Summary

تحضير العينة من<em> المتفطرة السلية</em> خلاصات لدراسات النووية المغناطيسي الرنين Metabolomic

Published: September 03, 2012
doi:

Summary

الملف الشخصى metabolomic من<em> المتفطرة السلية</em> يتم تحديد بعد النمو في الثقافات مرق. يمكن أن تختلف الشروط لاختبار تأثير من المكملات الغذائية، تأكسد، والأدوية المضادة للسل على الملف الشخصي لهذا التمثيل الغذائي الكائنات الحية الدقيقة. إجراءات إعداد مستخلص ينطبق على حد سواء 1D<sup> 1</sup> H و 2D<sup> 1</sup> H-<sup> 13</sup> C NMR التحليلات.

Abstract

المتفطرة السلية هو السبب الرئيسي للوفيات في البشر على نطاق عالمي. ظهور متعددة على حد سواء (MDR)، وعلى نطاق واسع-(XDR) سلالات مقاومة للعقاقير تهدد بعرقلة الجهود الحالية لمكافحة الأمراض. وبالتالي، هناك حاجة ملحة لتطوير أدوية واللقاحات التي هي أكثر فعالية من تلك المتاحة حاليا. جينوم M. وقد عرف السل لأكثر من 10 سنوات، ولكن هناك ثغرات هامة في معرفتنا وظيفة الجين والإستخدامات الأساسية. وقد استخدمت العديد من الدراسات منذ الجين التعبير التحليل على الصعيدين transcriptomic والبروتين لتحديد آثار المخدرات، تأكسد، وظروف النمو على الأنماط العالمية في التعبير الجيني. في نهاية المطاف، ينعكس الرد النهائي من هذه التغييرات في تكوين التمثيل الغذائي للبكتيريا بما في ذلك المواد الكيميائية ألف قليل الوزن الجزيئي. مقارنة ملامح التمثيل الغذائي من النوع البري وسلالات متحولة، إما غير المعالجة أو آرeated مع دواء معين، يمكن أن تسمح تحديد الهدف بشكل فعال وربما يؤدي إلى تطوير مثبطات الرواية المضادة للنشاط السل. وبالمثل، يمكن أيضا آثار اثنين أو أكثر من الظروف على أن metabolome المقررة. الرنين النووي المغناطيسي (NMR) هي تقنية قوية التي يتم استخدامها لتحديد وقياس وسيطة الأيض. في هذا البروتوكول والإجراءات لإعداد M. ويرد وصف مقتطفات خلية للتحليل السل metabolomic NMR. تزرع مزارع الخلايا تحت الظروف المناسبة والمطلوبة للسلامة الأحيائية مستوى الاحتواء 3، 1 المقطوع، وتعرض للتحلل الميكانيكية مع الحفاظ على درجات الحرارة الباردة لتحقيق أقصى قدر من الحفاظ الأيضات. يتم استرداد لست] الخلية، التي تمت تصفيتها تعقيمها، وتخزينها في درجات حرارة منخفضة للغاية. ومطلي مأخوذة من هذه المقتطفات الخلية على أجار Middlebrook 7H9 لتشكيل مستعمرة وحدة للتحقق من عدم وجود خلايا قابلة للحياة. على شهرين من الحضانة عند 37 درجة مئوية، إذا لم السادسويلاحظ المستعمرات قادرة، تتم إزالة عينات من منشأة الاحتواء للالتجهيز النهائي. ومجفف بالتجميد مقتطفات، معلق في المخزن المؤقت بالديوتيريوم وحقن في الصك NMR، التقاط البيانات الطيفية التي يتعرض بعد ذلك إلى التحليل الإحصائي. ويمكن تطبيق الإجراءات الموضحة لكلا أحادية البعد (1D) NMR H 1 وثنائية الأبعاد (2D) 1 H-13 C NMR التحليلات. هذه المنهجية توفر أكثر موثوقية الصغيرة تحديد الوزن الجزيئي المستقلب والتحليلات الكمية وأكثر موثوقية من التراكيب الحساسة استخراج الخلايا من الطرق الأيضية الكروماتوغرافي. ويمكن أيضا أشكال مختلفة من الإجراءات الموصوفة في أعقاب خطوة تحلل الخلية تكييفها لتحليل البروتين موازية.

