Segmentering og Måling av fett Volumene i murine Fedme modeller med X-ray Datatomografiscanning

Summary

Fettinnhold analyse er rutinemessig utført i studier utnytte murine fedme modeller. Emerging metoder i små dyr CT bildebehandling og analyse er å gi for langsgående detalj rikt fettinnhold analyse. Her har vi detalj trinnvise prosedyrer for å utføre små dyr CT bildebehandling, analyse og visualisering.

Abstract

Fedme er assosiert med økt sykelighet og dødelighet, samt reduserte beregningene i livskvalitet. ¹ Både miljø og genetiske faktorer er forbundet med fedme, men de presise underliggende mekanismene som bidrar til sykdommen blir nå avgrenset. ^2,3 flere små dyr modeller av fedme har blitt utviklet og er ansatt i en rekke studier. ^4. En viktig komponent i disse eksperimentene innebærer samling av regionale og / eller total dyreforsøk fettinnhold data under varierende forhold.

Tradisjonelle eksperimentelle metoder for å måle fettinnholdet i små dyremodeller av fedme omfatter invasiv (f.eks ex vivo måling av fett innskudd) og ikke-invasive (f.eks Dual Energy X-ray absorpsjonsmetri (DEXA) eller magnetisk resonans (MR)) protokoller, som hver presenterer relative trade-offs. Gjeldende invasive metoder for å måle fettinnhold kan gi detaljerfor orgel og region spesifikk fett distribusjon, men å ofre fagene vil utelukke langsgående vurderinger. Motsatt dagens ikke-invasive strategier gir begrenset informasjon for orgel og region spesifikk fett distribusjon, men at verdifull langsgående vurdering. Med bruk av dedikerte små dyr X-ray computertomografi (CT) systemer og tilpassede analytiske prosedyrer, både orgel og region spesifikk analyse av fett distribusjon og langsgående profilering kan være mulig. Nyere rapporter har validert bruken av CT for in vivo langsgående avbildning av fedme i levende mus. ^5,6 Her tilbyr vi en modifisert metode som gjør det mulig for fett / total volum måling, analyse og visualisering utnytte Carestream Molecular Imaging Albira CT system sammen med PMOD og Volview programvarepakker.

Protocol

1. Dyr

1. For resultatene rapporteres nedenfor, ble tre C57BL/6J mus og fire B6.V-LEP ^ob / J mus innhentet fra Jackson Laboratories (Bar Harbor, Main, USA). B6.V-LEP ^ob / J mus representerer en av de tidligste modellene av fedme og forblir aktivt forsket på. B6.V-LEP ^ob / J mus viser en fenotype preget av økt adipocyte størrelse og antall, og kan veie opptil tre ganger mer enn villtype mus. ^7,8 Her ble B6.V-LEP ^ob / J mus ansatt som en positiv kontroll for en overvektig fenotype for å illustrere muligheten for Albira CT system for CT-baserte fettinnhold målinger.
2. Imaging ble utført da dyra nådde ca 12 uker gammel. (Fedme i B6.V-LEP ^ob / J mus er åpenbar etter 4 ukers alder).
3. Mus var bedøvet av Isofluorane (2,5% flow rate) og holdt under på 2,5% via en nese-konus oppsett for bildebehandling. Enimals ble plassert utsatt i standard rotte sengen (M2M Imaging Inc. Cleveland, Ohio) i følger med Albira bildet stasjonen. Lemmer var plassert sideveis fra torso for en enhetlig CT oppkjøp.
4. Etter bilde oppkjøpet ble gjennomført, ble mus fjernet fra nesen kjegle og tilbake til en bedring bur til ambulerende.

2. Image Acquisition og Reconstruction

1. Bilde oppkjøp er utført ved hjelp av Albira CT-systemet (Carestream Molecular Imaging, Woodbridge, CT). Mus var bedøvet av Isofluorane (2,5% flow rate) og holdt under på 2,5% via en nese-konus oppsett for bildebehandling. Oppkjøp ble utført for å skanne en seng av 115 mm lengde, med 600 anslag. The X-ray kilde ble satt til en strøm av 200 μA og spenning på 45 kVp, og brukte en 0,5 mm Al filter for å herde strålen.
2. Tilnærmet stråling dyp doseekvivalent for CT innstillinger var 220 mSv, og grunne doseekvivalent var 357,4 mSv. Dissedoser er over 20 ganger lavere enn rapportert LD50 verdier. ⁹
3. Bildene er rekonstruert ved hjelp av FBP (Filtrert tilbake Projection) algoritme via Albira Suite 5.0 Reconstructor bruker "Standard" parametere. Disse kombinert erverv og gjenoppbygging innstillinger produsere et endelig bilde med 125 mikrometer isotrope voxels, anses tilstrekkelig for hele dyr analyse. For detaljert region spesifikk analyse, kan en rekonstruksjon med 35 mikrometer isotrope voxels velges for en endelig oppløsning på 90 mikrometer.

