Summary
الإفراج مقايسة الكروم، فحص مشتركة للكشف عن نشاط الخلايا السامة للخلايا T، لديها العديد من القيود. باستخدام خلايا CD8 T محددة مستضد والخط ورم سرطان الثدي البشرية، SKBR3، في هذه المادة، تم فحص نهج قائم على مقاومة لقدرة الكشف عن خلية القتل.
Abstract
السامة للخلايا CD8 خلايا تي تشكل مجموعة فرعية من الخلايا T التي هي قادرة على إحداث وفاة المصاب أو خبيث الخلايا المضيفة 1. هذه الخلايا التعبير عن مستقبلات متخصصة، تسمى مستقبلات الخلايا التائية (TCR)، والتي يمكن التعرف على الببتيد مستضدي محددة ملزمة لفئة HLA الأول الجزيئات 2. إشراك الخلايا المصابة أو الخلايا السرطانية من خلال بهم HLA الصف الأول نتائج جزيء في إنتاج جزيئات التحللي مثل granzymes وperforin مما أدى إلى موت الخلايا المستهدفة. في حين أنه من المفيد لتحديد ترددات محددة مستضد الخلايا CD8 T باستخدام فحوصات مثل ELISPOT أو التدفق الخلوي، بل هو أيضا مفيدة للتأكد من قوة CD8 استجابات الخلايا التائية باستخدام المقايسات السمسة 3. الفحص الأكثر تميزا لتقييم وظيفة السامة للخلايا هو الفحص الإصدار الكروم (CRA)، الذي يعتبر الفحص القياسية 4. وCRA لديها العديد من القيود، بما في ذلك التعرض للخلايا للأشعة غاما، LACK من التكاثر، وشرطا لأعداد كبيرة من الخلايا. على مدى العقد الماضي، كان هناك اهتمام في تبني استراتيجيات جديدة للتغلب على هذه القيود. أحدث المناهج وتشمل تلك التي تقيس كاسباس الإصدار 4، BLT النشاط استريز 5 والتعبير سطح CD107 6. تم فحص مقايسة على أساس مقاومة، وذلك باستخدام نظام xCelligence روش، في هذه الورقة لقدرته كبديل لCRA. مقاومة أو معارضة لتيار كهربائي يحدث عندما ربط الخلايا السرطانية تمسكا وحات القطب. فصل الخلايا السرطانية بعد القتل ويتم تخفيض مقاومة الكهربائية التي يمكن قياسها من قبل نظام xCelligence. القدرة على التكيف مع النهج القائم على مقاومة لتقييم قتل الخلية بوساطة يرتكز على الملاحظة أن خلايا T لا تلتزم بإحكام على معظم الأسطح و لا يبدو أن يكون لها تأثير كبير على مقاومة مما يقلل أي قلق من التدخل المباشر للخلايا T معالقياس. تظهر النتائج أن الفحص القائم على مقاومة يمكن الكشف عن التغييرات في مستويات السامة للخلايا CD8 خلايا تي مستضد معين مع زيادة الحساسية بالنسبة إلى CRA القياسية. وبناء على هذه النتائج، قد يكون النهج القائم على مقاومة بدائل جيدة لكالات التصنيف الائتماني أو الطرق الأخرى التي تهدف إلى قياس السامة للخلايا CD8 وظيفة الخلايا التائية.
Protocol
1. جيل من الإنسان مستضد محددة CD8 خطوط الخلايا T-المدى القصير 7
- منفصلة خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (PBMCs) من الدم من المتبرعين إيجابية HLA-A2 صحية طبيعية باستخدام زائد Ficoll-paque.
- إضافة 2 مل / جيد من PBMCs إلى 6 لوحات جيدا في 2 × 10 6 خلية / مل.
- إضافة HER-2/neu HLA-A2-ملزم p369-377 الببتيد (الأحماض الأمينية تسلسل KIFGSLAFL) أو HLA-A2 ملزمة إنفلونزا P58-66 الببتيد (GILGFVFTL) مباشرة إلى آبار في تركيز النهائي من 10 ميكروغرام / مل ومكان في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ CO 2.
- للمساعدة في تحفيز وتوسيع الخلايا التائية، إضافة، كل 2 أيام، وسائل الإعلام 250 ميكرولتر / الطازجة جيدا تستكمل مع المؤتلف IL-2 الإنسان (المخزون: 50 وحدة / ميكرولتر) لتحقيق تركيز النهائي من 50 وحدة / مل في وسائل الإعلام الثقافة.
