Summary
Nós desenvolvemos modelos 3D para co-cultura de células de imagem ao vivo em tempo real das interações entre as células tumorais de mama e outras células em seu microambiente que a progressão de impacto para um fenótipo invasivo. Estes modelos podem servir como telas pré-clínicos de medicamentos para atingir parácrina induzidas proteolíticas caminhos, quimiocinas / citocina e quinase envolvidos na invasão.
Abstract
Nós desenvolvemos modelos de co-cultura em 3D, que MAME prazo (m ammary um rchitecture e m icroenvironment ngineering e), e os usou para live-célula de imagem em tempo real da célula: interações celulares. Nosso principal objetivo foi desenvolver modelos que recapitulam a arquitetura das lesões mamárias pré-invasivo para estudar a sua progressão para um fenótipo invasivo. Especificamente, desenvolvemos modelos para analisar as interacções entre pré-malignas da mama variantes de células epiteliais e outros tipos de células de tumor que o microambiente têm sido implicados na melhoria ou reduzir a progressão de células de mama preinvasive epiteliais para carcinomas ductais. Outros tipos de células estudadas até à data são células mioepiteliais, fibroblastos, macrófagos e células do sangue e linfáticos microvasculares endoteliais. Além dos modelos Mame, que são concebidos para recapitular as interacções celulares dentro da mama duranteprogressão do câncer, desenvolvemos modelos comparáveis para a progressão do câncer de próstata.
Aqui temos ilustram os procedimentos para o estabelecimento das coculturas 3D, juntamente com a utilização de vivo de células de imagem e um ensaio de proteólise funcional a seguir a transição de coculturas de carcinoma da mama ductal in situ (CDIS) células e fibroblastos para um fenótipo invasivo ao longo do tempo, em Neste caso mais de vinte e três dias em cultura. O coculturas MAME consistem em camadas múltiplas. Os fibroblastos são incorporados na camada inferior de colagénio tipo I. Em que está colocada uma camada de membrana basal reconstituída (FRP) sobre o qual as células são semeadas DCIS. A camada final topo da RBM 2% incluído e repostos a cada mudança de mídia. Para a proteólise da imagem associada com a progressão para um fenótipo invasivo, usamos corante-temperados (DQ) proteínas fluorescentes matriz (dq-colagénio I misturado com a camada de colagénio I e DQ-colagénio IV misturado com a camada do meio de rBM) e observar culturas vivas utilizando microscopia confocal. Secções ópticas são capturados, processados e reconstruído em 3D com o software de visualização Volocity. Ao longo de 23 dias coculturas em MAME, as células DCIS proliferar e coalescer em grandes estruturas invasivos. Fibroblastos migram e se incorporaram essas estruturas invasivas. Fluorescentes fragmentos proteolíticos dos colagénios são encontrados em associação com a superfície de estruturas CDIS, intracelularmente, e também dispersa por toda a matriz circundante. Drogas que proteolítica alvo de quimiocinas, / citocina e quinase vias ou modificações na composição celular do coculturas pode reduzir a capacidade de invasão, sugerindo que os modelos de MAME pode ser usado como telas de pré-clínicos para novas abordagens terapêuticas.
Protocol
1. Prepare DQ-substratos
- Permitir liofilizada DQ-substratos a aquecer até à temperatura ambiente antes de frascos de abertura, preparar solução stock de 1 mg / ml de DQ-substrato em água desionizada, dividem-se em alíquotas de 50 ul e armazenar a 4 ° C.
Pode ser necessário agitar DQ-substrato num banho de água ultra-sons durante 5 min ~ e calor a 50 ° C para facilitar a dispersão.
- RBM descongelamento em gelo durante a noite a 4 ° C; RBM devem ser manuseados em gelo em todos os momentos.
- Para fazer com que o fosfato de 10X tampão salino (PBS), dissolver 80 g de NaCl (1,37 M), 2 g de KCl (0,027 M), 14,4 g de Na 2 HPO 4 (1 M), e 2,4 g de KH 2 PO 4 (0,02 M) em 800 ml de água ultrapura. Ajustar o pH da solução-tampão PBS a 7,4 com 1,0 M de HCl. Traga volume de 1 litro, esterilizar por filtração.
- Preparar solução de colagénio I em gelo: 8 partes de colagénio refrigeradas I para 1 parte de refrigerados PBS 10X. Ajustar o pHde mistura para 7,2-7,6 usando estéril 0,1 M de NaOH. Verificar o pH com tiras de pH e ajustar o volume final para 10 partes de água estéril.
- Preparar DQ-colagénio I: colagénio I matriz diluindo DQ-colagénio I, em solução de colagénio I, em um tubo previamente arrefecido a uma concentração final de 25 ug / ml e 2,4 mg / ml, respectivamente.
