Summary
Жир контент-анализ регулярно проводится в исследованиях с использованием мышиной модели ожирения. Новые методы в маленькое животное КТ и анализ обеспечения продольной подробно богатых жиром контент-анализ. Здесь мы подробно шаг за шагом процедуры для выполнения мелких животных КТ, анализа и визуализации.
Abstract
Ожирение связано с повышением заболеваемости и смертности, а также снижение метрики качества жизни 1. Как экологические и генетические факторы, связанные с ожирением, хотя точный основные механизмы, которые способствуют заболевания в настоящее время определены. 2,3 Несколько небольших животных Модели ожирения были разработаны и используются в различных исследованиях. 4 важнейших компонентов этих экспериментов включает в себя сбор региональных и / или общий животного жира содержание данных в различных условиях.
Традиционные экспериментальные методы, доступные для измерения содержания жира в небольших моделях животных с ожирением включает инвазивные (например, бывший естественных измерения жировых отложений) и неинвазивным (например, двойной энергии рентгеновского абсорбциометрия (DEXA) или магнитный резонанс (МР)) протоколы каждый из которых представляет относительный компромисс. Текущий инвазивные методы измерения содержания жира может предоставить подробностидля органа и специфики регионов распределение жира, но жертвуя субъектов исключает продольное оценок. С другой стороны, текущие неинвазивные стратегии обеспечивают ограниченные детали для органа и специфики регионов распределение жира, но и позволяют ценных продольной оценки. С появлением выделенных мелких животных рентгеновской компьютерной томографии (КТ) системы и специальные аналитические процедуры, как орган и области конкретного анализа распределения жировой ткани и продольных профилей может оказаться невозможным. Недавние сообщения проверку использования КТ в естественных продольных изображений ожирения в живых мышей. 5,6 Здесь мы предлагаем модифицированный метод, который позволяет для жирной / общий объем измерения, анализа и визуализации использования Carestream молекулярной визуализации Albira КТ системы в сочетании с пакетами PMOD и Volview программного обеспечения.
Protocol
1. Животные
- Для результатов, представленных ниже, три C57BL/6J мышей и четыре B6.V-Лепа об / J мышей были получены из лаборатории Джексона (Бар-Харбор, главную, США). B6.V-Лепа об / J мышей представляют собой один из самых ранних моделей ожирения и продолжать активно исследуются. B6.V-Лепа об / J мышей проявляют фенотип характеризуется повышенной адипоцитов размер и количество, и может весить в три раза больше, чем у мышей дикого типа. 7,8 Здесь B6.V-Лепа об / J мышей были использованы в качестве позитивного контроль за ожирение фенотип, чтобы показать возможности системы Albira КТ КТ на основе измерения содержания жира.
- Изображений была выполнена, когда животные достигли примерно 12 недель. (Ожирение в B6.V-Лепа об / J мышей проявляется после 4-недельного возраста).
- Мыши были под наркозом на Isofluorane (2,5% расхода) и находиться под 2,5% через носовой конус установки для работы с изображениями.imals склонны были расположены в стандартной кровати крысы (M2M изображений Инк Кливленд, Огайо) в поставляемый со станцией изображение Albira. Конечности были расположены боковые от туловища при равномерном приобретение КТ.
- После получения изображения была завершена, мышей были удалены из носовой конус и вернулся к восстановлению клетки до амбулаторно.
2. Приобретение изображения и реконструкция
- Изображение приобретения осуществляются с помощью КТ Albira системы (Carestream молекулярной визуализации, Вудбридж, штат Коннектикут). Мыши были под наркозом на Isofluorane (2,5% расхода) и находиться под 2,5% через носовой конус установки для работы с изображениями. Поглощения проводили сканирование слоем 115 мм длиной, с использованием 600 прогнозов. Источник рентгеновского излучения был установлен на ток 200 мкА и напряжением 45 кВп и используется 0,5 мм Al фильтр, чтобы укрепить балки.
- Приблизительная излучение глубоко эквивалентной дозы для настройки CT составляла 220 мЗв, и мелкий эквивалентная доза была 357,4 мЗв. Этидозы более 20 раз ниже, чем сообщалось ЛД50 9.
