Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Undersöka tarminflammation i DSS-inducerad modell av IBD

Published: February 1, 2012 doi: 10.3791/3678
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Farncombe Family Digestive Health Research Institute, Department of Pathology and Molecular Medicine, McMaster University

Summary

Experimentella modeller för inflammatoriska tarmsjukdomar har tillåtit oss att undersöka de komplexa medfödda och adaptiva immunsvaret i samband med patogenes. Använda histologisk scoring, kvantifiering av proinflammatoriska cytokiner och myeloperoxidas aktivitet, kan man börja utvärdera dessa svar ses vid inflammatorisk tarmsjukdom.

Abstract

Inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) omfattar en rad tarm sjukdomar, den vanligaste av dessa är ulcerös kolit (UC) och Crohns sjukdom (CD). Både UC och CD, när de förekommer i tjocktarmen, generera en liknande symptom profil som kan innefatta diarré, rektal blödning, buksmärtor och viktnedgång. 1 Även om patogenesen för IBD är okänd, är det beskrivs som en multifaktoriell sjukdom som innebär både genetiska och miljömässiga komponenter. 2

Det finns många och varierande djurmodeller av kolon inflammation som liknar flera funktioner i IBD. Djurmodeller av kolit varierar från dem som uppstår spontant hos känsliga stammar av vissa arter som kräver tillförsel av vissa koncentrationer av kolit-inducerande ämnen, som t.ex. dextransulfat natrium (DSS). Kemisk-inducerad modeller av tarmen inflammation är de vanligaste och bäst beskrivna modeller av IBD. Administrastration av DSS i dricksvatten med akut eller kronisk kolit, beroende på förvaltningen protokollet. 3 djur som fått DSS uppvisar viktnedgång och tecken på lös avföring eller diarré, ibland med tecken på blödning. 4,5 Här beskriver vi de metoder som kolit utveckling och den resulterande inflammatorisk reaktion kan karakteriseras efter administrering av DSS. Dessa metoder omfattar histologiska analysen av hematoxylin / eosin färgade kolon delar, mätning av proinflammatoriska cytokiner och bestämning av myeloperoxidas (MPO) aktivitet, som kan användas som ett surrogat markör för inflammation. 6

Omfattningen av det inflammatoriska svaret i sjukdomstillstånd kan bedömas genom förekomsten av kliniska symtom eller genom förändring i histologi i slemhinne. Kolon histologiska skador bedöms med hjälp av ett poängsystem som anser förlusten av kryptan arkitektur, inflammatorisk cell infiltration, muskel thickening, bägare cellbristen och krypta abscess. 7 Kvantitativt sett kan nivåerna av proinflammatoriska cytokiner med akuta inflammatoriska egenskaper, såsom interleukin (IL)-1β, IL-6 och tumor necrosis factor (TNF)-α, bestämmas med hjälp konventionell ELISA-metoder. Dessutom kan MPO aktivitet mätas med hjälp av en kolorimetrisk analys och användas som ett index på inflammation. 8

I experimentella kolit är sjukdomens svårighetsgrad ofta korrelerade med en ökning av MPO-aktivitet och högre nivåer av proinflammatoriska cytokiner. Kolit svårighetsgrad och inflammation-associerade skador kan bedömas genom att undersöka avföringen konsistens och blödning, förutom att bedöma histopatologiska tillståndet i tarmen med hjälp av hematoxylin / eosin färgade kolon vävnadssnitt. Kolon vävnad fragment kan användas för att bestämma MPO aktivitet och cytokin produktion. Sammantaget kan dessa åtgärder användas för att utvärdera den intestinala inflammatorisk reaktion idjurmodeller av experimentell kolit.

