Summary
Assay שחרור הכרום, assay משותף לאיתור פעילות תא T ציטוטוקסי, יש מספר מגבלות. השימוש באנטיגן ספציפי CD8 תאי T וקו האנושי של סרטן שד גידול, SKBR3, במאמר הנוכחי, גישה מבוססת עכבה נבדקה ליכולת של גילוי הרג תא.
Abstract
ציטוטוקסיות CD8 תאי T מהווים תת קבוצה של תאי T שהם מסוגלים גרימת המוות של תאי מארח 1 נגוע או ממאיר. תאים אלה מבטאים קולטן מיוחד, הנקרא קולטן תא T (TCR), שיכול לזהות פפטיד אנטיגני ספציפי חייב HLA כיתה אני מולקולות 2. אירוסין של תאים נגועים או תאים סרטניים באמצעות התוצאות שלהם HLA Class I המולקולה בייצור של מולקולות ממסות כגון granzymes וperforin וכתוצאה מכך המוות של תאי היעד. למרות שזה שימושי לקביעת תדרים של אנטיגן ספציפי לתאי T CD8 באמצעות מבחני כגון cytometry ELISPOT או זרימה, זה גם מועיל לברר את כוחו של CD8 T תגובות תא באמצעות מבחני cytotoxicity 3. Assay המוכר ביותר להערכת תפקוד ציטוטוקסיות הוא Assay שחרור הכרום (CRA), שנחשב 4 assay סטנדרטי. יש CRA מספר מגבלות, כולל חשיפה של תאים לקרינת גמא, LACK של שחזור, ודרישה למספר גדול של תאים. במהלך העשור האחרון, יש כבר עניין באימוץ אסטרטגיות חדשות כדי להתגבר על המגבלות האלה. חדש יותר גישות כוללים את אלה שמידת caspase שחרור 4, BLT פעילות ולין 5 ומשטח ביטוי של CD107 6. Assay עכבה מבוסס, באמצעות מערכת xCelligence רוש, נבחן בנייר הנוכחי לפוטנציאל שלו כאלטרנטיבה לCRA. עכבה או התנגדות לזרם חשמלי מתרחשת כאשר תאים סרטניים חסיד להיקשר לצלחות אלקטרודה. תאים סרטניים להינתק בעקבות הרג ועכבה חשמלית מופחתת הניתן למדידה על ידי מערכת xCelligence. היכולת להתאים את הגישה מבוססת עכבה להעריך הרג תא בתיווך נשענת על התצפית שתאי T לא לדבוק באופן הדוק על רוב המשטחים ולא נראה שיש לי הרבה השפעה על עכבה וכך הולכת ופוחתת בכל חשש להתערבות ישירה של תאי T עםהמדידה. תוצאות מראות כי assay עכבה מבוסס יכול לזהות שינויים ברמות של CD8 תאי T ציטוטוקסיים אנטיגן ספציפי עם רגישות מוגברת ביחס לCRA הסטנדרטי. בהתבסס על תוצאות אלו, עכבה מבוססת גישות עשויות להיות חלופות טובות לCRAs או גישות אחרות שמטרתם למדוד את הפונקציונליות ציטוטוקסיות CD8 T תא.
Protocol
1. דור של CD8 T שורות תאים אנושי אנטיגן הספציפיים לזמן קצר 7
- תאים נפרדים דם היקפי (mononuclear PBMCs) מהדם של תורמים בריאים נורמלים HLA-A2 חיוביים באמצעות Ficoll-Paque פלוס.
- הוסף 2 מ"ל / היטב PBMCs ל6 גם צלחות ב2 x 10 6 תאים / מ"ל.
- הוסף HER-2/neu HLA-A2-p369-377 מחייב פפטיד (KIFGSLAFL רצף חומצות האמיניות) או HLA-A2-מחייב שפעת P58-66 פפטיד (GILGFVFTL) ישירות לבארות בריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ"ל והמקום בחממה ב 37 ° C עם 5% CO 2.
- כדי לעזור לעורר ולהרחיב את תאי T, להוסיף, כל 2 ימים, 250 תקשורת μl / גם טרי בתוספת IL-2 האנושי רקומביננטי (מניות: 50 יחידות / μl) כדי להשיג ריכוז סופי של 50 יחידות / מ"ל בתקשורת ובתרבות.