Protocol

1. بروتوكول النص هذا البروتوكول يسلط الضوء على التكيف منهجية NMR لM. السل (الدرجة الثالثة الوكيل). ولذلك، السلامة الأحيائية المستوى 3 (BSL3) الممارسات ينبغي اتباعها عند إجراء M. بحوث السل في مختبر معتمد سنويا. التعرض للمختب…

Discussion

وقد حلل عدد كبير من الدراسات لمحات من البروتين وtranscriptomic M. السل في إطار مجموعة من في المختبر والمجراة في ظروف. 11-16 في نهاية المطاف، والتغيرات في التعبير الجيني ونشاط انزيم يؤدي إلى تغيرات في تركيزات الجزيئات الصغيرة الوزن الجزيئي. وصف كامل لهذه المركبا…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

فإن الكتاب أود أن أشكر جميع أعضاء مختبرات بارليتا الدكتور والدكتور القوى للتعليقات مفيدة عند وضع البروتوكول. نشكر ويندي لإجراء مناقشات مفيدة أوستن وتصحيح التجارب المطبعية للمخطوطة. وقد تم تمويل هذا العمل المبين في هذا المخطوط من المنح الرائدة البذور لكل محقق المذكورة أعلاه من جامعة نبراسكا لنكولن مركز علم الأحياء الأكسدة (الأم منحة # 017675 NCRR 2P20RR، D. بيكر، PI). وبالإضافة إلى ذلك، نشكر الدكتور أوفيليا شاكون لتوفير الأموال من منحة R21 لها (1R21AI087561-01A1) لوازم البحوث ودعم السيد Halouska في جزء من رواتب توحيد تقنيات NMR المدرجة في هذه النشرة.

Materials

Name of the Reagent/Equipment Company Catalogue Number Comments
ADC Enrichment BD BBL Middlebrook 212352  
BACS-120 Sample Changer Bruker    
Bruker Avance NMR Bruker   500 MHz
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100 Fraction V
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-15R Benchtop
Centrifuge Tubes Corning 430291 50 ml sterile polypropylene
Cryogenic Vials Corning 430488 2.0 ml sterile polypropylene
Cycloheximide A.G. Scientific C-1189 Toxic
D(+) – Glucose ACROS 41095-0010  
Deuterium Oxide Sigma Aldrich 617385  
Erlenmeyer Flask VWR 89095-266 Sterile, flat base, polycarbonate, 0.22 μm PTFE membrane vented cap
Flash Freeze Flask VWR 82018-226 750 ml
Freeze Dryer VWR 82019-038 4.5 L Benchtop
Glycerol GibcoBRL 15514-029  
Incubator New Brunswick Innova 40 Benchtop shaker
Lysing Matrix B MP Biomedicals 6911-100  
Lysis Machine MP Biomedicals FastPrep-24  
Microcentrifuge Eppendorf 5415D Benchtop
Microcentrifuge Beckman Coulter Microfuge 22R Benchtop
Middlebrook 7H9 Broth Difco 271310  
NMR tubes Norell ST500-7 5mM
OADC Enrichment BD BBL Middlebrook 212351  
Oleic Acid Sigma O1008  
Potassium Phosphate Dibasic VWR BDH0266  
Potassium Phosphate Monobasic VWR BDH0268  
Rotor – Microfuge 22R Beckman Coulter F241.5P Sealed and polypropylene
Rotor – Allegra X-15R Beckman Coulter SX4750 With bio-certified covers
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3  
Sodium-3-trimethylsilylpropionate-2,2,3,3-D4 Cambridge Isotope DLM-48  
Spectrophotometer Beckman Coulter DU-530  
Spectrophotometer Cuvettes LifeLINE LS-2410 1.5 ml polystyrene, 2 clear sides
Syringe Becton Dickinson 309585 Sterile, 3 ml Luer-Lok
Syringe Filter Nalgene 190-2520 0.2 μm sterile cellulose acetate
Tween 80 Fisher Scientific BP338-500  

References

  1. Larsen, M. H., Biermann, K., Tandberg, S., Hsu, T., Jacobs, W. R. Genetic Manipulation of Mycobacterium tuberculosis. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 2 (2007).
  2. Larsen, M. H., Biermann, K., Jacobs, W. R. Laboratory Maintenance of Mycobacterium tuberculosis. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 1 (2007).
  3. Clarridge, J. E., Shawar, R. M., Shinnick, T. M., Plikaytis, B. B. Large-scale use of polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in a routine mycobacteriology laboratory. J. Clin. Microbiol. 31, 2049-2056 (1993).
  4. Nguyen, B. D., Meng, X., Donovan, K. J., Shaka, A. J. SOGGY: solvent-optimized double gradient spectroscopy for water suppression. A comparison with some existing techniques. J. Magn. Reson. 184, 263-274 (2007).
  5. Cui, Q. Metabolite identification via the Madison Metabolomics Consortium Database. Nat. Biotechnol. 26, 162-164 (2008).
  6. Ulrich, E. L. BioMagResBank. Nucleic Acids Res. 36, 402-408 (2008).
  7. Wishart, D. S. HMDB: the Human Metabolome Database. Nucleic Acids Res. 35, 521-526 (2007).
  8. Kanehisa, M. KEGG for linking genomes to life and the environment. Nucleic Acids Res. 36, 480-484 (2008).
  9. Karp, P. D. Expansion of the BioCyc collection of pathway/genome databases to 160 genomes. Nucleic Acids Res. 33, 6083-6089 (2005).
  10. Halouska, S. Use of NMR metabolomics to analyze the targets of D-cycloserine in mycobacteria: role of D-alanine racemase. J. Proteome. Res. 6, 4608-4614 (2007).
  11. Boshoff, H. I. The transcriptional responses of Mycobacterium tuberculosis to inhibitors of metabolism: novel insights into drug mechanisms of action. J. Biol. Chem. 279, 40174-40184 (2004).
  12. Mehaffy, C. Descriptive proteomic analysis shows protein variability between closely related clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 10, 1966-1984 (2010).
  13. Schnappinger, D. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment. J. Exp. Med. 198, 693-704 (2003).
  14. Schnappinger, D., Schoolnik, G. K., Ehrt, S. Expression profiling of host pathogen interactions: how Mycobacterium tuberculosis and the macrophage adapt to one another. Microbes. Infect. 8, 1132-1140 (2006).
  15. Shui, W. Quantitative proteomic profiling of host-pathogen interactions: the macrophage response to Mycobacterium tuberculosis lipids. J. Proteome. Res. 8, 282-289 (2009).
  16. Talaat, A. M., Lyons, R., Howard, S. T., Johnston, S. A. The temporal expression profile of Mycobacterium tuberculosis infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4602-4607 (2004).
  17. Forgue, P. NMR metabolic profiling of Aspergillus nidulans to monitor drug and protein activity. J. Proteome Res. 5, 1916-1923 (2006).
  18. Goodacre, R., Vaidyanathan, S., Dunn, W. B., Harrigan, G. G., Kell, D. B. Metabolomics by numbers: acquiring and understanding global metabolite data. Trends Biotechnol. 22, 245-252 (2004).
  19. Shin, J. H. NMR-based Metabolomic Profiling in Mice Infected with Mycobacterium tuberculosis. J. Proteome Res. 10, 2238-2247 (2011).
  20. Jaki, B. U., Franzblau, S. G., Cho, S. H., Pauli, G. F. Development of an extraction method for mycobacterial metabolome analysis. J. Pharm. Biomed. Anal. 41, 196-200 (2006).
  21. de Carvalho, L. P. Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates. Chem. Biol. 17, 1122-1131 (2010).
  22. de Carvalho, L. P. Activity-based metabolomic profiling of enzymatic function: identification of Rv1248c as a mycobacterial 2-hydroxy-3-oxoadipate synthase. Chem. Biol. 17, 323-332 (2010).
  23. Marrero, J., Rhee, K. Y., Schnappinger, D., Pethe, K., Ehrt, S. Gluconeogenic carbon flow of tricarboxylic acid cycle intermediates is critical for Mycobacterium tuberculosis to establish and maintain infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9819-9824 (2010).
  24. Tang, Y. J. Central metabolism in Mycobacterium smegmatis during the transition from O2-rich to O2-poor conditions as studied by isotopomer-assisted metabolite analysis. Biotechnol. Lett. 31, 1233-1240 (2009).
  25. Kweon, O. A polyomic approach to elucidate the fluoranthene-degradative pathway in Mycobacterium vanbaalenii PYR-1. J. Bacteriol. 189, 4635-4647 (2007).
  26. Hasan, M. R., Rahman, M., Jaques, S., Purwantini, E., Daniels, L. Glucose 6-phosphate accumulation in mycobacteria: implications for a novel F420-dependent anti-oxidant defense system. J. Biol. Chem. 285, 19135-19144 (2010).
  27. Soga, T. Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry. J. Proteome Res. 2, 488-494 (2003).
  28. Metz, T. O. The future of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) in metabolic profiling and metabolomic studies for biomarker discovery. Biomark Med. 1, 159-185 (2007).
  29. Ludwig, C., Viant, M. R. Two-dimensional J-resolved NMR spectroscopy: review of a key methodology in the metabolomics toolbox. Phytochem. Anal. 21, 22-32 (2010).
  30. Simpson, R. J., Inglis, J. . Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual. , 425-595 (2003).
  31. Beste, D. J., McFadden, J. System-level strategies for studying the metabolism of Mycobacterium tuberculosis. Mol. Biosyst. 6, 2363-2372 (2010).
  32. Rhee, K. Y. Central carbon metabolism in Mycobacterium tuberculosis: an unexpected frontier. Trends Microbiol. , (2011).
  33. Who. Health Organization. Anti-tuberculosis Drug Resistance in the World: Report No. 4. , (2008).
  34. Jassal, M., Bishai, W. R. Extensively drug-resistant tuberculosis. Lancet Infect Dis. 9, 19-30 (2009).

Play Video

Cite This Article
Zinniel, D. K., Fenton, R. J., Halouska, S., Powers, R., Barletta, R. G. Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies. J. Vis. Exp. (67), e3673, doi:10.3791/3673 (2012).

View Video