Summary
Biz onların mikroçevresindeki meme tümör hücreleri ve diğer hücreler arasındaki etkileşimleri gerçek zamanlı olarak canlı hücre görüntüleme için 3D kokültürü modeli geliştirdik bir invaziv fenotip darbe ilerlemesi. Bu modeller invaziv karıştığı parakrin kaynaklı proteolitik, kemokin / sitokin ve kinaz yolları hedefleyen ilaçlar için klinik öncesi ekranlar olarak hizmet verebilir.
Abstract
Hücre etkileşimleri: Biz vadeli MAME (m ammary bir rchitecture ve m icroenvironment e ngineering) ve hücre gerçek zamanlı olarak canlı hücre görüntüleme için onları kullandığı, 3D kokültürü modeli geliştirdik. Genel hedefimiz invaziv fenotip onların ilerlemesini incelemek için preinvaziv meme lezyonlarının mimarisi recapitulate modelleri geliştirmektir. Özellikle, invaziv duktal karsinom için preinvaziv meme epitel hücrelerinin gelişimini arttırmak veya azaltmak suçlanmıştır tümör mikroçevresinin pre-malign meme epitel hücre çeşitleri ve diğer hücre türleri arasındaki etkileşimleri analiz modelleri geliştirilmiştir. Diğer hücre tipleri tarihe okudu myoepitelyal hücreler, fibroblastlar, makrofajlar ve kan ve lenfatik mikrovasküler endotel hücreleri vardır. Boyunca meme içinde hücresel etkileşimler recapitulate üzere tasarlanmıştır MAME modelleri, ek olarakkanser gelişimi, biz prostat kanserlerinin ilerlemesini için karşılaştırılabilir modeli geliştirdik.
İşte biz, canlı hücre görüntüleme ve in situ meme duktal karsinom (DCIS) zamanla invaziv bir fenotipi hücreleri ve fibroblastların cocultures geçişini takip fonksiyonel bir proteolizin testinin kullanımı ile birlikte 3D cocultures kurma prosedürleri göstermek kültür yirmi üç gün boyunca bu durumda. MAME cocultures birden fazla katmandan oluşmaktadır. Fibroblastlar tip I kollajen alt katman gömülür. Bu on DCIS hücreleri tohumlanmış edildiği rekonstitüe bazal membran (RBM) bir tabaka yerleştirilir. % 2 RBM son bir üst tabakası dahil ve medya her değişikliği ile doldurulmaktadır. Invaziv bir fenotipi progresyonu ile ilişkili resmi proteoliz için, (DQ) boya-su verilmiş floresan matriks proteinleri (DQ-kollajen I rB orta tabaka ile karışık kollajen I ve DQ-kollajen IV tabakası ile karıştırılarak kullanılmasınıM) ve konfokal mikroskopi kullanılarak canlı kültürleri gözlemlemek. Optik bölümleri, yakalanan işlenmiş ve Volocity görselleştirme yazılımları ile 3D olarak yeniden inşa edilir. MAME cocultures 23 gün boyunca, DCIS hücreler çoğalır ve büyük istilacı yapıları birleşme. Fibroblastlar göç ve bu istilacı yapıları içine dahil olur. Kollajen of Fluorescent proteolitik fragmanları DCIS yapıların yüzeyi ile ilişki bulunur, intraselüler, ve aynı zamanda çevredeki matrisi içinde dağılmıştır. Hedef proteolitik, kemokin / sitokin ve kinaz yollar ya cocultures hücresel bileşiminde modifikasyonlar MAME modelleri yeni terapötik yaklaşımlar için klinik öncesi ekranlarını olarak kullanılabilir düşündüren, invaziv azaltabilir ilaçlar.
Protocol
1. DQ-yüzeyler hazırlayın
- Izin DQ-substratlar 4 ° C'de 50 ul hacimde ve deposuna, deiyonize su içinde DQ-substrat 1 mg / ml stok çözeltisi hazırlamak, açma şişeleri önce oda sıcaklığına kadar ısınması için bölünmeyi liyofilize
Bu, ~ 50-5 dakika ve ısı ° C dispersiyon kolaylaştırmak için bir ultrasonik su banyosunda DQ-substrat çalkalamak için gerekli olabilir.
- 4, bir gece boyunca buz üzerinde çözünme RBM ° C; RBM her zaman buz üzerinde ele alınması gerekir.
