Summary
Den krom frigjøring assay, en felles assay for påvisning av cytotoksisk T-celle aktivitet, har flere begrensninger. Ved hjelp av antigen-spesifikke CD8 T-celler og human brystkreft tumorcellelinjer, SKBR3, i denne artikkel, ble en impedans tilnærming undersøkt for evnen til å detektere celledrepende.
Abstract
Cytotoksiske CD8 T-celler utgjør en undergruppe av T-celler som er i stand til å indusere død av infiserte eller ondartet vertsceller en. Disse cellene uttrykker en spesiell reseptor, kalt T-celle-reseptoren (TCR), som kan gjenkjenne et spesifikt antigent peptid bundet til HLA-klasse I molekylene to. Engasjement av infiserte celler eller kreftceller gjennom sine HLA klasse I molekyl resulterer i produksjon av lytisk molekyler som granzymes og perforin resulterer i mål celledød. Selv om det er nyttig for å bestemme frekvensen av antigenspesifikke CD8 T-celler ved å bruke assays slik som ELISPOT eller strømningscytometri, er det også nyttig å undersøke styrken av CD8 T-celle responser ved hjelp av cytotoksiske analyser 3.. Den mest gjenkjennelige analyse for å vurdere cytotoksisk funksjon er Chromium Slipp analysen (CRA), som regnes som en standard analysen fire. CRA har flere begrensninger, inkludert eksponering av cellene for gammastråling, lack av reproduserbarhet, og et krav for et stort antall celler. I løpet av det siste tiåret har det vært interesse for å ta i bruk nye strategier for å overvinne disse begrensningene. Nyere tilnærminger inkluderer de som måler caspase 4 utgivelsen, BLT esterase aktivitet 5 og overflate uttrykk av CD107 seks. Den impedans-assay ved å bruke Roche xCelligence system, ble undersøkt i den foreliggende papir for sitt potensial som et alternativ til cra. Impedans eller motstand mot en elektrisk strøm oppstår når adherente tumorceller binde til elektrodeplatene. Kreftceller løsner etter avliving og elektrisk impedans reduseres som kan måles ved den xCelligence system. Evnen til å tilpasse impedansen tilnærming for å vurdere cellemediert dreping hviler på observasjonen om at T-celler ikke holder seg tett til de fleste overflater og ser ikke ut til å ha stor innflytelse på impedans og dermed redusere enhver bekymring for direkte innblanding av T-cellene medmålingen. Resultatene viser at den impedans-baserte analysen kan detektere endringer i nivåene av antigenspesifikke cytotoksiske CD8 T-celler med økt følsomhet i forhold til standard CRA. Basert på disse resultatene, kan impedans-baserte tilnærminger være gode alternativer til CRA eller andre tilnærminger som tar sikte på å måle cytotoksiske CD8 T-celle funksjonalitet.
Protocol
En. Generasjon Kortsiktige Menneskelig Antigen-spesifikke CD8 T-celle Lines 7
- Separate perifert blod mononukleære celler (PBMCs) fra blodet til friske HLA-A2 positive givere ved hjelp Ficoll-Paque pluss.
- Tilsett 2 ml / brønn av PBMC i 6-brønners plater ved 2 x 10 6 celler / ml.
- Legg HLA-A2-bindende HER-2/neu p369-377-peptid (aminosyresekvens KIFGSLAFL) eller HLA-A2-bindende influensa P58-66 peptid (GILGFVFTL) direkte til brønnene i en sluttkonsentrasjon på 10 pg / ml og plass i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO 2.
- For å bidra til å stimulere og ekspandere T-celler, tilsett, etter 2 dager, 250 ul / brønn friskt medium supplert med humant rekombinant IL-2 (lager: 50 enheter / mL) for å oppnå en endelig konsentrasjon på 50 enheter / ml i kultur medium.
- Re-stimulere dyrke celler med 2 x 10 celler / ml 6 bestrålte autologe PBMC pulset i 2 timer med 10 ug / ml av de samme peptidene bruked i trinn 1.3, og legge disse cellene til kulturene ved 1 ml / brønn av en uke etter den første peptid stimulering.
- Legg humane rekombinante IL-2 og friskt medium, som beskrevet i trinn 1.4, i de eksisterende kulturer hver 2 dager.
- Re-stimulere cellene med peptid og bestrålt autolog PBMC, som beskrevet i trinn 1.5 en uke etter den andre peptiddel stimulering.