Protocol

1. Murina modell av DSS-inducerad akut kolit

  1. Lägg dextransulfat natrium (DSS) för att autoklaveras dricksvatten till önskad slutliga koncentrationen (1-5%) (vikt / vol) (dvs att göra en 5% DSS lösning tillsätts 25 mg DSS pulver till 500 ml autoklaveras vatten) . Stamlösning kan lämnas i rumstemperatur i upp till en vecka eller vid 4 ° C fram till användning.
  2. I en biosäkerhet huva, häll lösningen lager DSS i 50 ml Falcon rör (ett behov per bur). Håll stamlösning för att fylla rören när det behövs.
  3. Byt ut dricksvatten i varje mus bur med DSS-lösning (i 50 ml Falcon rör) (Tiden beror på DSS regim som används. Till exempel med hjälp av 6-8 veckor gammal hane C57BL / 6 möss, vi förvaltar en 5% DSS lösning för totalt fem dagar). Möss ska inte ha tillgång till någon annan vattenkälla. Kontroll möss ges autoklaveras dricksvatten utan DSS.
  4. Väg möss dagligen och redovisa det belopp DSS konsumeras per dag. Top varjeflaskan till 50 ml efter inspelningen DSS nivåer. Detta för att mäta den ungefärliga volymen av DSS förbrukas per bur per mus under hela experimentet. I våra studier använder vi en 5% DSS-lösning i 5 dagar med manliga C57BL / 6 möss. Betydande viktnedgång, förändrad avföring konsekvens och tecken på fekal blod ses så tidigt som dag 3 med detta DSS regim. Under DSS administrationen, möss uppvisar uttalad viktminskning (cirka 5-10% av sin ursprungliga vikt på dag 5) med viktminskning större än 20% av de ursprungliga vikt med uttorkning och diarré vara betydelsefulla fysiologiska indikator som ett djur är lika med eller nära endpoint. Om djuret får tillgång till normal vatten efter 5 dagar på 5% DSS, kommer det att återhämta sig inom 7 dagar. Alla experiment bör godkännas av institutionens djuretik kommittén och i enlighet med den godkända djur Utnyttjande Protocol (AUP).
  5. Under den tid av experimentet, en sjukdom Aktivitetsindex (DAI)poäng kan bedömas att utvärdera den kliniska utvecklingen av kolit. DAI är det kombinerade resultatet av viktminskning jämfört med de ursprungliga vikt, avföring konsekvens och blödning. Poäng definieras enligt följande: viktminskning: 0 (ingen förlust), 1 (1-5%), 2 (50-10%), 3 (10-20%) och 4 (> 20%), avföring konsekvens: 0 (normal), 2 (lös avföring) och 4 (diarré), och blödning: 0 (inget blod), 1 (Hemoccult positiv), 2 (Hemoccult positiva och visuell pellets blödning) och 4 (brutto blödning, blod runt anus). DAI kan görs dagligen under den tid som DSS behandling.
  6. Vid den tidpunkt val, väga och offra möss. Möss kan avlivas genom halsdislokation efter inhalation av isofluran eller av en annan metod som godkänts av institutionens djur-anläggning.

2. Samla kolon vävnadsprover

  1. Exponera ventrala sidan av djuret och våta buken området med en 70% etanol. Vid denna punkt, se tabell 1 och noterar enNY tecken på blödning (blod närvarande vid anal öppning) eller ändtarmsframfall i varje djur.
  2. Använd standard dissekera sax för att incisionsfilm buken genom att göra en ventrala mittlinjen snitt.
  3. Leta reda på tjocktarmen och transekt tjocktarmen så nära kolorektal marginal som möjligt för att frigöra den distala kolon.
  4. Försiktigt och långsamt dra ut hela tjocktarmen, lossa den från omgivande tarmkäx.
  5. Transekt tjocktarmen vid colonocecal marginalen till fri den proximala änden av tjocktarmen. Avföring kan tas bort genom att skölja tjocktarmen med steril PBS med hjälp av en sondmatning nål fäst vid en 3 eller 5 ml spruta eller genom att försiktigt klämma ut det med hjälp av ett par böjd pincett / tång. Med hjälp av hela tjocktarmen, bedöma för skada (se avsnitt 3.1)
  6. Mjukpapper provtagning för histologisk analys och andra analyser kan göras genom att skära 0,5 cm till 1,0 cm lång kolon fragment gör notera vilket område som provet är från (dvs proximal, mitten eller distala).
  7. Vävnadsproversom ska användas för analyser kan individuellt placeras i 1,5 ml Eppendorf-rör och fryses i flytande kväve och förvaras tills den ska användas vid -70 ° C.