- إعادة تنشيط الخلايا ثقافة مع 2 × 10 6 خلية / مل PBMCs ذاتي المشع نابض لمدة 2 ساعة مع 10 ميكروغرام / مل من نفس الببتيدات استخدامد في الخطوة 1.3 وإضافة إلى هذه الخلايا الثقافات في 1 مل / جيد أسبوع واحد بعد أول التحفيز الببتيد.
- إضافة وسائط المؤتلف الإنسان IL-2 والعذبة، وكما هو موضح في الخطوة 1.4، في الثقافات القائمة كل يوم 2.
- إعادة تحفيز الخلايا مع PBMCs ذاتي الببتيد والمشع كما هو موضح في الخطوة 1.5 بعد أسبوع واحد التحفيز الببتيد الثاني.
- تحضير لاستخدام الخلايا بعد ستة أيام من إعادة تحفيز مشاركة في أقرب وقت ممكن.
2. إعداد خلايا سرطان الثدي
- ضع مقاومة محطة قياس xCelligence (محطة xCelligence) في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ CO 2.
- حصاد الخلايا السرطانية البشرية (SKBR3، BT20، MCF7 أو HCC1419) التي هي متكدسة 75٪ باستخدام 0.25٪ التربسين والطرد المركزي (1،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق).
- عد الخلايا السرطانية باستخدام عدادة الكريات وإعادة لهم في وسائل الإعلام ورم RPMI (تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 500 وحدة / ملالإنترفيرون جاما) بتركيز 7.5 × 10 3 ورم cells/100 ميكرولتر.
- برنامج البرنامج xCelligence بواسطة إعداد تخطيط الصفحة لتحديد تخطيط جيد وإعداد الصفحة الجدول الزمني لاتخاذ قراءات مقاومة كل 5 دقائق لمدة 40 ساعة. ل18 ساعة الأولى، سيقوم النظام xCelligence اتخاذ قراءات مقاومة للخلايا السرطانية فقط.
- إضافة 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام ورم RPMI إلى xCelligence لوحات E وتنفيذ خلفية القراءة عن طريق قياس مقاومة في غياب الخلايا.
- إضافة الخلايا السرطانية إلى لوحات E في 100 ميكرولتر لكل بئر ومكانته في محطة xCelligence.
- اضغط على زر البداية على البرنامج xCelligence للبدء في اتخاذ قراءات مقاومة الخلايا السرطانية، والتي تبدأ على الفور الانضمام إلى لوحات E.
3. شارك في ثقافة من ورم مع خلايا CD8 T
- مرة واحدة وقد أرفقت الخلايا السرطانية والضعف لتصل إلى 1.5 × 10 4 الخلايا السرطانية لكل بئر (يقارببعد 18 ساعة أثمرت عن كونها في البداية مطلي)، وخلايا T الحصاد أعدت في القسم 1 عن طريق كشط لطيف والانفعالات
- أجهزة الطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق وعد الخلايا T باستخدام عدادة الكريات وإعادة لهم في وسائل الإعلام RPMI مع FBS 10٪ في نسب مختلفة، بدءا من أقصى نسبة من 1 إلى 40 خلية ورم خلايا T وتمييع 2 أضعاف حتى نسبة يتم التوصل إلى 1 الخلية السرطانية إلى 1.25 خلايا تي. على سبيل المثال، هناك 1.5 × 10 4 الخلايا السرطانية لكل بئر. لتحقيق نسبة 01:40، إضافة 6 × 10 5 خلايا T لكل بئر وتمييع الخلايا T 2 أضعاف حتى نسبة 1.5 × 10 4 الخلايا السرطانية إلى 1.875 × 10 4 خلايا T لكل بئر (1:1.25 نسبة) ويتحقق.
- وقفة محطة xCelligence وإزالة لوحة E.
- إزالة وسائل الإعلام في الآبار مع الماصة وإضافة 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام وحدها أو نسبة مناسبة من الخلايا التائية إلى الآبار.
- ضع E-لوحة الظهر في محطة xCelligence ومواصلة الموالية البرمجيات xCelligenceغرام بحيث تؤخذ قراءات مقاومة كل 5 دقائق لحوالي 20 ساعة بعد إضافة خلية تي.