- 10X fosfat yapmak için tuzlu su (PBS), 80 g NaCl çözünmesi (1.37 M), 2 g KCl (0.027 M), 14,4 g 2 Na HPO 4 (1 M) ve 2.4 g KH 2 PO 4 (0.02 M) içerisinde tamponlu 800 ml saf su. 1.0 M HCl ile 7.4 PBS tampon çözeltinin pH ayarlayın. Hacmi 1 litre getir, filtrasyon ile sterilize edin.
- Soğutulmuş kollajen I soğutulmuş 10X PBS 1 parçasına 8 ölçü: buz üzerinde kollajen I çözeltisi hazırlayın. PH ayarlamaKarışımın steril 0.1 M NaOH kullanılarak 7,2-7,6 için. PH şeritler ile pH kontrol edilir ve steril su ile 10 parça son ses seviyesini ayarlayın.
- , Sırasıyla, 25 ug / ml, 2.4 mg / ml 'lik nihai bir konsantrasyon bir prechilled tüp içinde kollajen I çözelti içinde DQ-kollajen I seyreltilmesiyle kollajen I matris: DQ-kollajen I hazırlayın.
- , Sırasıyla, 25 ug / ml ve 12-15 mg / ml 'lik nihai bir konsantrasyon bir prechilled tüp içinde RBM in DQ-kollajen IV (Cultrex ya Matrigel) seyreltilmesi ile sulandırılmış bazal membran (RBM) matris: DQ-kollajen IV hazırlayın. Kabarcıkları oluşmayacak şekilde nazik pipetleme kullanarak buz üzerinde karıştırın.
2. MAME cocultures hazırlayın
Cocultures şematik bir diyagramını için Şekil 1 'e bakın.
- Yeri 35 mm çaplı kültür kaplarına veya bir IbiTreat μ-Bulaşık 35 mm kullanan iki dikdörtgen plastik lamelleri (10 dakika ve hava-kuru% 70 alkol sterilize). Burada Tarifleri biz öğrencileri için kullandığınız, lamelleri ve μ-Yemekleri hem içindirdik bir mikroskop ölür. Inverted mikroskobu çalışmaları için, biz sadece μ-Yemekleri kullanın.
- Kollajen I matris: DQ-kollajen I ile fibroblastların istenilen sayıda karıştırın. Kollajen I matris: Şekiller 2 ve 3 de gösterilen uzun süreli cocultures için, ortam 10 ul artı DQ-kollajen I, 60 ul içerisinde 500 fibroblastlar kullanabilir.
- Dikkatli bir pipet, bir 100-ul micropipettor kullanılarak ve fibroblast 70 ul yayılır: DQ-kollajen I: kollajen I matris her lameller tüm yüzeyi üzerine ve katılaşmaya 30 dk için CO 2 olmadan nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de bırakın.
- Transferi 35 mm denge sağlaması için 10 dakika süreyle% 5 CO 2 ile 37 ° C inkübatör için lamelleri içeren yemekler.
- Inkübatör İzleme ve oda sıcaklığına gelene kadar başlık altında 35 mm yemekleri bırakın.
- Katılaşmış DQ-kollajen I üstüne RBM matriks: gömülü fibroblastlar ile kollajen I matris DQ-kollajen IV 60 ul ekleyin. Pipet, caDQ-kollajen I: Ben kollajen matriks fibroblast tırmalama kaçınarak, eşit RBM matris: refully DQ-kollajen IV yayıldı.
- Transferi 35 mm katılaşmaya 10 dakika süreyle% 5 CO 2 ile 37 ° C inkübatör için lamelleri içeren yemekler. DQ-kollajen IV iken: RBM matris katılaşabilme olup, trypsinize ve epitel hücreleri saymak.
- RBM matris: lamelleri üzerine bir epitelyal / tümör hücre süspansiyonu Yeri 50 ul DQ-IV kollajen ile kaplı. 37 ° C inkübatör içine lamelleri içeren Yeri 35 mm yemekler. RBM matriks: hücreler için 40 ila 60 dakika DQ-kollajen IV eklemek için izin ver. Şekiller 2 ve 3 de gösterilen uzun süreli cocultures için, 2500 epitel ya da tümör hücreleri kullanılır.
- Her 35 mm çanak% 2 RBM içeren kültür ortamında 2 ml ekleyin. Herhangi bir ilaç tedavileri yaparak durumunda, ilaç bu zamanda ilave edilmelidir.
- Görüntüleme önce zaman istenilen süre kadar inkübe edin. Uzun vadeli kültürleri, ortam, her 3-4 günde değiştirilmesi gerekir. Hücreler korunabilirnormal kültür ortamında. Meme hücre hatları MAME cocultures için, MEGM SingleQuots ile desteklenmiş Epitelyal Bazal Orta (MEBM-PRF) kullanın.