3. Bedömning av kolit svårighetsgrad

  1. Makroskopiska eller sjukdom svårighetsgrad bedöms obotligt av en opartisk observatör som använder en tidigare publicerad poängsystem (tabell 1). 9 Pall konsistens kan bedömas med hjälp av en pincett och trycka ner på avföring att bestämma konsistens. För att avgöra en poäng för blod i avföringen, notera färgen på avföringen (dvs svart avföring kontra ljusbrun avföring) och ytterligare validera med hjälp av en Hemoccult test. Med hjälp av poängsystem, fastställa en poäng för varje villkor. Den slutliga makroskopiska poäng för varje djur är summan av varje enskild poäng.
  2. För att utvärdera histologiska skador av kolit svårighetsgrad, skära ett litet fragment (0,5 cm) i tjocktarmen, placera i en vävnad kassett och dränka i buffrad 10% formalin lösning. Förbered 5ìm paraffininbäddad tvärsnitt och fläcken sektioner med hematoxylin / eoxin (H & E) med hjälp av lämpliga förfaranden. Colon fragment kan tas från den proximala, i mitten av kolon eller distala delen av tjocktarmen.
  3. H & E färgade kolon vävnadssnitt poängsätts av en blindad observatör som använder en tidigare publicerad för följande åtgärder: crypt arkitektur (normal, 0 - svår crypt distorsion med förlust av hela kryptor, 3), graden av inflammatorisk cell infiltration (normal, 0 - tät inflammatoriska infiltrera, 3), muskel förtjockning (bas av krypta sitter på muscularis slemhinnor, 0 - märkt muskel förtjockning närvarande, 3), bägare cellbristen (frånvarande, 0 - närvarande, 1) och crypt abscess (frånvarande, 0 - nuvarande , 1). 7 Den histologiska skador poäng är summan av varje enskild poäng. Det bör noteras att till skillnad från mänskliga UC, krypta abscesser är inte kännetecknande för denna modell och är sällan sett, mikroskopiska sår är också sällsynta. Om flera kolon avsnitt varfärgade, histologiska poäng mellan likartade sektioner bör användas för att fastställa slutresultatet för varje område (dvs. histologiska poäng i proximala kolon jämfört med histologiska poäng i distala kolon).

4. Bered stamlösningar av reagenser för analyser

  1. Förbered en 50 mm Lösning av kaliumhydroxid Fosfatbuffert genom att lägga till lösning B (K 2 HPO 4, 8,7 g dibasiskt kaliumfosfat i 1 l dH 2 O) till lösning A (KH 2 PO 4, 6,8 g monobasiskt kaliumfosfat i 1L av dH 2 O) tills pH på 6,0 uppnås. Resterande lösningar kan förvaras i kylskåp (2-8 ° C) tills framtida användning.
  2. Förbered hexadecyltrimethylammonium bromid (HTAB) buffert genom att lägga till 5 g HTAB till 1 L av Potassium fosfatbuffert (50 mM, pH = 6,0). Värm försiktigt för att lösa upp och förvara vid 2-8 ° C fram till användning. När det behövs, värme att åter upplösas.
  3. Förbered lyseringsbuffert för mjukpapper homogenisering för protein analys med10 ml 1M tris-saltsyra (pH = 8,0), 6 ml 5M natriumklorid och 2 ml Triton X-100 till 182 ml steriliserat vatten. Triton X-100 är mycket trögflytande vid rumstemperatur och därför bör försiktigt värmas före användning. Den beredda lyseringsbuffert kan förvaras vid -20 ° C fram till användning.

5. Provberedning för analyser

  1. Provberedning för MPO analys.
    1. Ta prov från -70 ° C och lägg på is. Notera vikten av varje prov efter att ha tagit någon synlig avföring eller fett med hjälp av en böjd forcep / pincett och placera i en 2 ml Eppendorf Safe-Lock mikrocentrifugrör (eller någon slang som kan användas med en homogeniseringsblandare). Proverna ska förvaras på is hela tiden. Det är viktigt att notera att liknande kolon fragment ska användas från varje biologisk replikera (dvs distala delar enda eller proximala avsnitt bara).
    2. Lägg homogeniseringsblandare pärla till varje provrör.
    3. Tillsätt lämplig mängd HTAB BUFFer enligt vävnad vikt. Om vävnaden väger mindre än 25 mg, tillsätt buffert i förhållandet 12.5mg/mL, om vävnaden vikt är mellan 25-50, lägga till ett förhållande på 25mg/mL. Om vävnaden väger mer än 50, lägg buffert med förhållandet 50mg/mL.
    4. Homogenisera med en vävnad homogenisator under 4 min vid 30 Hz. Upprepa om vävnaden inte är väl sammanhållen.
    5. Ta bort homogeniseringsblandare pärla och centrifugera lösningen för 6 min (13.400 xg, 4 ° C).
    6. Samla supernatanten och kassera den resulterande pelleten. Supernatent kan förvaras vid -70 ° C fram till användning.
  2. Provberedning för cytokin analys.
    1. Upprepa steg 5.1.1. till 5.1.2.
    2. Tillsätt 50 ìl av proteashämmare cocktail (PIC) till 10 ml av beredd lyseringsbuffert.
    3. Tillsätt 1 mL av PIC och lyseringsbuffert lösning till varje prov oavsett vikt.
    4. Homogenisera under 5 min vid 30 Hz. Upprepa om vävnaden inte är väl sammanhållen.
    5. Ta bort homogeniseringsblandare pärla och centrifugera solutii 5 min vid 3300 x g.
    6. Samla supernatanten och kassera den resulterande pelleten. Supernatanten kan förvaras vid -70 ° C fram till användning.