- تطبيع النتائج في نهاية الفحص.
4. الكروم النسخة فحص (CRA) 7
- اتبع الإجراءات المؤسسية السلامة من الإشعاع عند العمل مع 51 ساعة معتمدة و 51 الخلايا المستهدفة الكروم، المسمى. دائما استخدام التدريع المناسبة للحد من التعرض للإشعاع.
- نبض الخلايا السرطانية لمدة 2 ساعة في 1 × 10 6 خلايا الورم / مل مع 10 ميكرولتر / مل الطازجة 51 ساعة معتمدة (0.005 تسى / مل).
- غسل الخلايا السرطانية في 10 مل من وسائل الاعلام RPMI مع FBS 10٪ والطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. إضافة الخلايا السرطانية إلى A-96 لوحة جيدا جولة القاع في 1 × 10 5 الخلايا السرطانية في 100 ميكرولتر / جيد.
- إضافة خلايا T في نسب مختلفة، ابتداء من الساعة 1 الخلية السرطانية إلى خلايا T 40 وتمييع 2 أضعاف حتى نسبة 1 الخلايا السرطانية إلى خلايا T 1.25 يتحقق. على سبيل المثال، هناك 1 × 10 5 خلايا الورم لكل بئر. لتحقيق نسبة 01:40، إضافة 4 × 10 6 خلايا T لكل بئر وتمييع الخلايا T 2 أضعاف حتى نسبة 1 × 10 5 خلايا الورم إلى 1.25 × 10 5 خلايا T لكل بئر (1:1.25 نسبة) ويتحقق.
- إضافة عناصر تحكم عفوية الخلايا السرطانية والحد الأقصى إلى اللوحة. in order to حسبت الافراج عفوية من 51 ساعة معتمدة من الخلايا السرطانية، إضافة ست آبار تحتوي كل منها على 1 × 10 5 الخلايا السرطانية في 100 ميكرولتر إلى 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام RPMI مع FBS 10٪. لحساب أقصى الإفراج عن 51 ساعة معتمدة من الخلايا السرطانية، إضافة ست آبار تحتوي كل منها على 1 × 10 5 الخلايا السرطانية في 100 ميكرولتر إلى 100 ميكرولتر 0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني، والتي lyses جميع الخلايا.
- احتضان لوحات لمدة 5 ساعات عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ CO 2.
- بعد الحضانة، وإزالة 50 ميكرولتر من طاف من كل بئر وإضافته إلى لوحة لمى.
- تجف لوحات بين عشية وضحاها وقياس CPM باستخدام عداد غاما.
- فحص مقاومة: خذ القراءة مقاومة، كما ذكرت مؤشر الخلية (CI)، في نقاط زمنية مختلفة واستخدام الصيغة التالية لتحديد تحلل في المئة: (CI الورم فقط - (CI + ورم خلايا T)) / (CI الورم فقط) * 100.
- CRA: استخدام الصيغة التالية لتحديد تحلل في المئة: (CPM التجريبية - CPM عفوية) / (CPM الأقصى - CPM عفوية) * 100.
6. ممثل النتائج
خلايا T وحده لا زيادة مقاومة
خلايا T، بشكل عام، لا تلتزم معظم الأسطح الصلبة ولا تتطلب التزام للتنشيط والانتشار. ولذلك، كان الافتراض بأن خلايا T لا ينبغي أن تساهم في مقاومة على xCelligence لوحات E. لاختبار هذا، تم تحميل الآبار إما مع SKBR3 خلايا سرطان الثدي البشرية أو CD8 خلايا تي تنقيته حديثا. وقد تم قياس مقاومة على مدار 40 ساعة ومثال demonst ممثلويظهر تصنيف تأثير يذكر أساسا من خلايا T في الشكل 1A. في المقابل، يمكن القول أن الخلايا T قد يقلل مقاومة الخلفية، ولو قليلا فقط. وعلى الرغم من ذلك، كشفت شارك في ثقافة أن عملية إضافة خلايا T في 18 ساعة بعد بدء القياسات مقاومة أدت إلى تعطيل مقاومة (1B الشكل). وكشفت دراسات أخرى أن الاضطرابات كان من المقرر في جزء منه إلى التعامل مع منذ انتقاص في إشارة يمكن تخفيضه من خلال ضمان درجة حرارة T محلول يحتوي على خلية تم نفس المناطق الداخلية من الحاضنة.