3. Konfokal mikroskopla canlı MAME cocultures ile 4D (3D + zaman) görüntüleme gerçekleştirin
- Resimli kanıt-prensibi çalışmalar için, MAME cocultures bizim yayınlanan prosedürü 1 'e göre bir floresan hücre izleme boya ile işaretlendi. Görüntüleme önce,% 5 CO2 inkübatöründe ile 37 ° C PBS ile yıkama işleminden sonra, cocultures, bir 37 ° C inkübatöründe 45 dakika süreyle MEGM ortamı içinde 5 uM CellTracker Orange ile inkübe edildi PBS ile yıkanır ve 30 dakika süre ile inkübe önceden ısıtılmış MEGMmedium .
- Görüntü MAME cocultures Zeiss LSM-510 META konfokal mikroskop düşük bir büyütme (10X, su daldırma lens) canlı.
- Optik bölümlerde yapıların tüm derinliği boyunca aralıklarla yakalanır. Çalışmalarımız için, 10 optik kesitler yakalamakmikron aralıklarla.
- 3D görüntüleri yeniden oluşturmak için optik bölümleri kullanın. Biz 3 boyutlu rekonstrüksiyon oluşturmak için Volocity yazılımı kullanın.
- Hücre etkileşimleri ve çevresindeki matrisler ile etkileşimleri görüntülenebilmekte: yapılar, hücre böylece 3D rekonstrüksiyonlar filmleri olun. Biz QuikTime Player 7 ile film yaptı.
4. Temsilcisi Sonuçlar
Geliştirdiğimiz bu MAME cocultures bir meme tümörü ve mikro oluşturan çeşitli hücresel bileşenlerin arasındaki etkileşimleri gerçek zamanlı olarak canlı hücre görüntüleme için uysal deneysel bir model vardır. Burada hücre özetlemek için MAME modellerin özelliğini göstermelidir: meme kanseri ilerlemesi sırasında ve canlı hücre görüntüleme hücre etkileşimleri zamanla bu etkileşimlerin takip etmek. Biz üzerinde, bir preinvaziv MCF10.DCIS insan meme hücre dizisi ve bir insan meme kanseri ile ilişkili fibroblast hattı, WS-12Ti arasındaki görüntü etkileşimleri yeteneğini göstermekkültürü fazla üç haftalık bir süre. Cocultures 3, 16 ve 23 gün sonra görüntülenmiştir. Cocultures tüm hacminin aracılığıyla optik bölümleri Şekil 2 içinde üç timepoints her biri için gösterilmiştir 3D ve temsili örnekler içinde yeniden edildi. Şekil 2 içinde kırmızı bir floresans MCF10.DCIS ve WS 12Ti hücreleri temsil eder. İki hücre tipleri arasında ve uzun vadeli cocultures için ayrımcılık için, bir kültür oluşturulması öncesinde floresan proteinleri ile bireysel hücre tipleri transferinde veya transdüksiyonu yapabilirsiniz. Farklı şekilde tanımlanması için flüoresan proteinleri ile etiketlenir MCF10.DCIS ve WS 12Ti hücre MAME kokültürü Şekil 3 'de gösterilmiştir.
Birleşmeyle yüzeyler olarak, bu durumda DQ-kollajen içinde, MAME cocultures içine, biz bir invaziv fenotip geçiş ile ilişkili proteoliz zaman içinde değişiklikleri değerlendirmek ve ölçmek olabilir. Biz floresan parçalanma ürünleri ölçülmesi için yöntemlerin kurduk sonucuDQ-kolajen yıkımı 2,3 dan. Biz etiketleme ve hücre çekirdekleri sayarak başına hücre bazında MAME cocultures tüm 3D hacmi boyunca, yıkım ürünleri normalleştirmek. Ayrıca, hücre içi ve hücre bölmeleri bozulması lokalize ve daha önce 2 tarif ettiğim toplam, hücre içi ve hücre dışı yıkım ürünleri sayısal olarak. Şekiller 2 ve 3 in yeşil flüoresan iki DQ-kollajen yüzeyler arasında parçalanma ürünleri temsil eder. Bu zamanda, farklı şekilde-etiketli kollagenler bize tip I kollajen tip IV kollajen ve yıkımı bozulması ayırt olanak sağlayacak mevcut değildir.