- Изображения восстановлена с использованием FBP (фильтр Проекционные) алгоритм по Albira Suite 5.0 Reconstructor использованием "стандартных" параметров. В совокупности эти приобретения и реконструкции настройки получения окончательного изображения с 125 мкм изотропной вокселей, считается достаточной для анализа целого животного. Для получения подробной регионе конкретный анализ, реконструкция с 35 мкм изотропной вокселей может быть выбран для окончательного решения до 90 мкм.
3. Image Analysis
Анализ изображения производится с помощью PMOD (PMOD Technologies LTD, Цюрих, Швейцария), программное обеспечение для анализа. Изображения сегментированы в PMOD по плотности тканей для первого общего объема, а затем для жирной объеме.
3,1 изображения может быть уменьшен на анализ, чтобы минимизировать вычислительные мощности.
- Чтобы уменьшить перейдите к основной вкладке View. Выберите Сервис> Уменьшить.
- Выберите X 2, Y 2, и Z 2.
- Проверьте, замените.
- Выберите Выполнить.
Сообщение: «Ограничительная рамка будет меняться" дисплеями раз снижение является полным.
3,2 изображения могут быть скрыты для устранения постели и носа конус элементов для последующего объем интересов, (ВОИ) анализа.
- Для маскировки, перейдите на самолеты, макеты, повороты, зеркало, 3D-маркеры> Самолеты и макеты.
- Выберите Показать плоскости Z.
- Выделите носового конуса в плоскости Z.
- Выберите основной вкладке VOI> Нарисуйте вершин.
- Нарисуйте области интереса (ROI) вокруг носа животного исключением кровати и носовой обтекатель.
- ВыбиратьСкопируйте Фактическая рентабельность.
- Переход к следующему кусок и вставить из буфера ROI через соответствующие плоскости носа.
- Использование редактирования группы вершин регулировать трансформирования по мере необходимости.
- Выберите Удалить ROI на первых самолетов за нос конусов.
- Создание нового VOI, чтобы охватить животное обхват (за исключением животных кровать) на первом самолеты за нос конусов.
- Перейдите к VOI Инструменты> Маскировка и алгебры.
- Введите -1000 в диалоге поле.
- Выберите маску вокселей за выбранную кнопку VOIs.
Сообщение: ". Необратимой операции данные Вы хотите продолжить?" дисплеев.
- Выберите Да.
- Перейдите на самолеты, макеты, повороты, зеркало, 3D-маркеры> Самолеты и Положитеаутов.
- Выберите Показать все самолеты.
- Изучить VOI на целостность.
- Выберите Сохранить.
- Сохранить как анализ.
- Изменение префикса имени файла.
3.3 Первый, часть изображения для общего объема животных:
- Выберите Сервис> Внешний.
- Установите флажок Сегментация проверки.
- Введите диапазон -300 до +3500 (диапазон плотности ссылки, полученные от брюшного жира регионе диапазон плотности).
- Выберите Run сегментации.
- Проверьте целостность сегментации.
- Нажмите OK.
- Выберите Удалить ROI.
- Выберите VOI статистики.
Отчет представляет статистику общего объема.
- Запишите сообщил объеме.
3,4 Далее, сегмент изображение для жира объем:
- Вернуться на несегментированная масках на изображение для жира объема рынка.
- Для загрузки сохраненного маске файла данных, проверьте Анализ окно в окно загрузки).
- Выберите Сервис> Внешний.
- Установите флажок Сегментация проверки.
- Введите диапазон от -200 до -50.
- Выберите Run сегментации.
- Проверьте целостность сегментации.
- Нажмите OK.
- Выберите VOI статистики.
Сообщил статистические данные отражают объем жира.
- Запишите сообщил объеме.
- Выберите Сохранить.
- Сохранить как анализ.
- Изменение префикса имени файла.
- Выберите Сервис> Внешний.
- Выберите Морфологические флажок. Морфологические дисплеев зрения.
- Выберите эрозии.