- Forbered deg på å bruke celler seks dager etter den siste re-stimulering tidligst.
2. Utarbeidelse av brystkreft celler
- Plasser xCelligence impedans måling stasjon (xCelligence stasjon) i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO 2.
- Høste humane tumorceller (SKBR3, BT20, MCF7 eller HCC1419) som er 75% konfluent med 0,25% trypsin og sentrifugering (1000 rpm i 5 minutter).
- Telle tumorceller ved hjelp av et hemocytometer og gjeninnføre dem i RPMI media tumor (supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 500 enheter / mlIFN-y) ved en konsentrasjon på 7,5 x 10 3 svulst cells/100 mL.
- Programmer xCelligence programvare ved å sette opp oppsettet for å bestemme godt layout og ved å sette opp timeplanen for å ta impedans målinger hvert 5. minutt for en 40 timers periode. For de første 18 timer, vil xCelligence systemet ta impedans målinger av kreftceller bare.
- Tilsett 100 ul av RPMI tumor-media til xCelligence E-plater og lesing utføre en bakgrunn ved å måle impedansen i fravær av celler.
- Legg kreftceller til e-plater på 100 mL per brønn og plass i xCelligence stasjon.
- Trykk på startknappen på xCelligence programvare for å begynne å ta impedans målinger av kreftceller, som umiddelbart begynner å følge E-plater.
3. Co-kultur Tumor med CD8 T-celler
- Når kreftceller har festet og doblet til 1,5 x 10 4 tumorceller per brønn (calag 18 timer etter første omgang være belagt), innhøsting T-celler utarbeidet i § 1 ved forsiktig skraping og agitasjon
- Sentrifuger ved 1000 rpm i 5 minutter, og telle-T-celler ved hjelp av et hemocytometer og gjeninnføre dem i RPMI medium med 10% FBS ved forskjellige forhold, som starter på et maksimalt forhold på en tumorcelle til 40 T-celler og fortynn 2 ganger inntil et forhold på en tumor celle til 1,25 T-celler er nådd. For eksempel er det 1,5 x 10 4 tumor celler per brønn. For å oppnå en 1:40 ratio, tilsett 6 x 10 5 T-celler per brønn og fortynne T-cellene to ganger før en ratio på 1,5 10 4 x kreftceller til 1,875 x 10 4 T-celler per brønn (1:1.25 ratio) er oppnådd.
- Pause xCelligence stasjon og ta av E-plate.
- Fjern materialet i brønnene med en pipette og tilsett 200 ul medium alene, eller den passende forhold av T-celler til brønnene.
- Plasser E-platen tilbake i xCelligence stasjon og fortsette xCelligence programvare program så impedans målinger er tatt hvert 5. minutt i ca 20 timer etter T-celle tillegg.
- Normaliser resultatene ved slutten av analysen.
4. Krom Slipp analyse (CRA) 7
- Følg institusjonelle stråling sikkerhetsprosedyrer når man jobber med 51 Cr og 51 Cr-merket målceller. Bruk alltid egnet skjerming for å redusere stråling.
- Puls-tumorceller i 2 timer ved 1 x 10 6 tumor celler / ml med 10 ul / ml frisk 51 Cr (0.005 Ci / ml).
- Vask tumorceller i 10 ml RPMI medium med 10% FBS og sentrifuger ved 1000 rpm i 5 minutter. Legg tumorceller til en 96-brønns rundbunnet plate på 1 x 10 5 tumorceller i 100 ul / brønn.
- Legg T-celler ved forskjellige forhold, begynner på en tumorcelle til 40 T-celler og fortynn 2 ganger inntil et forhold på en tumorcelle til 1,25 T-celler er oppnådd. For eksempel er det en x 10 5 kreftceller per brønn. For å oppnå en 1:40 ratio, legger 4 x 10 6 T-celler per brønn og fortynne T-cellene to ganger før en ratio på 1 x 10 5 kreftceller til 1,25 x 10 5 T-celler per brønn (1:1.25 ratio) er oppnådd.
- Legg spontane og maksimal tumorceller kontroller til plate. For å beregne den spontane frigjøring av 51 Cr fra tumorcellene, tilsett seks brønner som hver inneholder en 10 x 5 tumorceller i 100 pl til 100 ul av RPMI medium med 10% FBS. For å beregne maksimum frigjøring av 51 Cr fra tumorcellene, tilsett seks brønner som hver inneholder en 10 x 5 tumorceller i 100 pl til 100 ul 0,1% Triton X-100 i PBS, som lyserer alle celler.