- Re-לגרות את תאי התרבות עם 2 x 10 6 תאים / מ"ל PBMCs אוטולוגי מוקרן פעמו למשך 2 שעות עם 10 מיקרוגרם / מ"ל של אותם פפטידים להשתמשד בשלב 1.3 ולהוסיף תאים אלה לתרבויות במ"ל / גם שבוע לאחר גירוי הפפטיד הראשון 1.
- הוסף מדיה אנושית רקומביננטי IL-2 ורעננה, כפי שמתוארת בשלב 1.4, לתרבויות הקיימות כל 2 ימים.
- Re-לגרות את התאים עם פפטיד PBMCs אוטולוגי והמוקרן כמתואר בשלב 1.5 שבוע לאחר גירוי הפפטיד השני.
- הכן להשתמש בתאים שישה ימים אחרי מחדש גירוי האחרון בבית המוקדם.
2. הכנת תאי סרטן השד
- מקם את תחנת מדידת עכבת xCelligence (תחנת xCelligence) בחממה ב 37 ° C עם 5% CO 2.
- קציר תאי אדם סרטניים (SKBR3, BT20, MCF7 או HCC1419) כי הם מחוברות 75% באמצעות טריפסין 0.25% וצנטריפוגה (1,000 סל"ד במשך 5 דקות).
- ספירת תאים סרטניים באמצעות hemocytometer ולשקם אותם בתקשורת סרטניים RPMI (בתוספת 10% בסרום שור עוברי (FBS) ו -500 יחידות / מ"לIFN-gamma) בריכוז של cells/100 μl 7.5 x 10 3 גידול.
- תכנית תוכנת xCelligence על ידי הקמת דף הפריסה כדי לקבוע פריסה היטב ועל ידי הקמת דף לוח הזמנים כדי לקחת קריאות עכבה כל 5 דקות לתקופה 40 שעות ביממה. במשך 18 השעות הראשונות, מערכת xCelligence תיקח קריאות עכבה של תאים הסרטניים בלבד.
- הוסף 100 μl של מדיה סרטניים RPMI לxCelligence E-צלחות ולבצע רקע קריאה על ידי מדידת עכבה בהעדר תאים.
- הוסף תאים סרטניים לדואר הצלחות ב100 μl לכל טוב ומקום בתחנת xCelligence.
- לחץ על כפתור ההפעלה על תוכנת xCelligence להתחיל לקחת קריאות עכבה של תאים הסרטניים, שמייד מתחילים הקפדה על הלוחות אלקטרוניים.
3. תרבות משותפת של גידול עם CD8 תאי T
- ברגע שהתאים הסרטניים יש מצורפים והוכפלו לרמה של 1.5 x 10 4 תאים סרטניים לכל גם (approximately 18 שעות לאחר ההתחלה להיות מצופה), תאי T קציר הכינו בסעיף 1 על ידי גירוד ותסיסה עדינים
- צנטריפוגה ב 1000 סל"ד במשך 5 דקות ולספור תאי T באמצעות hemocytometer ולשקם אותם בתקשורת RPMI עם FBS 10% ביחסים שונים, החל משעת יחס מרבי של תאים סרטניים 1 עד 40 תאי T ולדלל פי 2 עד יחס של תא 1 גידול לרמה של 1.25 תאי T הוא הגיע. לדוגמה, יש 1.5 x 10 4 תאים סרטניים בכל טוב. כדי להשיג יחס 1:40, להוסיף 6 x 10 5 תאי T לכל טוב ולדלל את תאי T של פי 2 עד יחס של 1.5 x 10 4 תאים סרטניים ל1.875 x 10 4 תאי T בכל טוב (1:1.25 יחס) מושגת.
- להשהות את תחנת xCelligence ולהסיר דואר הצלחת.
- הסר את המדיה בבארות עם pipet ולהוסיף 200 μl של מדיה לבד או היחס המתאים של תאי T לבארות.
- הנח את דואר הצלחת בחזרה בתחנת xCelligence ולהמשיך פרו תוכנת xCelligenceכך גרם קריאות עכבה נלקחות כל 5 דקות במשך כ 20 שעות לאחר בנוסף תא T.
- לנרמל את התוצאות בסופו של הדבר של assay.
4. כרום שחרור assay (CRA) 7
- עקוב נהלי בטיחות קרינה מוסדיים בעת עבודה עם 51 Cr ו51 תאי יעד Cr-שכותרתו. תמיד להשתמש במיגון מתאים כדי להפחית את החשיפה לקרינה.