- Нажмите OK.
- Выберите Сервис> Внешний.
- Выберите Морфологические флажок. Морфологические дисплеев зрения.
- Выберите расширение.
- Нажмите OK.
4. Визуализация изображений CT
4,1 VolView v3.2 (Kitware, Клифтон Парк, штат Нью-Йорк, США) была использована для создания 3D оказанные визуального отображения сегментированных изображений.
- Используйте настройки по умолчанию в всплывающем окне.
- Откройте плагинов меню.
- В утилиту, выберите Объединить томов.
- Снимите Rescale компонентов.
- Нажмите кнопку Присвоить второй вход.
- Выберите сегментированных жира данные на второй вход.
- Используйте настройки по умолчанию в всплывающем окне.
- Нажмите кнопку Применить плагин.
- Дважды щелкните на том окне просмотра, чтобы увеличить его субъекта мыши.
4,2 Вернуться на цвет / прозрачность вкладки. Компонент выпадающего списка относится к которым набор данных в настоящее время редактируется. Два ползунка расположены в нижней части вкладки и определить относительную яркость каждого компонента набора данных в наложение, используя значения от 0 до 1. Для компонента 1-йэлектронной КТ, мы предпочитаем использовать оттенки серого цветов. Чтобы изменить цвет:
- В разделе Сопоставление цветов Скалярные, дважды щелкните на одну из цветовых ползунков.
- Чтобы снять слайдер, перетащите его из коробки.
- Чтобы добавить новый слайдер, щелкните в любом месте в пределах слайдер области.
- Удаление одного из ползунков.
- Сделайте левой цвет черный слайдер (скалярное значение (S) = -19 000).
- Сделать правильный цвет белый слайдер ((S) = 15000).
- С отображением окна прозрачности Скалярные, создание новой точки, нажав в окне. Это даст в общей сложности три очка в окно.
- Для средней точки, изменить (S) до ~ -3000, а непрозрачность (O) значение 0.
- Выберите третью точку в правой части окна.
- Изменение (S) до 32000, и
- Первая точка может быть где угодно на левом, так долго, как непрозрачность имеет значение 0.
- Изменения в компоненте два, которая должна изменить внешний вид жира.
- Изменение каждого из цветовых ползунков на красный двойным щелчком мыши и двигая Hue (H) ползунок влево, чтобы в искусственных цветах карта жира на красный. Очень мало еще должны быть необходимы для настройки внешнего вида жира.
4.3 создать три панели вращения фильм отображения КТ, жиров и наложения:
- Нажмите и перетащите мышью предмет в вертикальном положении со спиной к себе.
- В компоненте Массы, установите значение Компонент двух до 0 отображаются только КТ.
- Нажмите кнопку Обзор> Камера.
- Выберите количество кадров лг вращение ролика (для данного случая, мы выбрали "36").
- Измените значение X вращение на 360 градусов.
- Выберите Создать.
- В появившемся диалоговом окне создайте новую папку с именем КТ, и сохраните файл в формате TIFF, который выведет серию вращение изображений.
- Повторите этот шаг для жира изображения, а также накладной жир / КТ изображения, сохраняя их в отдельные папки каждый раз.
4,4 г ImageJ 1.43u был использован для создания файла фильма с помощью вращения изображения VolView выход.
- В ImageJ, выберите File> Import> Image Sequence.
- Выберите первое изображение в папке КТ. Программное обеспечение автоматически обнаруживает другие файлы и открывать их в виде стека.
- Повторите, чтобы открыть жира и наложения последовательности.
- Откройте менеджер по ROI анализ> Инструменты> ROIManager.
- Нарисуйте ROI вокруг объекта мышь, исключая ненужные пиксели фона.
- В диспетчере ROI, нажмите кнопку Добавить, чтобы добавить ROI.
- Выберите другой последовательности изображений.
- В диспетчере ROI, нажмите на ROI, чтобы применить его к картине. В этом моде, каждый из обрезанной стеки будут совпадать идеально.
- При рентабельности на все стеки, щелкните правой кнопкой мыши в пределах рентабельности.