6. Kvantifiering av inflammatoriska markörer

  1. MPO aktivitet assay
    1. Förbered o-dianisidine dihydroklorid (o-dianisidine) lösning genom att kombinera 16,7 mg av o-dianisidine dihydroklorid, 90 ml dH 2 O, och 10 ml av kalium fosfatbuffert. Denna lösning bör beredas på nytt för varje analys.
    2. Tillsätt 7 mikroliter av vävnad homogenatet (utarbetad i avsnitt 5.1) i tre exemplar till en 96-brunnar.
    3. Tillsätt 50 mikroliter av utspädd H 2 O 2 (4 mikroliter 30% H 2 O 2 utspädd i 96 mikroliter av dH 2 O) till O-dianisidine blandning.
    4. Använd en flerkanals pipett för att lägga till 200 mikroliter av o-dianisidine blandning innehållande H 2 O 2 till var och en av brunnarna.
    5. Mät absorbansen vid 450 nm med en spectrophotometer. Ta tre avläsningar med 30 sekunders intervall.
    6. Beräkna MPO aktivitet. MPO aktivitet mäts i enheter (E) av MPO / mg vävnad, där en enhet av MPO definieras som den mängd som behövs för att förnedra en mikromol av H 2 O 2 per minut vid rumstemperatur. Med tanke på att en enhet (E) av MPO = 1 mikromol av H 2 O 2 split och att 1 mikromol av H 2 O 2 ger en förändring i absorbans 1,13 x 10 -2 nm / min, är enheter av MPO i varje prov bestäms som förändring i absorbans [DA (t 2-T 1)] / Δmin x (1,13 x 10 -2). För att få enheter per mg vävnad, använder vävnad: buffert förhållande. Till exempel, om en vävnad: var buffert förhållandet 50 mg / ml användas i 7 mikroliter av homogenatet finns 0,35 mg vävnad. Därför, för att få enheter per mg vävnad, dela enheter MPO med 0,35. Ett exempel på beräkning med absorbansvärden (nm) är inkluderat nedan (förutsatt att provet har lagts till i tre exemplar):
Exempel på Tid 0 sek Tid 30 sek Tid 60 sek
En 1 2 3 1 " 2 " 3 " 1 " 2'' 3 "
0,048 0,048 0,051 0,061 0,061 0,065 0,074 0,073 0,078
  1. Genomsnittlig vid tiden 0 sek = (0,048 + 0,048 + 0,051) / 3 = 0,049 nm
  2. Genomsnittlig på Time 30 sek = 0,0623 nm
  3. Genomsnittlig på Time 60 sek = 0,075 nm
  4. Förändringen i absorbans (DA) från 0 till 30 sek / mg vävnad (förutsatt att 50 mg / ml vävnad: buffert ratio) = [(0,0623 till 0,049) / (1,13 x 10 -2]) / 0,35 = 3,363
  5. Förändring i absorberarning (DA) från 30 till 60 sek / mg vävnad = 3,211
  6. * MPO aktivitet (U / mg vävnad) = genomsnitt DA (0-30) och DA (30-60) = 3,287
  1. Kvantifiering av proinflammatoriska cytokiner med ELISA
    1. Cytokin (IL-1β, IL-6 och TNF-α) nivåer bestäms med kommersiellt tillgängliga enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Kit (Quantikine Murine, FoU-system).
    2. Absorbansvärden från varje ELISA normaliseras med hjälp av en Bradford protein analys respektive till varje prov och är uttryckt i pg / mg protein.