MAME cocultures içinde etkileşimler dinamiktir ve zaman içinde değiştirebilirsiniz. Temporal ve dinamik bilgi elde etmek için, aynı görüş alanında, hafta dakika bir süre boyunca sürekli hacminin tüm numune üzerinden alınan görüntülü ve optik bölümler olabilirBöylece 4-D veri toplama. Şekil 2, biz 23 gün içinde meydana oldukça dramatik değişiklikler gösterir: hücre sayısı değişiklikleri, hücre göçü ve hücre etkileşimleri, yapı birimleri, yapı şekilleri, küresellik gelen yapıların sapmalar, invaziv çıkıntılar ve proteoliz. Ayrıca, biz de bağlı MAME cocultures hacim genel bir değişikliği göstermek aşağılayıcı onların bu dönem boyunca hücre dışı matriks çevreleyen. Şekil 2A gösterildiği gibi üç gün, hacmi 110,000 mikron 3'tür. Bunun aksine, 16 ve 23 gün sonra MAME cocultures hacmi olarak Şekil 2B ve C 'de gösterildiği sadece 46.250 um 3, olduğu
Şekil 1.. MAME cocultures. Şematik diyagramı Plastik coverslip DQ-I kollajen ve fibroblast (kırmızı) içeren, kollajen I ile kaplanmıştır. DQ-col içeren sulandırılmış bazal membran A 2. katman (RBM)lagen IV eklenir. Tümör hücreleri (kırmızı) üst kaplama ve kültür ortamına% 2 RBM overlaid (beyaz noktalar) medya her değişikliği ile olduğu edilir. Yeşil DQ-kollajen I ve IV floresan parçalanma ürünleri temsil eder.
Şekil 2. MCF10.DCIS insan meme hücreleri ve WS-12Ti insan meme fibroblastların MAME cocultures. Fibroblastlar kollajen DQ-IV kollajen içeren RBM I / DQ-kollajen I ve overlaid gömüldü. DCIS hücreler daha sonra% 2 RBM içeren medya ile RBM ve overlaid üzerine ekildi. Cocultures hacminin düşürülmesi ile gösterildiği gibi burada gösterildiği kokültürü içinde 23 gün boyunca, hücre proliferasyonu, DQ-kollajen IV ve I (yeşil) ve kollajen matrislerin degradasyon yoktu. Hücreler görüntüleme (kırmızı) önce in situ CellTracker Orange ile etiketleyerek lokalizeydi. Aynı canlı cocultures c tarafından çekilen görüntüleri ile 23 gün boyunca gözlendikokültürü 3, 16 ve 23 gün sonra onfocal mikroskopi. , Optik dilim Volocity yazılım ile 3D olarak yeniden inşa edildi. Büyütme, 10X.
Şekil 3. MAME 16 gün MCF10.DCIS insan meme hücreleri ve WS-12Ti insan meme fibroblastların cocultures olduğu sırasıyla ifade RFP (kırmızı) ve YFP (beyaz). Cocultures kurulmuş ve Şekil 2'deki gibi analiz edildi. Burada gösterilen iki hücre tipleri, bununla birlikte, farklı şekilde birbirlerine ayırt edilebilir, böylece etiketli edilmiştir. Bu şekilde daha yüksek büyütmede görüntüler, Şekil 2 ile karşılaştırılması, DCIS hücreleri ve fibroblastlar yakınındaki alanda DQ-kollajen I yaygın proteolizin yüzeyinde DQ-kollajen IV proteoliz göstermektedir. Büyütme, 20X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gösterildiği gibi, MAME cocultures bir göğüs tümörü ve mikro oluşturan çeşitli hücresel bileşenlerin arasındaki etkileşimlerin gerçek zamanlı canlı-hücre görüntüleme için kullanılabilir. Laboratuvarımızda devam eden çalışmalarda, biz proteolitik DCIS gelen invaziv duktal karsinom geçiş ile ilişkili yollar, yanı sıra kemokin / sitokin / büyüme faktörü yol olarak bu geçiş dahil proteolitik yolları ve diğer yollar arasındaki etkileşimleri belirlemek için MAME cocultures kullanmış . Biz daha MAME modelleri, küçük molekül inhibitörleri etkilerini eleme proteolitik / kemokin / sitokin / büyüme faktörü yollar 3-5 modüle antikorlar veya shRNAs engelleme için bir araç olarak kullanılabileceğini gösterdi. Burada Şekil 2 ve 3 'de gösterildiği gibi, daha önce haftaya kadar, 6,7 gösterildiği gibi MAME modelleri, dakikada saat arasında değişen kat fazla tümör büyümesi, invazyonu ve proteolizin canlı-hücre görüntüleme için kullanılabilir.gözlenen olan etkileşimi bir türden, intravital görüntüleme 8 olduğu gibi örneğin, insan tümör hücreleri ve tümör