- Выберите дубликат.
- Выберите Проверить дубликат Box стека отделить ROI от остального изображения.
- Закройте большие стеки изображения.
- Повторите эту процедуру для всех трех последовательностей изображений.
- К Image> Стеки> Инструменты> Комбинат объединить стек вместе.
- Выберите CT для стека 1.
- Выберите Жира для стека 2.
- Существует в настоящее время три панели, изображение вращения стека, которые могут быть просмотрены, выбрав Play в левом нижнем углу окна изображения.
- Чтобы спасти фильм, как AVI, выберите Файл> Сохранить как ...> AVI ...
- Нажмите кнопку Сохранить.
5. Представитель Результаты
Результаты для трех WT (C57BL/6J) мышей и четыре ожирением (B6.V-Лепа об / J) мышей сообщил здесь представитель пример жира / общий объем соотношение измерения использования системы Albira КТ. На рисунке 1 приведена представитель дисплей создан с VolView v3.2 для сегментации (т.е. общий объем жира и объем), страдающих ожирением мышей КТ.
0/3680fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Представитель КТ сегментирован для жира. (А), ожирением мыши (B6.V-Лепа об / J) CT общего объема в оттенках серого (B) объем жира в красном, и (C) слияние изображений. (D) WT мыши (C57BL/6J) CT общего объема в оттенках серого (E) объем жира в красном, и (F) слияние изображений.
Общий объем, жир объемы и рассчитывается жиров / общее соотношение объема приведены ниже в таблице 1 для каждого WT мыши и каждый ожирением мыши. Усредненный жира / общий объем соотношение WT группы и ожирением группа была 0,09 и 0,42 соответственно (рис. 2). Жиров / общий объем коэффициенты WT мышей по сравнению с ожирением мышей было обнаружено значительно отличаются (р = 0,001).
| WT (C57BL/6J) | Всего (см 3) | Жир (см 3) | Жир / Общее соотношение | Ожирение (B6.V-Лепа полу | Всего (см 3) | Жир (см 3) | Жир / Общее соотношение |
| Животное 1 | 28,79 | 3,00 | 0,10 | Животное 1 | 66,25 | 26,75 | 0,40 |
| Животное 2 | 33,25 | 3,05 | 0,09 | Животное 2 | 61,15 | 26,31 | 0,43 |
| Животное 3 | 30,30 | 2,63 | 0,09 | Животное 3 | 64,19 | 25,7 | 0,40 |
| Животное 4 | 54,25 | 23,78 | 0,44 |
Таблица 1. Общий объем, объем жира,и жиров / общий объем коэффициенты WT и ожирение у мышей. Всего жиров и объемы были получены из сегментированного изображения, используя PMOD VOI анализа.
Рисунок 2. Усредненные жира / общий объем коэффициенты WT мышей по сравнению с ожирением мышей. Усредненные жира / общий объем коэффициенты WT (C57BL/6J) и ожирением (B6.V-Лепа об / J) оказался 0,09 и 0,42 соответственно отображаются. (Ошибка = баров одного стандартного отклонения). WT против ожирения жир / общее соотношение объемов оказались значительно отличаются (р = 0,001).
Discussion
Здесь, используя B6.V-Лепа об / J мышей мы продемонстрировали возможность выполнения измерений содержания жира в небольшой модели на животных с использованием системы Albira КТ. Эти измерения в соответствии с ожиданиями для сравнения внутри групп и между группами измерений. Во-первых, представитель результаты, полученные здесь выделить ограниченное внутри группы изменчивость измерения жира / общий объем отношений в обоих WT и тучных мышей группы, используя эти процедуры. Во-вторых, жир / общий объем коэффициенты WT против ожирения мышей существенно различаются. Наконец, на основе сравнения (не показано) с предыдущего значения сообщили относительной общей жировой массы и жира тела процентов по сравнению с WT-B6.V Лепа об / J мышей, наши измерения для жирной / общий объем коэффициенты по сравнению с WT-B6.V Лепа об / J мышей подпадают под ожидаемый диапазон, 7, 8.