- תאים סרטניים דופק עבור 2 שעות 1 x 10 6 תאים / מ"ל סרטניים עם 10 51 Cr הטרי μl / מ"ל (0.005 Ci / מ"ל).
- לשטוף את התאים סרטניים ב10 מ"ל של תקשורת RPMI עם FBS 10% ו צנטריפוגות ב 1000 סל"ד במשך 5 דקות. הוסף תאים סרטניים לצלחת 96 היטב מסביב לתחתית ב1 x 10 5 תאים סרטניים ב100 μl / כן.
- הוסף תאי T ביחסים שונים, החלו בתא גידול 1 עד 40 תאי T ולדלל פי 2 עד יחס של 1 ל -1.25 תאים סרטניים ותאי T מושגת. לדוגמה, יש 1 x 10 5 תאים סרטניים בכל טוב. כדי להשיג יחס 1:40, להוסיף 4 x 10 6 תאי T לכל טוב ולדלל את תאי T של פי 2 עד יחס של 1 x 10 5 תאי גידול לרמה של 1.25 x 10 5 תאי T בכל טוב (1:1.25 יחס) מושגת.
- הוסף פקדי תאים סרטניים ספונטניים ומקסימום לצלחת. על מנת לחשב את השחרור הספונטני של 51 Cr מתאי הגידול, להוסיף שש בארות המכילים כל אחד מהם x 10 5 תאים סרטניים 1 ב100 עד 100 μl μl של תקשורת RPMI עם FBS 10%. כדי לחשב שחרור מרבי של 51 Cr מתאי הגידול, להוסיף שש בארות המכילים כל אחד מהם x 10 5 תאים סרטניים 1 ב100 μl עד 100 טריטון 0.1% μl X-100 ב PBS, שlyses כל התאים.
- דגירה הצלחות במשך 5 שעות על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
- לאחר דגירה, להסיר 50 μl של supernatant מכל טוב ולהוסיף אותו לצלחת לומה.
- ייבש את צלחות לילה ולמדוד CPM באמצעות מונה גמא.
- assay עכבה: קח קריאת העכבה, כפי שדווחה במדד התא (CI), בנקודות זמן שונות, ולהשתמש בנוסחא הבאה כדי לקבוע תמוגה אחוזים: (גידול CI בלבד - (CI + T תאים סרטניים)) (גידול CI בלבד) / * 100.
- CRA: השתמש בנוסחא הבאה כדי לקבוע תמוגה אחוזים: (CPM הניסיוני - ספונטני CPM) / (CPM מרבי - ספונטני CPM) * 100.
6. נציג תוצאות
תאי T לבד לא להגדיל את העכבה
תאי T, באופן כללי, לא לדבוק במשטחים המוצקים ביותר ואינם דורשים היצמדות לצורך ההפעלה והשגשוג. לכן, זה היה שיערותיו שתאי T לא צריכים לתרום לעכבה על xCelligence E-הצלחות. כדי לבחון זאת, בארות הועמסו עם או SKBR3 תאי סרטן שד או טרי מטוהר אדם CD8 תאי T. עכבה נמדדה במשך 40 שעות וdemonst דוגמה מייצגתדירוג השפעה מועטת במהות של תאי T מוצגת באיור 1 א. לעומת זאת, ניתן לטעון כי תאי T עשויים להפחית עכבת רקע, אם כי רק במעט. למרות זאת, התרבות משותפת גילתה כי התהליך של הוספת תאי T ב18 שעות לאחר תחילת מדידות עכבה הביא לשיבוש עכבה (איור 1). מחקרים אחרים גילו כי שיבושים נבעו בחלקו לטיפול שכן ההפחתה באות יכולה להיות מופחת על ידי הבטחת הטמפרטורה של התמיסה המכילה תאי T היה אותו הדבר כמו הפנים של החממה.
ירידות בתיווך עכבה על ידי תאי T הן תלויות מינון.
השירות של assay עכבה מבוסס להשוות דגימות לפעילות תא T ציטוטוקסי דורש את היכולת להבחין בין ריכוזים של תאי T אנטיגן ספציפיים שונים. כדי לבדוק אם זה אפשרי, תאי SKBR3 היו שיתוף תרבותיים עם משתנה ריכוזtions של תאי T נגזר משורת תאי T HER-2/neu הספציפית p369. כפי שמוצג באיור 2 א, ירידה בעכבה היו תלויה במינון של תאי T. מראה איור 2 כי המדדים בתא 10 שעות אחרי פולינום מסדר השנייה פשוט על פני הטווח של תאי T. לפיכך, תחנת xCelligence מנטרת CD8 מות תא T תיווך של SKBR3 גידולים בזמן אמת כמו ירידה במדד תא.