3. Bildeanalyse

Bildeanalyse er utført ved hjelp av PMOD (PMOD Technologies LTD, Zürich, Sveits) analyse programvare. Bildene er segmentert i PMOD ifølge vev tetthet-først for total volum og deretter for fett volum.

3.1 Bilder kan reduseres til analyse for å minimere beregningsorientert krav.

1. For å redusere, navigerer du til hovedvisningen kategorien. Velg Verktøy> Reduce.
2. Velg X med 2, Y og 2, og Z med 2.
3. Sjekk Erstatt.
4. Velg Kjør.

Meldingen: "markeringsrammen vil endre seg" vises når reduksjonen er fullført.

3.2 Bilder kan maskeres for å eliminere bed og nese-cone elementer for påfølgende volum-of-interesse (Voi) analyse.

1. Å maskere, navigere til Planes, layout, rotasjoner, Mirror, 3D markører> Planes og utforminger.
2. Velg Show fly Z.
3. Bla til nesen membran i Z planet.
4. Velg den viktigste Voi kategorien> Tegn toppunkter.
5. Tegn en region av interesse (ROI) rundt dyret nese-eksklusive sengen og nesen kjegle.
6. VelgKopier Faktisk avkastning.
7. Flytte til neste skive, og lime ROI fra buffer gjennom de aktuelle flyene av nesen.
8. Bruk Rediger Gruppe av hjørner for å justere Rois som nødvendig.
9. Velg Slett ROI på de første flyene utover nese kjegler.
10. Generer en ny Voi å omfatte dyret omkrets (unntatt dyr seng) på de første flyene utover nese kjegler.
11. Naviger til Voi Verktøy> Maskering og Algebra.
12. Skriv -1000 i dialog boksen.
13. Velg Mask voxels utenfor den valgte VOIs knappen.

Meldingen: ". Irreversible data operasjon Vil du fortsette?" skjermer.

14. Velg Yes.
15. Navigere til Planes, layout, rotasjoner, Mirror, 3D markører> Planes & Layouts.
16. Velg Vis alle plan.
17. Undersøk Voi for integritet.
18. Velg Lagre.
19. Lagre som Analyser.
20. Endre filnavnprefikset.

3.3 Først segment bildet for total dyr volum:

1. Velg Verktøy> External.
2. Velg Segmentering boksen.
3. Skriv en rekke -300 til 3500 (tetthet områdereferanse avledet fra magefett-regionen tetthet rekkevidde).
4. Velg Kjør Segmentering.
5. Undersøk integritet segmentering.
6. Velg OK.
7. Velg Fjern ROI.
8. Velg Voi statistikk.

Rapporterte statistikk representerer det totale volumet.

9. Noter rapporterte volumet.

   3.4 Deretter segment bildet for fett volum:

   1. Gå tilbake til ikke-segmenterte maskert bilde for fett-volum segmentering.
   2. For å laste den lagrede Masked datafil, sjekk Analyser boksen i Load-vinduet).
   3. Velg Verktøy> External.
   4. Velg Segmentering boksen.
   5. Skriv en rekke -200 til -50.
   6. Velg Kjør Segmentering.
   7. Undersøk integritet segmentering.
   8. Velg OK.
   9. Velg Voi statistikk.

   De rapporterte statistikken representerer fett volum.

   10. Noter rapporterte volumet.
   11. Velg Lagre.
   12. Lagre som Analyser.
   13. Endre filnavnprefikset.

   Valgfritt: Hvis hud / perifer tetthet gjenstår, kan "Erosjon og Dilation" protokoll nedenfor utføres for å eliminere disse regionene for Voi analyse.

   1. Velg Verktøy> External.
   2. Velg Morfologisk boksen. De Morfologiske vise displayene.
   3. Velg erosjon.
   4. Velg OK.
   5. Velg Verktøy> External.
   6. Velg Morfologisk boksen. De Morfologiske vise displayene.
   7. Velg Dilation.
   8. Velg OK.

   4. Visualisering av CT-bildene

   4,1 VolView v3.2 (Kitware, Clifton Park, NY, USA) ble brukt for å skape ytet 3D visuelle visninger av segmenterte bilder.