Методы, описанные здесь могут быть применены или адаптированы к другим мodels и / или целей исследования. Изменения в реконструкции параметры могут быть необходимы для достижения конкретных целей. Например, Judex соавт. (2010) сообщили, что 50 мкм разрешение изображения были необходимы для некоторой области специального анализа. Один см изотропной объемы изображение может быть выбран в течение 35 мкм реконструкции в Albira 5,0 люкс Reconstructor использовании "HR" реконструкция вариант. После того как система Albira КТ была использована для региона и органов конкретные измерения содержания жира все преимущества (например, одновременное региона и конкретного органа жира измерения объема и продольных измерений) КТ на основе анализа содержания жира может быть реализован для системы Albira КТ.
Выводы:
Здесь мы предлагаем подробно, шаг за шагом метод измерения содержания жира в живых мышей с помощью рентгеновской компьютерной томографии. Мы приобрели наш КТ наборы данных, использование станции Albira изображения, и выполняется последующая сегментация и анализис использованием PMOD набор программного обеспечения. Наконец, мы предоставляем инструкции, позволяющие легкий рендеринга и визуализации распределения жировой ткани в течение всего животного.
Disclosures
Тодд А. Sasser, Shengting Ли, Шон С. Ортон, и Сет Т. Gammon являются сотрудниками Carestream молекулярной визуализации. Карлос Correcher является сотрудником Oncovision, Gem-Imaging ПАВ Мэтью Leevy является консультантом Carestream молекулярной визуализации.
Acknowledgments
Мы искренне благодарим Нотр-Дам Комплексная изображений фонда (NDIIF) и Carestream здравоохранения за финансовую поддержку этого проекта.
References
- Clarke, P. J., O'Malley, P. M., Schulenberg, J. E., Johnston, L. D. Midlife and Socioeconomic Consequences of Persistent Overweight Across Early Adulthood: Findings From a National Survey of American Adults (1986-2008). Am. J. Epidemiol. , (2008).
- Brockman, G., Bevova, M. Using Mouse Models to Dissect the Genetic of Obesity. TRENDS in Genetics. 18, 367-376 (2002).
- Bray, G. A. Progress in Understanding the Genetics of Obesity. Journal of Nutrition. 127, Suppl 5. 940S-942S (1997).
- Carroll, L. Mouse Models of Obesity. Clinics in Dermatology. 22, 345-349 (2004).
- Judex, S., Luu, Y. K., Ozcivici, E., Adler, B., Lublinsky, S., Rubin, C. T. Quantification of Adiposity in Small Animal Rodents using Micro-CT. Methods. 50, 14 (2010).
- Luu, Y. K., Lublinsky, S., Ozcivici, E., Capilla, E., Pessin, J. E., Rubin, C. T., Judex, S. In Vivo Quantificaiton of Subcutaneous and Visceral Adiposity by Micro Computed Tomography in a Small Animal Model. Med. Eng. Phys. 31, 34-41 (2009).
- Medina-Gomez, G., Gray, S. L., Yetukuri, L., Shimomura, K., Virtue, S., Campbell, M., Curtis, R. K., Jimenez-Linan, M., Blount, M., Yeo, G. S., Lopez, M., Seppänen-Laakso, T., Ashcroft, F. M., Oresic, M., Vidal-Puig, A. PPAR gamma 2 prevents lipotoxicity by controlling adipose tissue expandability and peripheral lipid metabolism. PLoS Genet. 3, e64 (2007).
- Sakkou, M., Wiedmer, P., Anlag, K., Hamm, A., Seuntjens, E., Ettwiller, L., Tschöp, M. H., Treier, M.A role for brain-specific homeobox factor bsx in the control of hyperphagia and locomotory behavior. Cell Metab. 5, 450-463 (2007).
- Patchen, M. L., MacVittie, T. J., Souza, L. M. Postirradiation treatment with granulocyte colony-stimulating factor and preirradiation WR-2721 administration synergize to enhance hemopoietic reconstitution and increase survival. International Journal of Radiation Oncology. 22, 773-779 (1992).