7. Representativa resultat

Administration av lämpliga DSS regimen kommer att framkalla akut kolit hos möss. Under den tid DSS behandling kan DAI användas för att bedöma och utvärdera klinisk progression av sjukdomen. Djur som behandlats med DSS kommer att visa betydande viktminskning jämfört med sin ursprungliga vikter, lös avföring och avföringblödning (figur 1). Efter att offret och undersökning av tjocktarmen, är graden av kolit makroskopiskt poäng baserad på förkortning av tjocktarmen längd, kolon blödning, fekal blödning, uppluckring av avföring konsekvens, och tecken på blödning jämfört med kontroller som behandlats med enbart vatten (figur 2 & tabell 1). Tvärsnitt av kolon vävnadsprover som färgats med H & E har högre histologiska poäng för DSS-behandlade kolon jämfört med vatten som behandlats med kontroller (Figur 3). För att ytterligare karakterisera graden av inflammation i DSS-behandlade möss, kan MPO verksamheten bedömas ur homogeniseras kolon vävnadsprover. DSS-behandlade kolon har högre MPO aktivitet jämfört med kontroller (Figur 4). Dessutom är detta associeras med ökade nivåer av proinflammatoriska cytokiner (IL-1β, IL-6, TNF-α) (Figur 5).

Figur 1.
Figur 1. Man, var C57BL / 6 möss som fick 5% DSS i dricksvatten under 5 dagar. DAI poäng bedömdes dagligen för varje djur och var i genomsnitt per dag för varje grupp (medelvärde ± SEM, n = 4 möss / grupp).

Figur 2.
Figur 2. C57BL / 6 möss fick 5% DSS i dricksvatten under 5 dagar. Kontroll möss fick vatten utan DSS. Makroskopisk skador mål / sjukdomens svårighetsgrad poäng var blint bedömas på dag 5 efter DSS-inducerad kolit. Kolon isolerade från möss som fått DSS har högre makroskopiska skador poäng (rektal blödning, ändtarmsframfall, diarré, kolon blödning) indikerar större sjukdomens svårighetsgrad (medelvärde ± SEM, n = 4 möss / grupp).

Figur 3
Figur 3. C57BL / 6 möss fick 5% DSS lösning i dricksvattnet för att få kolit. Kontroll möss fick vatten utan DSS. (A) Histologisk poäng var blint värderade med hjälp av H & E färgade kolon vävnadssnitt samlas på dag 5 efter DSS administration. (B) DSS-behandlade prover visar mer histologiska skador (fler cellulär infiltration, mer bägare cellbristen, större snedvridning / skada crypt arkitektur) jämfört med (c) kontroller (medelvärde ± SEM, n = 4 möss / grupp). I (B) och (C), indikerar asterisk (*) område bägare cellbristen och snedvridning av crypt arkitektur, antal tecken (#) indikerar cellulär infiltration.

Figur 4.
Figur 4. Alla möss offrades på dag 5 efter administrering av DSS och kolon vävnadsprov togs för att bedöma MPO aktivitet. Allvarlighetsgrad DSS inducerad kolit är förknippad med högre nivåer av MPO aktivitet jämfört med kontroller (medelvärde ± SEM, n = 4 möss / grupp).

_upload/3678/3678fig5.jpg "/>
Figur 5. Utöver högre MPO nivåer, svårighetsgraden av DSS-inducerad kolit är också associerat med en ökad grad av pro-inflammation cytokiner såsom IL-1β, IL-6, TNF-α (medelvärde ± SEM, n = 4 möss / grupp).

Tabell 1. Makroskopisk / sjukdomens svårighetsgrad Betyg

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

DSS kolit är en allmänt använd kemiskt inducerad modell av tarminflammation. I denna modell är möss som fick dricksvatten kompletteras med DSS, som tros vara giftiga för tarmen epitelceller och störa integritet slemhinnor barriären. 10 Administrering av DSS framkallar en akut kolit som kännetecknas av lös avföring, avföring blödning, och infiltration med granulocyter. 10 Under DSS administrering kolit vanligtvis förknippas med betydande viktminskning och förekomst av blod i avföringen, vilket kan bedömas av en fekal ockult blodtest. 5.10,11 Efter att samla kolon vävnadsprover kan kolit svårighetsgrad vara kännetecknas av makroskopiska undersökning av tjocktarmen och histologiska analysen av H & E färgade kolon tvärsnitt med hjälp av tidigare fastställda poängsystem. 9