   Analyser-format.
   1. Bruk standardinnstillingene i pop-up vindu.
   2. Åpne plug-ins menyen.
   3. Under Utility, velg Flett volumer.
   4. Fjern merkingen Rescale Components.
   5. Klikk Tilordne Second inngang.
   6. Velg segmenterte fett dataene for andre innspill.
   7. Bruk standardinnstillingene i pop-up vindu.
   8. Klikk Bruk plug-in.
   9. Dobbeltklikk Volume visning vindu for en større visning av faget musen.

   4.2 Tilbake til Color / Opacity kategorien. Komponenten drop-down boks refererer til som datasett blir redigert. To glidere er plassert nederst på fanen og bestemme den relative lysstyrke for hver komponent datasett i overlay, med verdier 0 til 1. For en komponent, the CT, foretrekker vi å bruke en gråtone fargevalg. Å endre farge:

   1. I Scalar Color Mapping seksjon, dobbeltklikker du på en av farge glidere.
   2. Slik fjerner du en skyveknapp, drar den ut av esken.
   3. For å legge til en ny skyveknapp Klikk hvor som helst innenfor glidebryteren området.
   4. Ta en av glidere.
   5. Gjør venstre fargeskyvekontrollen svart (skalar verdi (S) = -19 000).
   6. Gjør rett farge skyveknapp hvit ((S) = 15 000).
   7. Fra Scalar Opacity kartlegging boksen, opprette et nytt punkt ved å klikke innenfor boksen. Dette vil gi en totalt tre poeng i vinduet.
   8. For midt punktet, endre (S) til ~ -3000, og Opasitet (O) verdien til 0.
   9. Velg det tredje punktet på høyre side av vinduet.
   10. Endre (S) til ca 32000, og 0,25.
   11. Det første punktet kan være hvor som helst til venstre, like lenge som Opasitet verdien er satt til 0.
   12. Bytt til komponent to, som skal redigere utseendet på fettet.
   13. Endre hver av farge glidebryterne til rødt ved å dobbeltklikke og skyve Hue (H) skyveknappen mot venstre for å falske farger kart fettet til rødt. Svært lite annet burde ikke være nødvendig å justere utseendet på fettet.

   4.3 For å opprette en tre-panel rotasjon film som viser CT, fett, og overlay:

   1. Klikk og dra faget musen i en oppreist posisjon med ryggen mot deg.
   2. Under Komponent Vekter, sett verdien av Component to til 0 for å vise bare det CT scan.
   3. Klikk på> Kamera.
   4. Velg et antall rammer FOr rotasjonen filmen (for den foreliggende saken, valgte vi "36").
   5. Endre X rotasjon verdien til 360 grader.
   6. Velg Opprett.
   7. I pop-up-dialogboksen, opprette en ny mappe som heter CT, og lagre filen i TIFF-format, som vil generere en rekke rotasjon bilder.
   8. Gjenta dette trinnet for fett bilde, samt for den overlappet fett / CT-bilde, lagre dem i individuelle mapper hver gang.

   4,4 ImageJ v 1.43u ble brukt til å generere en rotasjon filmfil bruke VolView utgang bildene.

   1. I ImageJ, velger du Fil> Importer> Image Sequence.
   2. Velg det første bildet i CT-mappen. Programvaren vil automatisk oppdage de andre filene og åpne dem som en stabel.
   3. Gjenta for å åpne de fete og overlay sekvenser.
   4. Åpne ROI leder henhold Analyze> Verktøy> ROIManager.
   5. Tegn en ROI rundt emnet mus, unntatt unødvendig bakgrunn piksler.
   6. I ROI leder, klikker du Legg til legge til avkastningen.
   7. Velg et annet bilde sekvens.
   8. I ROI leder, klikker du på ROI å bruke den på bildet. På denne måten vil hver av de beskårne stablene matche opp perfekt.
   9. Når avkastningen er på alle stablene, høyreklikk innenfor ROI.
   10. Velg Dupliser.
   11. Velg Sjekk Duplikat Stack Box å skille avkastningen fra resten av bildet.
   12. Lukk større bilde stabler.
   13. Gjenta denne prosedyren for alle tre bildesekvenser.
   14. Gå til Image> Stabler> Verktøy> Kombiner å kombinere de stabler sammen.
   15. Velg CT for Stack 1.
   16. Velg Fat for Stack 2.
   > Gjenta og velg Kombinert Stacks for Stack 1 og Overlay for Stack 2.
   17. Det er nå en tre-panel, image-rotasjon stack som kan forhåndsvises ved å velge Play i nedre venstre hjørne av bildevinduet.
   18. Hvis du vil lagre filmen som en AVI, velger du Fil> Lagre som ...> AVI ...
   19. Klikk på Lagre.