تخفيضات في بوساطة مقاومة من قبل خلايا تي هي تعتمد على الجرعة.
الأداة المساعدة لفحص على أساس مقاومة لمقارنة عينات لالسامة للخلايا نشاط الخلايا T يتطلب القدرة على التمييز بين تركيزات مختلفة من الخلايا T مستضد محددة. لاختبار ما إذا كان هذا ممكنا، كانت خلايا SKBR3 شارك في تربيتها مع تركيزات متفاوتةستعقد من الخلايا T مستمدة من HER-2/neu p369 محددة خط الخلايا التائية. كما هو مبين في الشكل 2A، كانت التخفيضات في مقاومة تعتمد على جرعة من الخلايا التائية. يبين الشكل 2B أن مؤشرات الخلية في 10 ساعة تتبع بسيط متعدد الحدود من الدرجة الثانية أكثر من مجموعة من الخلايا التائية. وهكذا، فإن محطة xCelligence تراقب CD8 T موت الخلايا بوساطة من SKBR3 الأورام في الوقت الحقيقي كما انخفاضا في مؤشر الخلية.
الفحص القائم على مقاومة بالكشف عن الخلايا التائية مستضد محددة
لتحديد ما إذا كان، من قبل HER-2/neu كانت خلايا T-p369 محددة تخفيضات في مقاومة من SKBR3، الذي هو إيجابي سرطان خط الخلية السرطانية الثدي HER-2/neu وHLA-A2 مستضد وحضنت أيضا محددة، وآبار منفصلة تتضمن SKBR3 مع خلايا تي المستمد من الأنفلونزا (انفلونزا) محددة خط الخلايا التائية. خدم خلايا معينة-T FLU كعنصر تحكم غير محددة، ويجري HLA-A2 إيجابية، ولكن عدم وجود أي القدرة على التعرف على HER-2/neu. كما هو مبين في فايجوري 3، وهناك فرق كبير بين نشاط التحللي من HER-2/neu الخلايا التائية p369 محددة بالمقارنة مع خلايا T FLU محددة (P <0.0001). في بعض الحالات، خلايا T يست محددة للورم (حفز مثل الانفلونزا محددة أو anti-CD3/anti-CD28) أظهرت انخفاض مستوى النشاط التحللي (أرقام 3A-B). الخلايا التائية يمكن أن تقتل في واحدة من طريقتين، إما غير وجه التحديد من خلال فاس: التفاعلات يجند فاس أو مستضد على وجه التحديد من خلال الافراج عن granzymes وperforins. لمزيد من تأكيد فكرة أن خلايا T HER-2/neu-specific تم قتل بطريقة مستضد معين، ونحن دمج الأجسام المضادة لمنع فاس يجند. كما هو مبين في الشكل 3B، فإن الأجسام المضادة لا يقلل من نشاط التحللي من HER-2/neu الخلايا التائية p369 محددة. الأجسام المضادة يمكن أن يحول دون التفاعل بين فاس وفاس يجند، كما يتضح مع الخلايا T التي كانت تفعيلها غير تحديدا مع anti-CD3/CD28 الخرز. هذه النتائج تشير إلى أنه عندماويتم اختبار الخلايا T ورم محددة مع الخلايا التائية غير ورم محددة، قد تكون هناك حاجة إلى فاس الحصار يجند للحد من عدم TCR بوساطة التفاعلات إلى أدنى حد ممكن. بدلا من ذلك، عند استخدام خطوط الخلايا T مثقف قصيرة الأجل التي فقط جزء صغير من خلايا تي هي محددة لمستضد تستخدم لتوليد خارج الحي، يمكن أن تحدث في إمكانية عدم تطابق MHC بوساطة تنشيط الخلايا T التي تؤدي إلى تحلل غير محددة. في هذه الحالة، قد يكون له ما يبرره إضافة الأجسام المضادة التي تعمل على منع HLAs لا صلة لها بالموضوع. لتحديد ما إذا كانت الخلايا التائية p369 محددة كانت تقتل الخلايا السرطانية في فئة HLA I بطريقة تعتمد، إما مكافحة HLA-فئة أنا الضد أو نمط إسوي الضد تحكم تمت إضافتها إلى المشترك الثقافات. كما هو مبين في الشكل 3C، تحلل من قبل خلايا تي p369 محددة تم قمعها من قبل إدراج الضد مما يدل HLA الصف الأول تقييد. وأخيرا، منذ تطوير هذا الاختبار وقد تم إلى حد كبير باستخدام SKBR3، كان من المهم للتأكد مما إذا أخرى ملتصقة HLA-يمكن التعبير عن قتل الخلايا السرطانية A2 و HER-2/neu من قبل خلايا تي p369 محددة. وهكذا، تم إعداد الخلايا التائية، وأضاف في نسبة 01:05 لHLA-A2 والخلايا السرطانية HER-2/neu-expressing، SKBR3، MCF-7، وHCC1419 الخلايا. وHLA-A2 سلبية خط خلية الورم، وكان يستخدم كعنصر تحكم BT20 سلبية. كما هو مبين في الشكل 3D، كل هذه الخلايا السرطانية إضافية، إلا BT20 تم قتل أيضا وفقا لتقييم مقاومة. وبالتالي، فإن هذه الطريقة يبدو أنه مفيد لعدة خلايا الورم هدفا تمسكا.