Assay עכבה מבוסס תאי T מזהה אנטיגן ספציפי
כדי לקבוע אם ירידה בעכבה של SKBR3, שהוא קו HER-2/neu וHLA-A2 חיובי לסרטן שד תאים סרטני, על ידי תאי T HER-2/neu p369 ספציפיים היו אנטיגן ספציפיים, בארות נפרדות המכילות גם SKBR3 הודגרו עם תאי T הנגזרים משורת תאי T שפעת (שפעת) ספציפית. התאים ספציפיים-T השפעת שימש כביקורת שאינה ספציפית, להיות HLA-A2 חיובי, אך לא נתקל בכל יכולת לזהות HER-2/neu. כפי שניתן לראות באינטרנט אלחוטיgure 3, יש הבדל משמעותי בין הפעילות של ממס HER-2/neu תאי T-p369 ספציפיים, בהשוואה לתאי T ספציפי לשפעת (p <0.0001). במקרים מסוימים, תאי T לא ספציפיים לגידול (למשל שפעת ספציפית או anti-CD3/anti-CD28 מגורה) הפגינו רמת פעילות נמוכה ממס (איורים 3A-B). תאי T יכולים להרוג באחת משתי דרכים, או שאינם דווקא דרך פאס: אינטראקציות יגנד פאס או אנטיגן ספציפי באמצעות שחרורו של granzymes וperforins. כדי להמשיך לאשש את הרעיון שתאי T הורגים HER-2/neu-specific באופנת אנטיגן ספציפית, אנחנו שולבו נוגדן חסימה ליגנד פאס. כפי שניתן לראות באיור 3 ב, הנוגדן לא הפחית את הפעילות של ממס HER-2/neu תאי T-p369 ספציפיים. הנוגדן יכול לעכב אינטראקציות בין פאס ויגנד FAS, כפי שמודגם בתאי T שהופעלו הלא במיוחד עם anti-CD3/CD28 חרוזים. תוצאות אלו מצביעות על כך שכאשרתאי T ספציפיים לגידול נבדקו עם תאי T שאינם ספציפיים לגידול, מצור יגנד פאס עשוי להיות נחוץ כדי להפחית את אינטראקציות תיווך הלא TCR למינימום. לחלופין, בעת שימוש בקווי T בתרבית תאים לזמן הקצר שבו רק חלק קטן מתאי T ספציפי לאנטיגן משמש לייצור vivo לשעבר, את האפשרות של הפעלת תא T אי התאמה בתיווך MHC יכולה להתרחש מובילה לתמוגה שאינן ספציפית. במקרה זה, התוספת של נוגדנים החוסמים את HLAs לא רלוונטי עשויה להיות מוצדקת. כדי לקבוע אם תאי T-p369 הספציפיים הורגים תאים סרטניים בכיתת HLA נוספו לי באופן תלוי, או נוגדנים שאני אנטי HLA-כיתה או נוגדן שליטת אלוטיפ לשיתוף התרבויות. כפי שניתן לראות באיור 3 ג, תמוגה על ידי תאי T-p369 ספציפיים דוכא על ידי הכללתו של הנוגדן מדגימה HLA כיתה אני הגבלה. לבסוף, מאז הפיתוח של assay זה היה במידה רבה לעשות זאת באמצעות SKBR3, היה חשוב לברר אם חסיד אחר HLA-תאים סרטניים המבטאים A2 וHER-2/neu יכלו להיהרג על ידי תאי T-p369 ספציפיים. כך, תאי T היו מוכנים והוסיפו ביחס 01:05 לתאים סרטניים HER-2/neu-expressing HCC1419 תאי HLA-A2, וSKBR3, MCF-7, ו. שורת תאי הגידול השלילית HLA-A2, BT20 שימש כביקורת שלילית. כפי שניתן לראות באיור 3D, כל תאים סרטניים נוספים אלה, למעט BT20 נהרגו גם כפי שהוערך על ידי עכבה. לכן, השיטה שנראה שימושית לתאים סרטניים חסיד מספר היעד.