- Inkuber platene i 5 timer ved 37 ° C med 5% CO2.
- Etter inkubering, fjernes 50 ul av supernatanten fra hver brønn og legge den til en Luma plate.
- Tørke platene over natten og måle CPM bruker en Gamma Counter.
- Impedans analyse: Ta impedans lesing, rapportert som cellen index (CI), på ulike tidspunkter og bruker følgende formel for å bestemme prosent lysis: (CI svulst bare - (CI tumor + T celler)) / (CI svulst only) * 100.
- CRA: Bruk følgende formel for å bestemme prosent lysis: (CPM eksperimentell - CPM spontan) / (CPM maksimum - CPM spontan) * 100.
6. Representant Resultater
T celler alene ikke øker impedans
T-celler, generelt, ikke holder seg til de fleste faste overflater og ikke krever tilslutning for aktivering og spredning. Derfor var det en hypotese om at T-celler ikke skal bidra til impedansen på xCelligence E-platene. For å teste dette, ble brønner lastet med enten SKBR3 brystkreft celler eller ferske rensede humane CD8 T-celler. Impedans ble målt i løpet av 40 timer, og et representativt eksempel demonstRangeringen det vesentlige liten effekt på T-celler er vist i figur 1A. I kontrast, kan det argumenteres for at T-celler kan redusere bakgrunn impedans, om enn bare litt. Til tross for det, avslørte co-kultur som prosessen med å legge T-celler på 18 timer etter start av impedansmålinger resulterte i en impedans avbrudd (figur 1B). Andre studier viste at forstyrrelser var delvis på grunn av håndtering ettersom reduksjon i signalet kan reduseres ved å sikre at temperaturen av den T-celle-holdige løsning var det samme som det indre av inkubatoren.
Reduksjoner i impedans mediert av T-celler er doseavhengige.
Nytten av en impedans-basert assay for å sammenligne prøvene for cytotoksisk T-celle aktivitet krever evne til å skille mellom forskjellige konsentrasjoner av antigen-spesifikke T-celler. For å teste om dette er mulig, var SKBR3 celler co-kultiverte med varierende konsentrasjonsjoner av T-celler avledet fra en HER-2/neu p369-spesifikke T-celle linje. Som vist i figur 2A er det sett redusert impedans avhengig av dose av T-celler. Figur 2b viser at celle-indeksene ved 10 timer følge en enkel andre ordens polynom over området av T-celler. Dermed overvåker xCelligence stasjon CD8 T-celle mediert død SKBR3 svulster i sanntid som en dråpe i celle indeksen.
Den impedans-baserte analysen påviser antigen-spesifikke T-celler
For å bestemme om reduksjoner i impedans på SKBR3, som er et HER-2/neu og HLA-A2 positiv brystkreft tumor cellelinje, ved HER-2/neu p369-spesifikke T-celler var antigenspesifikk, separate brønner inneholdende SKBR3 ble også inkubert med T-celler avledet fra et influensa (FLU)-spesifikke T-cellelinje. Influensa spesifikk-T-celler fungerte som en uspesifikk kontroll, å være HLA-A2 positive, men ikke har noen evne til å gjenkjenne HER-2/neu. Som vist i Figure 3, er det en betydelig forskjell mellom den lytisk aktivitet av HER-2/neu p369-spesifikke T-celler i forhold til FLU-spesifikke T-celler (p <0,0001). I noen tilfeller kan T-celler ikke spesifikk for tumor (f.eks FLU-spesifikk eller anti-CD3/anti-CD28 stimulert) viste en lav grad av lytisk aktivitet (figur 3A-B). T-celler kan drepe på én av to måter, enten ikke-spesifikt gjennom Fas: Fas ligand interaksjoner eller antigen-spesifikt gjennom utgivelsen av granzymes og perforins. For ytterligere å underbygge den oppfatningen at HER-2/neu-specific T-celler ble drept i en antigen-spesifikk måte, innlemmet vi en blokkerende antistoff til Fas-ligand. Som vist i figur 3B, hvor antistoffet ikke redusere den lytisk aktivitet av HER-2/neu p369-spesifikke T-celler. Antistoffet kan inhibere interaksjoner mellom Fas-og Fas-ligand, som vist med T-celler som