Vid tillämpningen av detta protokoll är det viktigt att notera att graden av kolit inducerad avDSS är art och stam specifika. 12 Dessutom kan skillnader i tarmfloran mellan olika djur och rum bostäder förändrar resultatet av DSS förvaltningen. 13,14 Således kan initiala studier med DSS krävs för att optimera dosering och DSS behandling. Underlåtenhet att optimera dessa variabler kan leda till en hög förekomst av död eller liten eller ingen kolit. När optimerad kan denna modell användas som en mycket reproducerbar modell av kolit med en låg dödlighet. Dessutom är det viktigt att använda DSS av den angivna molekylvikt (se tabell över reagenser). Andra former av DSS salt reagens får inte producera kolit eller kan leda till hög förekomst av död.

Induktion av kolit använda denna modell i svår makroskopiska och histologiska skador som är associerad med ökad MPO verksamhet samt högre nivåer av proinflammatoriska cytokin produktion. Agranulocytes, såsom lymfocyter end monocyter, är viktiga källor för pro-inflammatoriska cytokiner, medan MPO är ett enzym som finns i granulocyter, såsom neutrofiler (och i mindre utsträckning monocyter och makrofager). Detta protokoll kan också användas för att mäta MPO aktivitet i kolon vävnadsprover som behandlats med dinitrobensen sulfonsyra (DNBS) -. Inducerad kolit 15 DNBS-inducerad kolit är en väl beskriven T-cells medierade transmural inflammation i tjocktarmen som förvaltas av intrarectal instillation av DNBS ämnet i etanol. 16 Etanol används för att bryta ner slemhinnor barriär, gör det möjligt att DNBS att haptenize för autolog eller mikroorganismer proteiner stimulerar en mängd immunsvar på hapten-modifierade själv-antigen. 16 En fördel med denna modell över DSS-induced modell är att den utlösande agenten är känd. Den mekanism genom vilken DSS initierar kolit, dock återstår att fastställa. Intressant, har studier visat att DSS administration orsakar colitis i naturliga killer cell-brist, och T-och B-celler brist möss, vilket tyder på att dessa celler (i samband med det adaptiva immunsystemet) inte kan vara avgörande i induktion av kolit och därigenom kan denna modell vara lämplig för att studera roll det medfödda immunförsvaret i uppkomsten av kolit. 4,17

För den mest exakta måttet på MPO aktivitet, har vi funnit att oavsett vilken kolit modell som används, bör MPO nivåer bestämmas inom den första veckan av vävnad samling som MPO aktivitet tenderar att minska över tid. MPO aktivitet kan användas som ett surrogat markör för inflammation. Men kvantifiering av vävnad cytokiner och histologisk scoring är integrerade för att underlätta fullständig bedömning av det inflammatoriska svaret vid kolit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av bidrag från kanadensiska Institutes of Health Research (CIHR) och Crohns och Colitis Foundation of Canada (CCFC).

Materials

Betyg Rektal blödning Ändtarmsframfall Pall Konsekvens Blod
0 Ingen Ingen Normal Normal
1 Red Tecken på framfall Mjuk Red
2 Mörkröd Klart framfall Mycket mjukt Mörkröd
3 Gross Blödning Omfattande framfall Diarré Svart
Name Company Catalog Number Comments
Eppendorf Safe-Lock Microcentrifuge Tube (2mL) Eppendorf 0030 120.094
Biotek EL808 Absorbance plate reader BioTek EL808
Dextran sulphate sodium salt reagent grade (molecular weight 36,000-50,000 Da) MP Biomedicals 160110
Gen5 (software) BioTek Version 1.10.8
Hexadecyltrimethylammonium bromide (HTAB) Sigma-Aldrich H5882-100G
Hydrogen peroxide, 30 wt.% solution in water Sigma-Aldrich 216763 Store at 2-8°C
Microtest plate 96-well flat bottom Sarstedt Ltd 82.1581 For single use only
o-Dianisidine Sigma-Aldrich D-3252 Light sensitive. Store at 2-8°C
Potassium phosphate, dibasic Caledon 6620-1
Potassium phosphate, monobasic EMD Millipore PX1565-1
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340 Store at -20°C
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tungsten Carbide beads for Tissue Lyser II Qiagen 69997