- Preparar DQ-colagénio IV: membrana basal reconstituída (FRP) da matriz através da diluição de DQ-colagénio IV em RBM (Cultrex ou Matrigel) em um tubo previamente arrefecido a uma concentração final de 25 ug / ml e 12-15 mg / ml, respectivamente. Misture no gelo usando pipetagem suave para evitar a criação de bolhas.
2. Prepare MAME coculturas
Ver Figura 1 para um diagrama esquemático de coculturas.
- O local de duas lamelas de plástico rectangulares (esterilizado em álcool a 70% durante 10 min e seco ao ar) em um prato de cultura de 35 mm ou utilizar um IbiTreat 35-mm μ louça. Directions aqui são para ambos os lamínulas e u-Pratos, que usamos para alunosmorre em um microscópio vertical. Para os estudos sobre um microscópio invertido, usamos apenas u-Pratos.
- Misture o número desejado de fibroblastos com DQ-colágeno I: colágeno tipo I da matriz. Para os coculturas de longo prazo ilustrados nas Figuras 2 e 3, usamos 500 fibroblastos em 10 uL de meios mais 60 uL de DQ-colagénio I: colagénio I da matriz.
- Usando uma micropipeta 100-uL, cuidadosamente pipeta e espalhar 70 uL de fibroblastos: DQ-colagénio I: colagénio I matriz sobre toda a superfície de cada lamela e deixar a 37 ° C numa incubadora humidificada sem CO 2 durante 30 min a solidificar.
- Transferência de 35 mm pratos contendo lamelas de 37 ° C incubadora com 5% de CO 2 durante 10 min para equilibrar.
- Remover do incubador e deixar os pratos de 35 mm sob a capa até que atinjam a temperatura ambiente.
- Adicionar 60 ul de DQ-colágeno IV: RBM matriz em cima do solidificou DQ-colágeno I: colágeno I matriz com fibroblastos incorporados. Com pipeta de ponta, carefully espalhar DQ-colágeno IV: RBM matriz uniformemente, evitando coçar o fibroblasto: DQ-colágeno I: colágeno tipo I da matriz.
- Transferência de 35 mm pratos contendo lamelas de 37 ° C incubadora com 5% de CO 2 durante 10 min a solidificar. Enquanto o IV DQ-colágeno: RBM matriz está solidificando, trypsinize e contagem de células epiteliais.
- Colocar 50 ul de uma suspensão de células epiteliais / tumor em lamelas revestidas com DQ-colágeno IV: RBM matriz. Colocar 35-mm pratos contendo as lamelas numa incubadora a 37 ° C. Permitir 40-60 min para as células para anexar DQ-colagénio IV: RBM matriz. Para os coculturas de longo prazo ilustrados nas Figuras 2 e 3, usamos 2500 células epiteliais ou tumor.
- Adicionar 2 ml de meio de cultura contendo 2% RBM para cada prato de 35 mm. Se fazer todos os tratamentos de drogas, as drogas devem ser adicionados no momento.
- Incubar durante período de tempo desejado antes de imagem. Para culturas a longo prazo, a mídia deve ser trocado a cada 3-4 dias. As células podem ser mantidasem seu meio de cultura normal. Para MAME coculturas de linhas de células de mama, usamos Meio Basal Epitelial (MEBM-PRF) suplementado com SingleQuots MEGM.
3. Execute 4D (3D + tempo) imagens ao vivo de MAME coculturas por microscopia confocal
- Para os estudos de prova de princípio ilustrados, MAME coculturas foram marcadas com um corante fluorescente de células de rastreamento de acordo com o nosso processo publicado 1. Após lavagem com PBS, coculturas foram incubadas com 5 Laranja CellTracker uM em meio MEGM durante 45 min em um incubador a 37 ° C, lavou-se novamente com PBS e incubadas com MEGMmedium pré-aquecido durante 30 min em 37 ° C com 5% de CO 2 incubadora antes de imagem .
- Imagem MAME coculturas viver em um pequeno aumento (lente 10X de água, mergulhando) em um microscópio Zeiss LSM META-510 confocal.
- Secções ópticas são capturados em intervalos ao longo de toda a profundidade das estruturas. Para os nossos estudos, podemos capturar secções ópticas em 10intervalos uM.
- Use secções ópticas para reconstruir imagens em 3D. Nós usamos software Volocity para gerar reconstruções em 3D.
- Faça filmes das reconstruções em 3D de modo que estruturas da célula,: interações celulares e interações com as matrizes circundantes podem ser visualizados. Fizemos filmes com QuikTime Player 7.