Assay עכבה מבוסס הוא רגיש יותר מassay שחרור הכרום הסטנדרטי באיתור פעילות תא T ציטוטוקסי
(51 Cr) assay שחרור הכרום (CRA) המודד את פעילות cytolytic כבר זמן רב את תקן הזהב שבאמצעותו לעקוב אחר תגובות תא T CD8. ב assay זה, תאי היעד (תאים סרטניים למשל) מסומנים עם 51 Cr. ברוב המקרים, תאי היעד בריאים יכולים לשמור על רובradiolabel במהלך assay. CD8 תאי T מתווספים לתאי המטרה, בדרך כלל בריכוזים שונים, והרג של תאי המטרה הוא זוהה על ידי שחרורו של 51 Cr לתוך המדיום. מלבד העובדה שהוא משתמש בקרינה מסוכנת, שתי בעיות עיקריות עם CRA הן חוסר הרגישות וכי assay בדרך כלל דורש כמויות גדולות של תאי T CD8, להגביל את התועלת שלו. כדי לקבוע אם assay עכבה מבוסס היה רגיש יותר CRA, HER-2/neu תאי T-p369 הספציפיים נוצרו במבחנה ויישומי, בכמויות משתנות, לאו E-צלחות המכילות תאים סרטניים ללא תווית או צלחות פוליפרופילן רגילות המכילות 51 Cr שכותרתו תאי המטרה. מדידות, או כרום עכבה או בחינם, נמדדו ב5 שעות לאחר בנוסף תא T. איור 4, דוגמה מייצגת, תערוכות assay העכבה בביצועיו על שחרורו הכרום.
הווריאציה התוך assayשל assay עכבה מבוסס הוא בדרך כלל מתחת ל -20%.
וריאציה התוך assay נבחנה, מאז שימוש רחב יותר של assay זה ייקבע במידה רבה על ידי reproducibly והווריאציה (איור 5). שתי שורות תאי T-p369 ספציפיות נוצרו באופן עצמאי זה מזה 30 ימים והוסיפו בשלושה עותקים על פני טווח של תאים סרטניים לתאי T יחסים. גרף הבלעה באיור 5 מראה כי הקווים היו במידה רבה מקביל במונחים של lysing SKBR3 תאים. מקדם% מוריאציה שיחושב לכל תא ויחס זמם. כפי שניתן לראות באיור 5, בין 1:40 ויחסים 1:05 מקדמי% של שונות (CV) היו מתחת ל -15%. ב1:2.5 ו1:1.25, עם זאת, את קורות החיים היו גבוהים או בלתי צפויים. בגלל שונות ביולוגית נרחבות, שלא ניתן למדוד את ההשתנות בין assay-עם שורות תאי T ראשוניות.
איור 1. עכבה צריכה להיות מנורמלת בעקבות התוספת של תאי T. פנל: מראה כי תאים סרטניים (קו אדום) ולא תאי T (קו כחול) הם אחראים לעכבה. מוצגים הם את העתקי העכבה מעל 40 שעות לתאים סרטניים או או לא לבד. תוצאות דומות התקבלו מניסוי שני. שימו לב שאות הפרעות בכ 20 שעות מייצגת את נקודת תוספת של תאי T לבארות שאינו מכילות תאים סרטניים B פנל:. מראה כי מדידות עכבה הם שיבשו transiently עם התוספת של תאי T לתאים סרטניים. זה דורש נורמליזציה בנקודת זמן לאחר התוספת של תאי T (נקודה של נורמליזציה מסומנת בגרף ראה). עקבות מורכבות מנקודות נתונים כפולות. העקבות לתאים סרטניים בלבד מוצגת באדום. את העקבות האחרות לייצג את התאים סרטניים שיתוף תרבותי עם HER-2/neu תאי T-p369 ספציפי (כחול: יחס של 1.25 תאי T / תא גידול, גרין:יחס של 40 תאי T / תאים סרטניים). כל זכר מחושב מנקודות נתונים כפולות נאספו כל 5 דקות את משך דרך התרבות. תוצאות הן נציג של 3 ניסויים נפרדים. לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2. הירידה בתיווך עכבה