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sands, B. E. From symptom to diagnosis: clinical distinctions among various forms of intestinal inflammation. Gastroenterology. 126, 1518-1532 (2004).
  2. Danese, S., Fiocchi, C. Etiopathogenesis of inflammatory bowel diseases. World J. Gastroenterol. 12, 4807-4812 (2006).
  3. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat. Protoc. 2, 541-546 (2007).
  4. Axelsson, L. G., Landstrom, E., Goldschmidt, T. J., Gronberg, A., Bylund-Fellenius, A. C. Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: effects in CD4(+)-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice. Inflamm. Res. 45, 181-191 (1996).
  5. Egger, B., Bajaj-Elliott, M., MacDonald, T. T., Inglin, R., Eysselein, V. E., Büchler, M. W. Characterisation of acute murine dextran sodium sulphate colitis: cytokine profile and dose dependency. Digestion. 62, 240-248 (2000).
  6. Krawisz, J. E., Sharon, P., Stenson, W. F. Quantitative assay for acute intestinal inflammation based on myeloperoxidase activity. Assessment of inflammation in rat and hamster models. Gastroenterology. 87, 1344-1350 (1984).
  7. Cooper, H. S., Murthy, S. N., Shah, R. S., Sedergran, D. J. Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis. Lab. Invest. 69, 238-249 (1993).
  8. Smith, J. W., Castro, G. A. Relation of peroxidase activity in gut mucosa to inflammation. Am. J. Physiol. 234, R72-R79 (1978).
  9. Ghia, J. E., Blennerhassett, P., Kumar-Ondiveeran, H., Verdu, E. F., Collins, S. M. The vagus nerve: a tonic inhibitory influence associated with inflammatory bowel disease in a murine model. Gastroenterology. 131, 1122-1130 (2006).
  10. Okayasu, I., Hatakeyama, S., Yamada, M., Ohkusa, T., Inagaki, Y., Nakaya, R. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98, 694-702 (1990).
  11. Solomon, L., Mansor, S., Mallon, P., Donnelly, E., Hoper, M., Loughrey, M., Kirk, S., Gardiner, K. The dextran sulphate sodium (DSS) model of colitis: an overview. Comparative Clinical Pathology. 19, 235-239 (2010).
  12. Mähler, M., Bristol, I. J., Leiter, E. H., Workman, A. E., Birkenmeier, E. H., Elson, C. O., Sundberg, J. P. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am. J. Physiol. 274, G544-G551 (1998).
  13. Hans, W., Scholmerich, J., Gross, V., Falk, W. The role of the resident intestinal flora in acute and chronic dextran sulfate sodium-induced colitis in mice. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 12, 267-273 (2000).
  14. Rath, H. C., Schultz, M., Freitag, R., Dieleman, L. A., Li, F., Linde, H., Schölmerich, J., Sartor, R. B. Different subsets of enteric bacteria induce and perpetuate experimental colitis in rats and mice. Infect. Immun. 69, 2277-2285 (2001).
  15. Ghia, J. E., Li, N., Wang, H., Collins, M., Deng, Y., El-Sharkawy, R. T., Côté, F., Mallet, J., Khan, W. I. Serotonin has a key role in pathogenesis of experimental colitis. Gastroenterology. 137, 1649-1660 (2009).
  16. Elson, C. O., Beagley, K. W., Sharmanov, A. T., Fujihashi, K., Kiyono, H., Tennyson, G. S., Cong, Y., Black, C. A., Ridwan, B. W., McGhee, J. R. Hapten-induced model of murine inflammatory bowel disease: mucosa immune responses and protection by tolerance. J. Immunol. 157, 2174-2185 (1996).
  17. Dieleman, L. A., Ridwan, B. U., Tennyson, G. S., Beagley, K. W., Bucy, R. P., Elson, C. O. Dextran sulfate sodium-induced colitis occurs in severe combined immunodeficient mice. Gastroenterology. 107, 1643-1652 (1994).

Tags

Medicin 60 inflammation myeloperoxidas (MPO) akut kolon skada granulocyter kolon dextransulfat natrium (DSS) neutrofila
Undersöka tarminflammation i DSS-inducerad modell av IBD
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha,… More

Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. J. Vis. Exp. (60), e3678, doi:10.3791/3678 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter