Summary

Preparação de amostras de<em> Mycobacterium tuberculosis</em> Extractos para Estudos Nucleares metabolômica Ressonância Magnética

Published: September 03, 2012
doi:

Summary

O perfil de metabolômica<em> Mycobacterium tuberculosis</em> É determinada após crescimento em culturas em caldo. As condições podem ser variadas para testar os efeitos de suplementos nutricionais, oxidantes e agentes anti-tuberculose no perfil metabólico deste microrganismo. Procedimento para a preparação de extracto é aplicável tanto para 1D<sup> 1</sup> H e 2D<sup> 1</sup> H-<sup> 13</sup> Análises de C NMR.

Abstract

Mycobacterium tuberculosis é uma das principais causas de mortalidade em seres humanos em escala global. O surgimento de ambos multi-(MDR) e-(XDR) resistentes à drogas-cepas ameaça descarrilar os esforços atuais de controle da doença. Assim, há uma necessidade urgente de desenvolver drogas e vacinas que são mais eficazes do que aqueles atualmente disponíveis. O genoma de M. tuberculose tem sido conhecida há mais de 10 anos, ainda existem lacunas importantes no conhecimento da função dos genes e essencialidade. Muitos estudos têm utilizado uma vez que a análise da expressão do gene, tanto a nível transcriptomic e proteômica para determinar os efeitos das drogas, oxidantes, e condições de crescimento sobre os padrões globais de expressão do gene. Em última análise, a resposta final destas alterações é reflectido na composição metabólica da bactéria incluindo alguns milhares de pequenos produtos químicos de peso molecular. Comparando os perfis metabólicos de tipo selvagem e estirpes mutantes, quer não tratadas ou treated com um fármaco particular, podem efectivamente permitir a identificação do alvo e pode levar ao desenvolvimento de novos inibidores com actividade anti-tuberculoso. Da mesma forma, os efeitos de duas ou mais condições do metaboloma pode também ser avaliada. Ressonância magnética nuclear (RMN) é uma tecnologia poderosa, que é utilizado para identificar e quantificar os intermediários metabólicos. Neste protocolo, os processos para a preparação de M. extractos de células de tuberculose para análise de RMN são descritos metabolômica. As culturas de células são cultivadas em condições adequadas e exigidas Biossegurança Nível 3 de confinamento, uma colhidas e submetidas a lise mecânica, mantendo a temperaturas frias para maximizar a preservação de metabolitos. Os lisados ​​de células são recuperadas, filtrado esterilizado e armazenado a temperaturas ultra-baixas. Alíquotas destas extractos celulares foram semeadas em agar Middlebrook 7H9 para unidades formadoras de colónias para verificar a ausência de células viáveis. Após dois meses de incubação a 37 ° C, na ausência de vicolónias capazes são observadas, as amostras são removidas da unidade de contenção para o processamento a jusante. Os extratos são liofilizadas, ressuspensas em tampão de deuterado e injectada no instrumento de RMN, a captura de dados espectroscópicos que é então submetida a análise estatística. Os procedimentos descritos podem ser aplicados tanto para unidimensional (1D) 1 H NMR e de duas dimensões (2D) 1 H-13 C análises de RMN. Esta metodologia proporciona mais fiável de identificação de baixo peso molecular e do metabolito mais fiáveis ​​e sensíveis análises quantitativas de composições de extracto de células metabólicas de métodos cromatográficos. Variações do processo descrito a seguir ao passo de lise de células pode também ser adaptado para análise proteômica paralelo.

Protocol

1. Texto protocolo Este protocolo destaca a adaptação da metodologia de RMN de M. tuberculose (Classe agente III). Portanto, as práticas do Nível de Biossegurança 3 (BSL3) precisam ser seguidas na condução M. pesquisa da tuberculose em um laboratório certificado anualmente. A exposição a aerossóis gerados laboratório é o risco mais importante encontrado por pessoas que trabalham com esses microrganismos. Os seguintes procedimentos são realizados na inst…

Discussion

Um número significativo de estudos analisaram os perfis transcriptomic e proteômica de M. tuberculosis, sob uma variedade de ensaios in vitro e in vivo. 11-16 Em última análise, as alterações na expressão de genes e a actividade da enzima levar a variações nas concentrações de pequenas moléculas de peso molecular. A descrição completa destes compostos constitui o metaboloma. Assim, os efeitos da droga e as condições de crescimento diferentes sobre as vias me…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer a todos os membros dos laboratórios do Dr. Barletta e Poderes Dr. pelos comentários úteis durante o desenvolvimento do protocolo. Agradecemos Wendy Austin para discussões úteis e revisão do manuscrito. O trabalho descrito neste manuscrito foi financiado por doações piloto de sementes para cada investigador listados acima, da Universidade de Nebraska-Lincoln Center Biologia Redox (pai concessão # NCRR 2P20RR 017675, D. Becker, PI). Além disso, podemos agradecer ao Dr. Ofelia Chacon do fornecimento de fundos a partir de sua concessão R21 (1R21AI087561-01A1) para fontes de pesquisa e de apoio Sr. Halouska do salário parcial de padronizar as técnicas de RMN incluídos nesta publicação.

Materials

Name of the Reagent/Equipment Company Catalogue Number Comments
ADC Enrichment BD BBL Middlebrook 212352  
BACS-120 Sample Changer Bruker    
Bruker Avance NMR Bruker   500 MHz
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100 Fraction V
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-15R Benchtop
Centrifuge Tubes Corning 430291 50 ml sterile polypropylene
Cryogenic Vials Corning 430488 2.0 ml sterile polypropylene
Cycloheximide A.G. Scientific C-1189 Toxic
D(+) – Glucose ACROS 41095-0010  
Deuterium Oxide Sigma Aldrich 617385  
Erlenmeyer Flask VWR 89095-266 Sterile, flat base, polycarbonate, 0.22 μm PTFE membrane vented cap
Flash Freeze Flask VWR 82018-226 750 ml
Freeze Dryer VWR 82019-038 4.5 L Benchtop
Glycerol GibcoBRL 15514-029  
Incubator New Brunswick Innova 40 Benchtop shaker
Lysing Matrix B MP Biomedicals 6911-100  
Lysis Machine MP Biomedicals FastPrep-24  
Microcentrifuge Eppendorf 5415D Benchtop
Microcentrifuge Beckman Coulter Microfuge 22R Benchtop
Middlebrook 7H9 Broth Difco 271310  
NMR tubes Norell ST500-7 5mM
OADC Enrichment BD BBL Middlebrook 212351  
Oleic Acid Sigma O1008  
Potassium Phosphate Dibasic VWR BDH0266  
Potassium Phosphate Monobasic VWR BDH0268  
Rotor – Microfuge 22R Beckman Coulter F241.5P Sealed and polypropylene
Rotor – Allegra X-15R Beckman Coulter SX4750 With bio-certified covers
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3  
Sodium-3-trimethylsilylpropionate-2,2,3,3-D4 Cambridge Isotope DLM-48  
Spectrophotometer Beckman Coulter DU-530  
Spectrophotometer Cuvettes LifeLINE LS-2410 1.5 ml polystyrene, 2 clear sides
Syringe Becton Dickinson 309585 Sterile, 3 ml Luer-Lok
Syringe Filter Nalgene 190-2520 0.2 μm sterile cellulose acetate
Tween 80 Fisher Scientific BP338-500  

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Cite This Article
Zinniel, D. K., Fenton, R. J., Halouska, S., Powers, R., Barletta, R. G. Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies. J. Vis. Exp. (67), e3673, doi:10.3791/3673 (2012).

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