden overgang van DCIS tot invasieve carcinoom, en de wisselwerking tussen proteolytische en andere routes die betrokken bij de overgang zoals chemokine / cytokine / groeifactor trajecten identificeren . We laten verder zien dat MAME-modellen kunnen worden gebruikt als een instrument voor het screenen van de effecten van kleine molecule inhibitoren, blokkerende antilichamen of shRNAs dat proteolytische / chemokine / cytokine / groeifactor paden 3-5 moduleren. De MAME modellen worden gebruikt voor levende cellen beeldvorming van tumorgroei, invasie en Proteolyse dan tijd variërend van enkele minuten en uren, zoals we hebben eerder aangetoond 6,7 tot weken als hier in de figuren 2 en 3 weergegeven. Deinteracties worden waargenomen zijn tussen de cellen van een soort, dat wil zeggen, menselijke tumorcellen en tumor-geassocieerde cellen, in plaats van tussen menselijke tumorcellen en muis stromale cellen als in intravitale beeldvorming 8. De MAME modellen zijn van een soepel systeem. Moleculen van belang kan zijn gedownreguleerd met shRNAs in individuele celtypen voorafgaand aan coculturing, zodat hun bijdrage in die cel soort tot een achteruitgang van DQ-collageen kunnen worden afgebeeld en gekwantificeerd in 3D 2. Geconditioneerde media van MAME modellen worden bemonsterd veranderingen in de secretie van proteasen, cytokines, etc. meten verkregen informatie geeft experimentele basis voor het testen van de effecten van kleine molecule inhibitoren, blokkerende antilichamen, etc.
De cellulaire samenstelling van MAME cocultures gemakkelijk kan worden gemanipuleerd, zodat men kan gebruiken om de bijdrage van andere celtypes te vinden in de tumor micro-omgeving (bv myo-cellen, monocyten, endotheelcellen van het bloed te beoordelenschip en lymfatische oorsprong) tot maligne progressie 6,7. Het aantal verschillende celtypes geplaatste, de verhouding van de ene cel naar een ander en de tijd in cultuur zal afhangen van de specifieke gebruikte celtypes en de experimentele vraag. MAME modellen kunnen ook worden uitgebreid tot de effecten van veranderingen in de micro-omgeving rondom de borsttumoren, bijvoorbeeld, pH, zuurstofspanning te beoordelen. Zo hebben we aangetoond dat als MAME cultures worden op een licht zure pH, zoals, pH 6,8, is er een toename proteolyse en impact. Daarnaast hebben we ook laten zien dat we kunnen gelijk cocultures gebruiken om andere vormen van kanker, zoals prostaatkanker te modelleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund, voor een deel, door de National Institutes of Health R01 CA131990 (BFS en RRM). Live-cell imaging werd uitgevoerd in de Microscopie, Imaging en Cytometry ondersteund Resources Core, gedeeltelijk door NIH Center subsidie P30 CA22453 aan de Karmanos Kanker Instituut, Wayne State University en door de Perinatologie Research afdeling van de National Institutes of Child Health and Development , Wayne State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reconstituted basement membrane (Cultrex) | Trevigen Inc. | 3445-005-01 | Comparable to Matrigel (BD Biosciences) |
| Collagen I | Cohesion Laboratories | 5005-B | |
| DQ-substrates (collagen I, IV) | Invitrogen | DQ-col I-D12060 DQ-colIVD12052 | |
| 22-mm plastic coverslips | Fisher Scientific | 12-547 | Cut in half, leave in 70% ethanol for 10 min and air-dry before use. |
| Cell culture medium | Lonza Inc. | MEBM-PRFCC-3153 MEGM CC-4136 | Phenol red-free |
| ibiTreat μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Volocity software | PerkinElmer, Inc. | Version 5.5 | Other brands of imaging software can be used to generate 3D reconstructions and movies. |
References
- Sameni, M., Dosescu, J., Sloane, B. F. Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis. Mol. Imaging. 2, 159-175 (2003).
- Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions. Curr. Protoc. Cell Biol. 39, (2008).
- Jedeszko, C., Victor, B. C., Podgorski, I., Sloane, B. F. Fibroblast hepatocyte growth factor promotes invasion of human mammary ductal carcinoma in situ. Cancer Res. 69, 9148-9155 (2009).
- Sameni, M. Functional live-cell imaging demonstrates that beta1-integrin promotes type IV collagen degradation by breast and prostate cancer cells. Mol. Imaging. 7, 199-213 (2008).
- Li, Q. p21-activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer. Neoplasia. 10, 314-328 (2008).
- Sameni, M. Imaging and quantifying the dynamics of tumor associated proteolysis. Clin. Exp. Metastasis. 26, 299-309 (2009).
- Cavallo-Medved, D. Live-cell imaging demonstrates that proteases in caveolae of endothelial cells degrade extracellular matrix. Exp. Cell. Res. 315, 1234-1246 (2009).
- Fukumura, D. Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models. Microcirculation. 17, 206-225 (2010).