var ikke-spesifikt aktivert med anti-CD3/CD28 perlene. Disse resultatene tyder på at nårtumor-spesifikke T-celler er testet med ikke-tumor-spesifikke T-celler, kan Fas ligand blokade være nødvendig for å redusere ikke-TCR-mediert interaksjoner til et minimum. Alternativt, ved bruk av kortvarige dyrkede T-celler linjer i hvilken bare en liten del av de T-celler er spesifikke for antigenet som brukes for ex vivo generering, kan muligheten for MHC mismatch-mediert T-celleaktivering forekomme som fører til ikke-spesifikk lysis. I dette tilfelle kan tilsetningen av antistoffer som blokkerer de irrelevante Hlas være berettiget. For å bestemme om de p369-spesifikke T-celler ble drepe tumorceller i en HLA klasse I avhengig måte, enten anti-HLA-klasse I-antistoff eller isotype kontroll-antistoff ble tilsatt til de ko-kulturer. Som vist i figur 3C, lysering av p369-spesifikke T-celler ble undertrykt ved inkludering av antistoff demonstrerte HLA klasse I begrensning. Til slutt, siden utviklingen av denne analysen ble i stor grad gjort ved hjelp SKBR3, var det viktig å finne ut om andre tilhenger HLA-A2 og HER-2/neu uttrykker kreftceller kan bli drept av p369-spesifikke T-celler. Således ble T-cellene fremstilt og tilsatt i et 01:05 forholdstall til HLA-A2 og HER-2/neu-expressing tumorceller, SKBR3, MCF-7, og HCC1419 celler. HLA-A2-negativ tumor cellelinje, ble BT20 brukt som en negativ kontroll. Som vist i figur 3D, alle av disse ytterligere tumorceller, bortsett BT20 døde også vurdert ved impedans. Således synes fremgangsmåten å være nyttig for flere mål adherente tumorceller.
Den impedans-baserte analysen er mer følsom enn den standard krom frigjøring assay for å påvise cytotoksisk T-celle aktivitet
Krom (51 Cr) utgivelsen analysen (CRA) som måler cytolytisk aktivitet har lenge vært gullstandarden ved å overvåke CD8 T-celle responser. I denne analysen blir målceller (f.eks tumorceller) merket med 51 Cr. I de fleste tilfeller kan friske målceller beholde mesteparten avradiomerke i løpet av analysen. CD8 T-celler tilsettes til målcellene, vanligvis ved varierende konsentrasjoner, og dreping av målcellene detekteres ved frigjøring av 51 Cr inn i mediet. Bortsett fra det faktum at den bruker farlig stråling, to store problemer med stati er en mangel på følsomhet, og at analysen krever vanligvis store mengder av CD8 T-celler, noe som begrenser dets nytte. For å avgjøre om impedans-baserte analysen var mer følsom enn de CRA, HER-2/neu p369-spesifikke T-celler ble generert in vitro og anvendt, i varierende mengder, på e-plater som inneholder umerkede kreftceller eller standard polypropylen plater som inneholder 51 Cr-merket målceller. Målinger, enten impedans eller gratis krom, ble målt til fem timer etter T-celle tillegg. Figur 4, et representativt eksempel, viser impedans analyse utkonkurrerer krom utgivelsen.
Den intra-assay variasjonav den impedans-baserte analysen er vanligvis under 20%.
Intra-assay variasjon ble undersøkt, ettersom større bruk av denne analysen blir i stor grad bestemt av dens reproduserbart og variasjon (figur 5). To p369-spesifikke T-cellelinjer ble generert uavhengig 30 dager fra hverandre og tilsettes i triplikat over et område av tumor celle til T-celle-forhold. Det innfelte grafen i Figur 5 viser at linjene var i stor grad tilsvarende i form av Lysing SKBR3 celler. Den% variasjonskoeffisienten ble beregnet ved hver celle-forhold og plottes. Som vist i figur 5, 01:40 til 01:05 forholdstall% variasjonskoeffisient (CV) var under 15%. På 1:2.5 og 1:1.25, men var CV'er høy eller uforutsigbar. På grunn av utstrakt biologisk variasjon, er det ikke mulig å måle inter-assay variabilitet med primære T-celle-linjer.