4. Os resultados representativos
O MAME coculturas que desenvolvemos são um modelo tratável experimental para live-célula de imagem em tempo real das interações entre os vários constituintes celulares que compõem um tumor de mama e seu microambiente. Aqui demonstramos a capacidade de modelos MAME recapitular celular: interações celulares durante a progressão do câncer de mama e de live-célula de imagem para acompanhar essas interações ao longo do tempo. Nós ilustramos a capacidade de interações entre uma imagem pré-invasivo linha celular humana MCF10.DCIS de mama e um câncer humano de mama associado à linha de fibroblastos, WS-12TI, sobreum período de mais de três semanas em cultura. O coculturas foram fotografadas em 3, 16 e 23 dias. Secções ópticas através de todo o volume do coculturas foram reconstruídos em exemplos 3D e representativo são apresentados para cada um dos três pontos temporais na Figura 2. A fluorescência vermelha na Figura 2 representa a MCF10.DCIS e WS-12TI células. Para discriminar entre os dois tipos de células e para a longo prazo coculturas, pode-se transfectar ou transduzir tipos de células individuais com as proteínas fluorescentes antes de estabelecer as culturas. Um co-cultura de MAME MCF10.DCIS e WS-12TI células que são diferencialmente marcadas com proteínas fluorescentes para a identificação é ilustrado na Figura 3.
Por substratos que incorporam, neste caso DQ-colagénios, no coculturas MAME, podemos avaliar e quantificar as mudanças ao longo do tempo em proteólise associada com a transição para um fenótipo invasivo. Nós estabelecemos métodos para a quantificação dos produtos de clivagem fluorescentes que resultamda DQ-colágeno degradação 2,3. Nós normalizar produtos de degradação em todo o volume 3D da coculturas MAME numa base por célula por marcação e contando os núcleos das células. Além disso, pode-se localizar a degradação de compartimentos extracelulares e intracelulares e quantificar os totais, produtos de degradação intracelular e extracelular como já descritos anteriormente 2. A fluorescência verde nas Figuras 2 e 3 representa produtos de clivagem dos dois DQ-colagénio substratos. Neste momento, colagénios diferencialmente-rotulados não estão disponíveis, que permitiria fazer a distinção entre a degradação do colagénio de tipo IV e da degradação de colagénio tipo I.
As interações no coculturas MAME são dinâmicas e podem mudar ao longo do tempo. Para se obter informação temporal e dinâmico, o mesmo campo de visão pode ser imaginadas secções ópticas e tomadas através de toda a amostra do volume repetidamente ao longo de um período de tempo de minutos a semana,assim, a coleta de dados em 4-D. Na Figura 2, ilustramos mudanças bastante dramáticas que ocorrem mais de 23 dias: mudanças no número de celular, migração celular e interações celulares, volumes de estrutura, formas de estrutura, desvios das estruturas de esfericidade, excrescências invasivos e proteólise. Além disso, também demonstram uma mudança global do volume devido à coculturas MAME degradantes seu meio circundante matriz extracelular ao longo deste período de tempo. Aos três dias, conforme ilustrado na Figura 2A, o volume é 110.000 iM 3. Em contraste, o volume do coculturas MAME menos 16 e 23 dias é apenas 46.250 iM 3, conforme ilustrado nas Figuras 2B e C.
Figura 1. Diagrama esquemático do MAME coculturas. Lamínula de plástico é revestido com colágeno tipo I, contendo DQ-colágeno I e fibroblastos (magenta). A 2 ª camada da membrana basal reconstituída (RBM) contendo DQ-collagen IV é adicionado. As células tumorais (vermelho) são colocadas em cima e RBM 2% em meios de cultura é sobreposta (pontos brancos) a cada mudança de mídia. O verde representa os produtos de dissociação fluorescentes de DQ-colágeno I e IV.
Figura 2. MAME coculturas de células mamárias humanas MCF10.DCIS e WS-12TI fibroblastos humanos da mama. Os fibroblastos foram incluídos em colágeno I / DQ-colágeno I e revestida com RBM contendo DQ-colágeno IV. As células CDIS foram semeadas na RBM e revestida com mídia contendo RBM 2%. Ao longo dos 23 dias em co-cultura ilustradas aqui, houve a proliferação celular, a degradação de DQ-colagénio IV e I (verde) e matrizes de colagénio, tal como indicado pela redução no volume do coculturas. As células foram localizados através de marcação com laranja CellTracker in situ, antes de imagem (vermelho). Os mesmos coculturas ao vivo foram observadas durante os 23 dias, com imagens captadas por cmicroscopia onfocal menos 3, 16 e 23 dias de co-cultura. As fatias resultantes ópticos foram reconstruídos em 3D com software Volocity. Ampliação, 10X.