   5. Representative Resultater

   Resultater for tre WT (C57BL/6J) mus og fire overvektige (B6.V-LEP ^ob / J) mus rapporteres her som et representativt eksempel på fett / total volum ratio målinger ansette Albira CT-systemet. Figur 1 nedenfor gir et representativt skjerm laget med VolView v3.2 for segmenteringen (dvs. totalt volum og fett volum) av overvektige mus CT-bilder.

   0/3680fig1.jpg "/>
   Figur 1. Representative CT-bildene segmenterte for fett. (A) Obese mus (B6.V-LEP ^ob / J) CT totalt volum i gråtoner, (B) fett volum i rødt, og (c) image fusjon. (D) WT mus (C57BL/6J) CT totalvolum i gråtoner, (E) fett volum i rødt, og (F) image fusjon.

   Totalt volum, fett volumer, og beregnede fett / totalt volum ratio er rapportert nedenfor i tabell 1 for hver WT mus og hver overvektige mus. Den gjennomsnitt fett / total volum ratio for WT gruppen og overvektige gruppen var 0,09 og 0,42 henholdsvis (figur 2). De fete / totalt volum forholdstall for WT mus kontra de overvektige mus ble funnet å avvike signifikant (p = 0,001).

   WT (C57BL/6J)	Totalt (cm 3)	Fat (cm 3)	Fat / Total Ratio	Fedme (B6.V-LEP ob	Totalt (cm 3)	Fat (cm 3)	Fat / Total Ratio
   Animal 1	28.79	3,00	0,10	Animal 1	66.25	26.75	0,40
   Animal 2	33.25	3,05	0,09	Animal 2	61.15	26.31	0,43
   Animal 3	30.30	2,63	0,09	Animal 3	64.19	25,7	0,40
   				Animal 4	54.25	23.78	0,44

   
   

   Tabell 1. Totalt volum, fett volum,og fett / total volum for WT og overvektige mus. Total og fett volumer ble avledet fra segmenterte bilder ved hjelp PMOD Voi analyse.

   
   Figur 2. Gjennomsnitt fett / total volum for WT mus versus overvektige mus. Gjennomsnitt fett / total volum for WT (C57BL/6J) og fedme (B6.V-LEP ^ob / J) funnet å være 0,09 og 0,42 henholdsvis vises. (Feilfelt = singel standardavvik). WT versus overvektige fett / totalt volum forholdstall ble funnet å avvike signifikant (p-verdi = 0,001).

Discussion

Her utnytte B6.V-LEP ^ob / J mus har vi illustrert mulighetene for å utføre fettinnhold målinger i et lite dyr modell med Albira CT-systemet. Disse målingene er i samsvar med forventningene for sammenligninger av konserninterne og inter-gruppe målinger. For det første, forutsatt representative resultatene her markere begrenset konserninterne variasjon i målinger av fett / total volum forholdstall i både WT og overvektige mus grupper ved hjelp av disse prosedyrene. Dernest fett / total volum for WT versus overvektige mus signifikant forskjellig. Til slutt, basert på sammenligninger (vises ikke) med tidligere verdier rapportert for relativ total fettmasse og prosent kroppsfett for WT versus B6.V-LEP ^ob / J mus, våre målinger for fett / total volum for WT versus B6.V- LEP ^ob / J mus faller innenfor en forventet ^{rekkevidde, 7, 8.}

Metodene beskrevet her kan brukes eller tilpasses andre models-og / eller studere mål. Endringer i gjenoppbyggingen parametere kan være nødvendig for å oppnå spesifikke mål. For eksempel, Judex et al. (2010) rapporterte at 50 mikrometer oppløsning var nødvendig for enkelte region spesifikk analyse. En cm isotrope mengder ett bilde kan velges for 35 mikrometer rekonstruksjoner i Albira 5,0 Suite Reconstructor bruke "HR" rekonstruksjon alternativet. Når Albira CT-systemet har vært benyttet for region og orgel spesifikke fettinnhold målinger de fulle ytelser (dvs. samtidig region og orgel spesifikke FAT-volum målinger og langsgående målinger) av CT basert fettinnhold analyse kan bli realisert for Albira CT-systemet.

Konklusjon:

Her gir vi en detaljert, trinnvis metode for måling av fettinnhold i levende mus som bruker X-ray CT bildebehandling. Vi kjøpte våre CT-datasett ved hjelp av en Albira bilde stasjon, og utføres påfølgende segmentering og analyse bruker PMOD programpakken. Til slutt gir vi instruksjonene for å aktivere lettvinte rendering og visualisering av fettvev distribusjon i hele dyret.