Figur 1. Impedans trenger å bli normalisert ved tilsetting av T-celler. Panel A: viser at kreftceller (rød linje) og ikke T-celler (blå linje) er ansvarlig for impedans. Vist er de impedans tracings over 40 timer for enten svulst eller T celler alene. Lignende resultater ble oppnådd fra et andre eksperiment. Merk at signalet perturbasjon på cirka 20 timer representerer punktet for tilsetning av T-celler til brønnene som ikke inneholder tumorceller Panel B:. Viser at impedansmålinger blir forbigående avbrytes ved tilsetning av T-celler til kreftceller. Dette krever vanligvis på et eller annet tidspunkt etter tilsetningen av T-celler (se punkt av normalisering markert på grafen). Spor er sammensatt fra repeterende datapunkt. Sporet for kreftceller alene er vist i rødt. De andre sporene representere kreftceller samtidig dyrket med HER-2/neu p369-spesifikke T-celler (Blå: ratio på 1,25 T celler / svulst celle, Green:ratio på 40 T-celler / svulst celle). Hver trase beregnes fra repeterende datapunkt samlet hvert 5. minutt gjennom varigheten av kulturen. Resultatene er representative for tre separate eksperimenter. Klikk her for å se større figur .
Figur 2. Reduksjon i impedans mediert av T-celler er doseavhengig. Panel A: Vist er de impedans spor av SKBR3 tumorceller inkubert alene eller med varierende konsentrasjoner av tumor-spesifikke T-celler. Hver trase beregnes fra triplikate datapunkter samlet hvert 5. minutt gjennom varigheten av kulturen. Resultatene er representative for tre separate eksperimenter Panel B:. Vises er cellen indeksene på 10 timer over hele T-celle / svulst celle konsentrasjoner. Den stiplede linje representerer den celle indeks for tumorceller alen. Hvert symbol er den gjennomsnittlige (± SEM) av tre eksemplarer bestemmelser. Resultatene er representative for tre separate eksperimenter. Klikk her for å se større figur .
Figur 3. Den impedans baserte analysen påviser antigen-spesifikke cytotoksiske T-celleresponser. Panel A viser nivået på lyse av SKBR3 celler ved HER-2/neu p369-spesifikke T-celler (Red) eller influensa-spesifikke T-celler (blå) på 5, 10, og 15 timer etter co-kultur. Hvert datapunkt er gjennomsnittet (± SEM) på triplikate målinger. Resultatene er representative for tre separate eksperimenter. Panel B viser lyse av SKBR3 av p369-spesifikke T-celler eller ikke-spesifikt aktiverte T-celler, viser at antigen-spesifikk lysis er ikke på grunn av Fas-Fas ligand interaksjoner. Svarte linjene representerer co-kulturer sominneholdt en Fas-ligand-antistoff. Hver søyle er den gjennomsnittlige (± SEM) lysis i triplikat ved 5 timer etter tilsetning av T-celler. Resultatene er representative for tre separate eksperimenter. Panel C viser lysis 10 timer etter T-celle tillegg av SKBR3 av p369-spesifikke T-celler er HLA-klasse I avhengige. Enten HLA-klasse I blokkering eller isotype kontroll ble lagt under co-kultur. Hver søyle er den gjennomsnittlige (± sem) lysis i tre eksemplarer. Dette forsøk ble gjentatt to ganger med lignende resultater. Panel D angir% lysering 10 timer etter T-celle tillegg av flere HLA-A2 +, HER-2/neu-expressing tumorcellelinjer med p369-spesifikke T-celler. BT20, ble en HLA-A2-negative brystkreft cellelinje brukt som en negativ kontroll. Hver flekk representerer et unikt eksperiment beregnet ut fra tre eksemplarer bestemmelser. Klikk her for å se større figur .
Figur 4. Den impedans baserte analysen er mer følsom enn den krom frigjøring assay for påvisning av tumor-antigen-spesifikke T-celler. Vist er% lyse av SKBR3 i respons til varierende konsentrasjoner av p369-spesifikke T-celler som målt ved 5 timer etter tumor-og T-celle blanding ved å bruke både impedans-baserte analysen og krom frigjøring analysen. Hvert symbol er den gjennomsnittlige (± SEM) av tre gjentak. Resultatene er representative for tre separate eksperimenter.
Figur 5. % Intra-assay koeffisienter av variasjon av impedans-baserte T-celle-cytotoksisitet. Assay er middelverdier (± SD)% Intra-assay variasjonskoeffisient til lysis av SKBR3 over et område av konsentrasjoner av antigen-spesifikke T-celler. Hvert symbol er gjennomsnittet av tre gjentak. Tallene som vises i grafen er tHan mener% CVer. Inset panelet viser bety (± sem, n = 3)% lysis av SKBR3, med varierende konsentrasjoner av p369-377-spesifikke T-celler. To uavhengig genererte p369-spesifikke T-cellelinjer med T-celler fra to separate givere er vist.