על ידי תאי T היא תלויה במינון. פנל: המוצגים הם את עקבות העכבה של SKBR3 תאים סרטניים טופחו לבד או עם ריכוזים שונים של תאי T ספציפיים לגידול. כל זכר מחושב מנקודות נתונים שנאספו בשלושה עותקים כל 5 דקות את משך דרך התרבות. תוצאות הן נציג של 3 ניסויים נפרדים לוח ב ':. הראה הם המדדים בתא 10 שעות על פני כל תא T / גידול ריכוזים סלולריים. הקו המקווקו מייצג את מדד התא לתאים סרטניים alאחד. כל סמל הוא ממוצע (± SEM) של קביעות בשלושה עותקים. תוצאות הן נציג של 3 ניסויים נפרדים. לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 3. Assay מבוסס העכבה מזהה תגובות תא T ציטוטוקסיים אנטיגן ספציפיות. לוח מראה את רמת של תמוגה SKBR3 תאים על ידי תאי HER-2/neu p369-T ספציפיים (אדום) או תאי T ספציפיים לשפעת (הכחול) בשעת 5, 10, ו -15 שעות לאחר התרבות המשותפת. כל נקודת נתונים היא ממוצעת (± SEM) של מדידות בשלושה עותקים. תוצאות הן נציג של 3 ניסויים נפרדים. לוח ב 'מראה תמוגה של SKBR3 על ידי תאי T-p369 ספציפיים או תאי T שאינם מופעלים באופן ספציפי, הוכחה כי תמוגה אנטיגן הספציפית אינה בשל לאינטראקציות יגנד FAS-FAS. פסים שחורים מייצגים שיתוף תרבויות שהכיל נוגדני יגנד פאס. כל עמודה הוא תמוגה הממוצעת (± SEM) בשלושה עותקים ב5 שעות לאחר התוספת של תאי T. תוצאות הם נציג של 3 ניסויים נפרדים. לוח ג מראה תמוגה 10 שעות לאחר תוספת של תא T SKBR3 על ידי תאי T-p369 ספציפיים היא ברמת HLA אני תלוי. כך או HLA-כיתה אני חסימה או שליטת אלוטיפ נוספה במהלך התרבות משותפת. כל עמודה הוא תמוגה (± SEM) הממוצעת בשלושה עותקים. הניסוי הזה חזר על עצמו פעמיים עם תוצאות דומות. לוח ד ניתן לראות% תמוגה 10 שעות לאחר תוספת תא T של מספר +, שורות תאי HLA-A2 HER-2/neu-expressing גידול על ידי תאי T-p369 ספציפיים. BT20, שורת תאי סרטן שד HLA-A2-שלילית שימש כביקורת שלילית. כל נקודה מייצגת ניסוי ייחודי מחושב מקביעות בשלושה עותקים. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 4. Assay מבוסס העכבה הוא רגיש יותר מassay שחרור הכרום לצורך זיהוי של תאי T אנטיגן ספציפיים לגידול. מוצגים הם תמוגה% מSKBR3 בתגובה לריכוזים שונים של תאי T-p369 ספציפיים, כפי שנמדד ב5 שעות לאחר גידול ותא T ערבוב הן באמצעות assay עכבה מבוסס וassay שחרור הכרום. כל סמל הוא ממוצע (± SEM) של שלושה משכפל. תוצאות הן נציג של 3 ניסויים נפרדים.
איור 5. מקדמי% תוך assay של וריאציה של assay cytotoxicity תא T עכבה מבוסס. המוצגים הם מקדמים ממוצעים (± סטיית תקן)% תוך assay של וריאציה בתמוגה של SKBR3 על פני טווח של ריכוזים של תאי T אנטיגן ספציפיים. כל סמל הוא ממוצע של שלוש חזרות. מספרים מוצגים בגרף הם לאהוא מתכוון לקורות%. פנל הבלעה מראה את תמוגה% מSKBR3, בריכוזים שונים של תאי T-377-p369 ספציפיים אומר (± SEM, n = 3). שתי שורות תאי T-p369 ספציפיות שנוצרו באופן עצמאי תוך שימוש בתאים T משני תורמים נפרדים מוצגות.