hücreleri ile ilişkili yerine insan tümör hücreleri ve fare stromal hücreleri arasında bir hücreleri arasında bulunmaktadır. MAME modelleri uysal sistemi vardır. Ilgi Moleküller DQ-kolajenlerin bozulmasına hücre tipi katkıları görüntülendi ve 3D 2 sayısal olarak böylece önceden coculturing bireysel hücre tiplerinde shRNAs ile downregüle olabilir. MAME modellerden Koşullu ortam elde edilen bilgiler vs, antikorlar engelleme, küçük molekül inhibitörleri etkilerini test etmek için deneysel bir temel sağlamaktadır proteaz salgısının değişiklikler, sitokinler vb ölçmek için tadılabilir
Bir tümör mikro (örneğin, myoepitelyal hücreler, monositler, kan endotel hücrelerinde bulunan diğer hücre türleri katkısını değerlendirmek için bunları kullanın böylece MAME cocultures hücresel yapısı kolayca manipüle edilebilirmalign ilerlemesi 6,7 ile damar ve lenfatik kökenli). Çeşitli hücre tipleri tohumlu, başka bir hücre tipinde oranı ve kültürde sürenin uzunluğunu sayısı, kullanılan özel hücre tipleri ile deneysel söz bağlı olacaktır. MAME modelleri de meme tümörü çevreleyen mikro değişiklikler, örneğin, pH, oksijen gerginlik etkilerini değerlendirmek üzere uzatılabilir. Örneğin, MAME kültürler biraz asidik pH, yani pH 6.8 muhafaza edildiğinde, proteoliz ve invaziv bir artış olduğunu göstermiştir. Ayrıca, biz de prostat kanseri gibi diğer kanser modellemek için benzer cocultures kullanabilirsiniz göstermiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Sağlık R01 CA131990 (BFS ve RRM) National Institutes tarafından kısmen desteklenmiştir. Canlı hücre görüntüleme Karmanos Kanser Enstitüsü, Wayne State Üniversitesi Çocuk Sağlığı ve Gelişimi Ulusal Enstitüsü Perinatoloji Araştırma Şubesi tarafından NIH Merkezi hibe P30 CA22453 tarafından kısmen desteklenen Mikroskopi, Görüntüleme ve Sitometri Kaynakları Çekirdek yapıldı Wayne State Üniversitesi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reconstituted basement membrane (Cultrex) | Trevigen Inc. | 3445-005-01 | Comparable to Matrigel (BD Biosciences) |
| Collagen I | Cohesion Laboratories | 5005-B | |
| DQ-substrates (collagen I, IV) | Invitrogen | DQ-col I-D12060 DQ-colIVD12052 | |
| 22-mm plastic coverslips | Fisher Scientific | 12-547 | Cut in half, leave in 70% ethanol for 10 min and air-dry before use. |
| Cell culture medium | Lonza Inc. | MEBM-PRFCC-3153 MEGM CC-4136 | Phenol red-free |
| ibiTreat μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Volocity software | PerkinElmer, Inc. | Version 5.5 | Other brands of imaging software can be used to generate 3D reconstructions and movies. |
References
- Sameni, M., Dosescu, J., Sloane, B. F. Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis. Mol. Imaging. 2, 159-175 (2003).
- Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions. Curr. Protoc. Cell Biol. 39, (2008).
- Jedeszko, C., Victor, B. C., Podgorski, I., Sloane, B. F. Fibroblast hepatocyte growth factor promotes invasion of human mammary ductal carcinoma in situ. Cancer Res. 69, 9148-9155 (2009).
- Sameni, M. Functional live-cell imaging demonstrates that beta1-integrin promotes type IV collagen degradation by breast and prostate cancer cells. Mol. Imaging. 7, 199-213 (2008).
- Li, Q. p21-activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer. Neoplasia. 10, 314-328 (2008).
- Sameni, M. Imaging and quantifying the dynamics of tumor associated proteolysis. Clin. Exp. Metastasis. 26, 299-309 (2009).
- Cavallo-Medved, D. Live-cell imaging demonstrates that proteases in caveolae of endothelial cells degrade extracellular matrix. Exp. Cell. Res. 315, 1234-1246 (2009).
- Fukumura, D. Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models. Microcirculation. 17, 206-225 (2010).