Discussion
CD8 T-celler er viktig for den adaptive immunrespons, være i stand til direkte å drepe infiserte eller ondartede celler 4.. Mens det er flere måter å måle antallet antigen-spesifikke CD8 T-celler (f.eks elispot, tetramer, flowcytometri), ofte er det nyttig å vite om disse cellene er funksjonelt cytotoksisk tre. Den mest gjenkjennelige analyse for å vurdere cytotoksisk funksjon er CRA, som regnes som gullstandarden analysen fire. Store begrensninger av CRA er (1) at kravet til radioaktivitet, (2) mangel på følsomhet, (3) mangel på mekanisk informasjon, (4) behov for store mengder av celler, og (5) arbeidskrevende oppstilling. Dermed løpet av det siste tiåret, har det vore interesse for å ta i bruk nye strategier for å minimalisere disse begrensningene. Nyere tilnærminger inkluderer de som måler caspase 4 utgivelsen, BLT esterase activity5, og overflate uttrykk av CD107 seks. Den nåværende manuskript antyder atimpedans-baserte assay, utført på Roche xCelligence-system, kan også være nyttig som et alternativ til cra. Evnen til å tilpasse impedans tilnærming hviler på observasjonen om at T-celler, som ikke holder seg tett til overflaten, ikke synes å ha mye innvirkning på impedans og dermed redusere noen bekymring for direkte innblanding av T-celler med målingen. Det arbeid som kreves for bruk av den impedans assaysystem ventes å være betydelig mindre primært på grunn av eliminering av de regulatoriske bekymringene for bruken av radioaktivitet. Den eneste betydelige ulempen av impedans-basert system er at en utlegget på $ 50.000 til $ 60000 er nødvendig for kjøp av xCelligence enhet. Imidlertid eliminerer xCelligence enhet behovet for en stråling teller og er langt mer allsidig, å være nyttige for å vurdere cellulær respons til narkotika og flytting i tillegg til T-celle-cytotoksisitet 8..
Observasjonene somden reduksjon i tumor celle impedans er doseavhengig, antyder som avbildet i figur 2, med en forholdsvis bratt skråning følge en enkel sekundær kvadratisk funksjon at analysen kan bli brukt i begrensende fortynning tester (LDAs) for å beregne hyppigheten av cytotoksiske celler 9 . En fordel med den impedans tilnærming er at antallet av T-celler og kreftceller som kreves er mindre enn den CRA, noe som gjør LDA potensielt mer gjennomførbare. For eksempel, i den cra, ved et 01:40-forhold, 1 x 10 5 tumor-celler per brønn er belagt som krever 4 x 10 6 totalt T-celler per brønn. Imidlertid, i den impedans-baserte analysen, er bare 1,5 x 10 4 tumor celler per brønn nødvendig, noe som forbruker bare 6 x 10 5 totalt T-celler per brønn. Således benytter den impedans-baserte analysen 85% færre T-celler og tumorceller. Denne reduksjonen antyder at den impedans-baserte systemet kan tilpasses til immunologisk overvåking i humane kliniske studier hvor than volumer av blodprøver kan begrenses. Også, mens CRA er begrenset til et enkelt tidspunkt, samler impedans-baserte analysen kontinuerlig real-time data, slik at brukeren kan sammenligne flere lysis tidspunkter på samme eksperimentet med minimal ekstra arbeidskraft og celler. Frekvens beregninger kan potensielt bli kombinert med andre strategier som ikke måler funksjon, for eksempel tetramer analyser for å etablere forholdet mellom funksjonelle cytotoksiske T-celler til totale antigen-spesifikke CD8 T-celler 10. En av de mest attraktive trekk ved den impedans tilnærming er at, i motsetning til de fleste andre analyser, kan cytotoksisiteten overvåkes i sanntid, potensielt gjøre det enklere å studere cellulære interaksjoner med bruk av inhibitorer eller antistoffer. En annen er at metoden kan være egnet for tumorceller som motstår merking. Til slutt, ettersom de ikke-drepte tumorceller ikke er merket og forblir steril, ytterligere avling og studium av de T-celle-resistente celler er possible.