Discussion
CD8 תאי T חשובים לתגובה החיסונית אדפטיבית, להיות מסוגל להרוג תאים נגועים או ממאיר ישירות 4. אמנם יש כמה דרכים למדוד את המספרים של אנטיגן ספציפי CD8 T תאים (למשל ELISPOT, tetramer, cytometry זרימה), לעתים קרובות זה עוזר לדעת אם תאים אלה הם רעילים לתאים 3 מבחינה תפקודית. Assay המוכר ביותר להערכת תפקוד ציטוטוקסיות הוא CRA, אשר נחשב 4 assay תקן זהב. מגבלות עיקריות של CRA הן (1) הדרישה של רדיואקטיביות, (2) חוסר הרגישות, (3) חוסר מידע מכניסטית, (4) דרישה לכמויות גדולות של תאים, ו( 5) להגדיר מייגע. וכך, בעשור האחרון, יש כבר עניין באימוץ אסטרטגיות חדשות כדי למזער את המגבלות האלה. חדש יותר גישות כוללים את אלה שמידת caspase שחרור 4, BLT ולין activity5, ומשטח ביטוי של CD107 6. כתב היד הנוכחית מצביעה על כךassay עכבה מבוסס, שבוצע במערכת xCelligence רוש, עשוי להיות שימושי כאלטרנטיבה לCRA גם. היכולת להתאים את גישת עכבה מבוססת נשענת על התצפית כי תאי T, אשר אינם נצמדים בחוזקה למשטחים, לא נראה שיש לי הרבה השפעה על עכבה וכך הולכת ופוחתת בכל חשש להתערבות ישירה של תאי T עם המדידה. העבודה הנדרשת לשימוש במערכת assay העכבה צפויה להיות נמוך באופן משמעותי בעיקר בשל חיסול החששות הרגולטוריות לשימוש בקרינה רדיואקטיבית. החסרון הבולט היחיד של המערכת מבוססת עכבה הוא שהשקעה של 50,000 $ ל 60,000 $ נדרשת לרכישה של יחידת xCelligence. עם זאת, יחידת xCelligence מבטלת את הצורך במונה קרינה והוא הרבה יותר תכליתי, להיות שימושי להערכת תגובה תאית לסמים והגירה, בנוסף לתא T cytotoxicity 8.
התצפיות שההפחתה בעכבת גידול תא היא תלויה מינון, כמתואר באיור 2, עם מדרון תלול למדי בעקבות פונקציה ריבועית משנית פשוטה מצביע על כך שassay יכול לשמש בהגבלת מבחני דילול (LDAs) כדי לאמוד את השכיחות של תאים ציטוטוקסיות 9 . יתרון אחד עם הגישה מבוססת עכבה הוא כי מספר תאי T ותאים הסרטניים הנדרשים הוא פחות מ CRA, מה שהופך LDA פוטנציאל ריאלי יותר. לדוגמה, בCRA, ביחס 1:40, 1 x 10 5 תאים סרטניים בכל טוב הם מצופים אשר דורש 4 x 10 6 תאי T סך בכל טוב. עם זאת, בassay עכבה מבוסס, רק 1.5 x 10 4 תאים סרטניים בכל טוב יש צורך, אשר צורך רק 6 x 10 5 תאי T סך בכל טוב. לפיכך, assay עכבה מבוסס משתמש 85% פחות תאי T ותאים סרטניים. הפחתה זו מצביעה על כך שהמערכת מבוססת עכבה יכולה להיות מותאמת לניטור חיסוני בניסויים קליניים בבני אדם שבו לאהוא שואב את הכרכים של דם עשוי להיות מוגבלים. כמו כן, בעוד CRA מוגבל לנקודת זמן אחת, assay עכבה מבוסס אוסף בזמן אמת נתונים רציפים, המאפשר למשתמש להשוות נקודות זמן תמוגה מרובות על אותו הניסוי עם עבודה נוספת מינימאלית ותאים. חישובי תדר שעלולים להיות בשילוב עם אסטרטגיות אחרות שלא מודדות פונקציה כגון ניתוחי tetramer להקים את היחס בין תאי T ציטוטוקסיים פונקציונליים לCD8 אנטיגן ספציפיים לכלל תאי T 10. אחת התכונות המושכות ביותר של הגישה מבוססת עכבה הוא כי, בניגוד לרוב מבחני אחרים, יכול להיות במעקב cytotoxicity בזמן אמת, שעלול להיות מה שמקל כדי לחקור אינטראקציות סלולריות עם השימוש במעכבים או נוגדנים. נוסף הוא שהשיטה עשויה להיות מתאימה לתאים סרטניים עמיד בפני תיוג. לבסוף, מאחר שהתאים הסרטניים שאינם נהרגו אינם מסומנים ויישארו סטרילי מסיק נוסף, ומחקר של תאי תא העמידים T הוא possibLe.