Figura 3. MAME 16 coculturas dia de células mamárias humanas MCF10.DCIS e WS-12TI fibroblastos humanos da mama que expressam RFP (vermelho) e YFP (branco), respectivamente. Coculturas foram estabelecidos e analisados como na Figura 2. Os dois tipos de células mostradas aqui tinha, no entanto, sido diferencialmente rotulados de modo que pudessem ser distinguidas uma da outra. As imagens maior ampliação nesta figura, em comparação com aqueles na Figura 2, ilustram a proteólise de DQ-colagénio IV, à superfície das células DCIS e proteólise difusa de DQ-colagénio I, em áreas próximas dos fibroblastos. Ampliação, 20X.
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Discussion
Como demonstrado, o coculturas MAME pode ser usado para vivo de células de imagem em tempo real das interacções entre os vários constituintes celulares que compreendem um tumor da mama e do seu microambiente. Em estudos em curso no nosso laboratório, utilizou-se MAME coculturas para identificar vias proteolíticas associados com a transição de CDIS carcinoma ductal infiltrante, bem como as interacções entre as vias proteolíticas e outras vias envolvidas nesta transição, tais como as vias de quimiocina citocinas / / factor de crescimento . Nós mostrou ainda que os modelos de MAME poderia ser utilizado como uma ferramenta para a triagem dos efeitos de inibidores de moléculas pequenas, bloqueando anticorpos ou shRNAs que modulam proteolítica / quimiocina / citoquina / crescimento vias factor de 3-5. Os modelos MAME pode ser usado para vivo de células de imagem do crescimento do tumor, invasão e proteólise durante tempos que variam de minutos e horas, como já anteriormente demonstrado 6,7, a semana, como ilustrado aqui nas Figuras 2 e 3. Ointeracções sendo observados são entre as células de uma espécie, isto é, células tumorais humanas e associados a tumores de células, em vez de entre as células tumorais humanas e células estromais de rato como em imagiologia intravital 8. Os modelos MAME é um sistema tratável. Moléculas de interesse podem ser reprimidos com shRNAs em tipos de células individuais antes de coculturing de modo que sua contribuição nesse tipo de célula para a degradação do DQ-colágenos podem ser analisados e quantificados em 3D 2. Os meios condicionados a partir de modelos MAME podem ser amostrados para medir alterações na secreção de proteases, citocinas, etc A informação obtida fornece uma base experimental para testar os efeitos dos inibidores de moléculas pequenas, bloqueando anticorpos, etc
A composição celular de MAME coculturas pode ser prontamente manipulado de modo que uma possível utilizá-los para avaliar a contribuição de outros tipos celulares encontrados no microambiente do tumor (por exemplo, células mioepiteliais, monócitos, células endoteliais de sanguenavio e origem linfático) a progressão maligna 6,7. O número dos vários tipos de células semeadas, a proporção de um tipo de célula para o outro e ao período de tempo em cultura irá depender dos tipos de células específicos utilizados e questão experimental. Modelos de MAME também pode ser estendida para avaliar os efeitos das mudanças no microambiente em torno dos tumores de mama, por exemplo, pH, tensão de oxigênio. Por exemplo, mostrámos que quando as culturas MAME são mantidas a um pH ligeiramente ácido, isto é, pH 6,8, há um aumento na proteólise e invasividade. Além disso, também têm demonstrado que podemos usar coculturas semelhantes para modelar outros cancros como o cancro da próstata.
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Disclosures
Não temos nada a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado, em parte, pelo National Institutes of Health R01 CA131990 (BFS e MRR). Live-célula de imagem foi realizado no Núcleo de Recursos imagens de microscopia, e Citometria suportado, em parte, pelo NIH Centro de concessão P30 CA22453 ao Karmanos Cancer Institute, Wayne State University e pelo Poder Pesquisa Perinatologia do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento , Wayne State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reconstituted basement membrane (Cultrex) | Trevigen Inc. | 3445-005-01 | Comparable to Matrigel (BD Biosciences) |
| Collagen I | Cohesion Laboratories | 5005-B | |
| DQ-substrates (collagen I, IV) | Invitrogen | DQ-col I-D12060 DQ-colIVD12052 | |
| 22-mm plastic coverslips | Fisher Scientific | 12-547 | Cut in half, leave in 70% ethanol for 10 min and air-dry before use. |
| Cell culture medium | Lonza Inc. | MEBM-PRFCC-3153 MEGM CC-4136 | Phenol red-free |
| ibiTreat μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Volocity software | PerkinElmer, Inc. | Version 5.5 | Other brands of imaging software can be used to generate 3D reconstructions and movies. |
References
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