I sammendrag, mens begge systemene gir tumor killing data i respons til spesifikke T-celler, er impedans-baserte analysen mer følsom enn den CRA og gir en mer fleksibel plattform.
Disclosures
Produksjon og gratis tilgang til denne video-artikkelen er sponset av Roche Diagnostics.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd til Keith L. Knutson fra Susan G. Komen for Cure Foundation og NIH / NCI 9R01 CA152045 og P50-CA116201.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | Used to isolate PBMCs from blood |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | Cell culture media |
| FBS | Denville Scientific | FB5001-H | Cell culture media |
| Human IL-2 | eBioscience | 14-8029-81 | For stimulating growth of T cells |
| Human Interferon gamma | Cell Sciences | CR2026 | For stimulating MHC expression in tumor cells |
| HER-2/neu p369-377 peptide | Mayo Clinic peptide synthesis core | amino acid sequence KIFGSLAFL | Binds to HLA-A2 |
| Influenza p58-66 peptide | Mayo Clinic peptide synthesis core | amino acid sequence GILGFVFTL | Binds to HLA-A2 |
| Human CD3/CD28 Dynabeads | Invitrogen | 111-61D | For non-specific T cell activation and expansion |
| Chromium-51 | MP Biomedicals | 62015 | CRA labeling reagent |
| E-plate |  Roche Group |
05469830001 | For xCelligence impedance unit |
| Luma plate 96 | PerkinElmer, Inc. | 6005630 | For measuring radioactivity in the Top Count NXT. |
| xCelligence RTCA DP Station | Roche Applied Science |
RTCA DP | Impedance unit |
| Top Count NXT | PerkinElmer, Inc. | C990601 | Scintillation & Luminescence Counter |
| Fas Ligand antibody | BD Biosciences | 556372 | For blocking Fas-Fas ligand interactions |
| HLA-A2 BB7.2 antibody | BD Biosciences | 551230 | For blocking HLA class I |
| Mouse IgG2b, κ | BD Biosciences | 555740 | Isotype control for HLA class I |
| SKBR3 tumor line | ATCC | HTB-30 | Adenocarcinoma |
| MCF7 tumor line | ATCC | HTB-22 | Adenocarcinoma |
| HCC1419 tumor line | ATCC | CRL-2326 | Primary ductal carcinoma |
| BT20 tumor line | ATCC | HTB-19 | Carcinoma |
References
- Zhang, N., Bevan, M. J. CD8(+) T cells: foot soldiers of the immune system. Immunity. 35, 161-168 (2011).
- Garboczi, D. N. Structure of the complex between human T-cell receptor, viral peptide and HLA-A2. Nature. 384, 134-141 (1996).
- Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. Laboratory analysis of T-cell immunity. Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).
- Andersen, M. H., Schrama, D., Thor Straten, P., Becker, J. C. Cytotoxic T cells. J. Invest. Dermatol. 126, 32-41 (2006).
- Weren, A., Bonnekoh, B., Schraven, B., Gollnick, H., Ambach, A. A novel flow cytometric assay focusing on perforin release mechanisms of cytotoxic T lymphocytes. J. Immunol. Methods. 289, 17-26 (2004).
- Aktas, E., Kucuksezer, U. C., Bilgic, S., Erten, G., Deniz, G. Relationship between CD107a expression and cytotoxic activity. Cell Immunol. 254, 149-154 (2009).
- Knutson, K. L., Schiffman, K., Disis, M. L. Immunization with a HER-2/neu helper peptide vaccine generates HER- 2/neu CD8 T-cell immunity in cancer patients. J. Clin. Invest. 107, 477-484 (2001).
- Asiedu, M. K., Ingle, J. N., Behrens, M. D., Radisky, D. C., Knutson, K. L. TGFbeta/TNF(alpha)-mediated epithelial-mesenchymal transition generates breast cancer stem cells with a claudin-low phenotype. Cancer Res. 71, 4707-4719 (2011).
- Strijbosch, L. W., Buurman, W. A., Does, R. J., Zinken, P. H., Groenewegen, G. Limiting dilution assays. Experimental design and statistical analysis. J. Immunol. Methods. 97, 133-140 (1987).
- Gallimore, A. Induction and exhaustion of lymphocytic choriomeningitis virus-specific cytotoxic T lymphocytes visualized using soluble tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complexes. J. Exp. Med. 187, 1383-1393 (1998).