לסיכום, בעוד שתי המערכות לספק נתונים הרג סרטניים בתגובה לתאי T הספציפיים, assay עכבה מבוסס הוא רגיש יותר מCRA ומספק פלטפורמה גמישה יותר.
Disclosures
הייצור והגישה חופשי של מאמר וידאו זה ממומן על ידי אבחון רוש.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים לקית' ל Knutson מסוזן ג'קומן לקרן קיור וNIH / NCI 9R01 CA152045 וP50-CA116201.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | Used to isolate PBMCs from blood |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | Cell culture media |
| FBS | Denville Scientific | FB5001-H | Cell culture media |
| Human IL-2 | eBioscience | 14-8029-81 | For stimulating growth of T cells |
| Human Interferon gamma | Cell Sciences | CR2026 | For stimulating MHC expression in tumor cells |
| HER-2/neu p369-377 peptide | Mayo Clinic peptide synthesis core | amino acid sequence KIFGSLAFL | Binds to HLA-A2 |
| Influenza p58-66 peptide | Mayo Clinic peptide synthesis core | amino acid sequence GILGFVFTL | Binds to HLA-A2 |
| Human CD3/CD28 Dynabeads | Invitrogen | 111-61D | For non-specific T cell activation and expansion |
| Chromium-51 | MP Biomedicals | 62015 | CRA labeling reagent |
| E-plate |  Roche Group |
05469830001 | For xCelligence impedance unit |
| Luma plate 96 | PerkinElmer, Inc. | 6005630 | For measuring radioactivity in the Top Count NXT. |
| xCelligence RTCA DP Station | Roche Applied Science |
RTCA DP | Impedance unit |
| Top Count NXT | PerkinElmer, Inc. | C990601 | Scintillation & Luminescence Counter |
| Fas Ligand antibody | BD Biosciences | 556372 | For blocking Fas-Fas ligand interactions |
| HLA-A2 BB7.2 antibody | BD Biosciences | 551230 | For blocking HLA class I |
| Mouse IgG2b, κ | BD Biosciences | 555740 | Isotype control for HLA class I |
| SKBR3 tumor line | ATCC | HTB-30 | Adenocarcinoma |
| MCF7 tumor line | ATCC | HTB-22 | Adenocarcinoma |
| HCC1419 tumor line | ATCC | CRL-2326 | Primary ductal carcinoma |
| BT20 tumor line | ATCC | HTB-19 | Carcinoma |
References
- Zhang, N., Bevan, M. J. CD8(+) T cells: foot soldiers of the immune system. Immunity. 35, 161-168 (2011).
- Garboczi, D. N. Structure of the complex between human T-cell receptor, viral peptide and HLA-A2. Nature. 384, 134-141 (1996).
- Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. Laboratory analysis of T-cell immunity. Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).
- Andersen, M. H., Schrama, D., Thor Straten, P., Becker, J. C. Cytotoxic T cells. J. Invest. Dermatol. 126, 32-41 (2006).
- Weren, A., Bonnekoh, B., Schraven, B., Gollnick, H., Ambach, A. A novel flow cytometric assay focusing on perforin release mechanisms of cytotoxic T lymphocytes. J. Immunol. Methods. 289, 17-26 (2004).
- Aktas, E., Kucuksezer, U. C., Bilgic, S., Erten, G., Deniz, G. Relationship between CD107a expression and cytotoxic activity. Cell Immunol. 254, 149-154 (2009).
- Knutson, K. L., Schiffman, K., Disis, M. L. Immunization with a HER-2/neu helper peptide vaccine generates HER- 2/neu CD8 T-cell immunity in cancer patients. J. Clin. Invest. 107, 477-484 (2001).
- Asiedu, M. K., Ingle, J. N., Behrens, M. D., Radisky, D. C., Knutson, K. L. TGFbeta/TNF(alpha)-mediated epithelial-mesenchymal transition generates breast cancer stem cells with a claudin-low phenotype. Cancer Res. 71, 4707-4719 (2011).
- Strijbosch, L. W., Buurman, W. A., Does, R. J., Zinken, P. H., Groenewegen, G. Limiting dilution assays. Experimental design and statistical analysis. J. Immunol. Methods. 97, 133-140 (1987).
- Gallimore, A. Induction and exhaustion of lymphocytic choriomeningitis virus-specific cytotoxic T lymphocytes visualized using soluble tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complexes. J. Exp. Med. 187, 1383-1393 (1998).