الفحص القائم على مقاومة هو أكثر حساسية من الإفراج الكروم معيار فحص في الكشف عن النشاط السامة للخلايا T الخلية
كانت الكروم (51 ساعة معتمدة) بيان مقايسة (CRA) الذي يقيس النشاط لحل الخلايا طويلة معيار الذهب التي يمكن من خلالها رصد CD8 استجابات الخلايا التائية. في هذا الاختبار، وصفت الخلايا المستهدفة (مثل الخلايا السرطانية) مع 51 ساعة معتمدة. في معظم الحالات، يمكن أن الخلايا المستهدفة صحية الإبقاء على أغلبيةradiolabel على مدى الفحص. تضاف CD8 خلايا تي إلى الخلايا المستهدفة، وعادة بتركيزات متفاوتة، وقتل الخلايا المستهدفة تم الكشف عنها بواسطة الافراج عن 51 ساعة معتمدة في المتوسط. وبصرف النظر عن حقيقة أنه يستخدم الأشعة الخطرة، مشكلتين رئيسيتين مع CRA هي عدم وجود حساسية، وأن الفحص عادة ما يتطلب كميات كبيرة من الخلايا التائية CD8، مما يحد من فائدتها. لتحديد ما إذا كان الفحص القائم على مقاومة أكثر حساسية من تم إنشاؤها الخلايا T-p369 محددة CRA، HER-2/neu في المختبر، والتطبيقية، بكميات متفاوتة، إما إلى لوحات E التي تحتوي على الخلايا السرطانية الخالي من الملصقات أو لوحات البولي بروبلين القياسية التي تحتوي على 51 ساعة معتمدة المسمى الخلايا المستهدفة. تم قياس القياسات، إما مقاومة الكروم أو مجانا، على بعد 5 ساعات T بالإضافة الخلية. ويبين الشكل 4، مثال ممثل، وفحص مقاومة يتفوق الافراج الكروم.
الاختلاف داخل مقايسةللمقايسة القائم على مقاومة هو عادة أقل من 20٪.
تم فحص الاختلاف داخل مقايسة، منذ التوسع في استخدام هذا الاختبار سيحدد إلى حد كبير بتكاثر والاختلاف (الشكل 5). وقد تم توليد خطين p369 محددة الخلايا التائية بشكل مستقل 30 أيام على حدة، وأضاف في ثلاث نسخ أكثر من مجموعة من الخلايا السرطانية إلى نسب الخلايا التائية. ويبين الرسم البياني أقحم في الشكل 5 أن الخطوط كانت تعادل إلى حد كبير من حيث lysing SKBR3 الخلايا. تم حساب معامل٪ من التباين في نسبة كل خلية وخططوا. كما هو مبين في الشكل (5)، بين 1:40 و 1:05 النسب كانت معاملات٪ من التباين (CV) أقل من 15٪. في 1:2.5 و1:1.25، ومع ذلك، كانت السير الذاتية عالية أو لا يمكن التنبؤ بها. بسبب اختلاف بيولوجي واسع، فإنه من غير الممكن قياس التباين بين مقايسة مع خطوط الخلايا T الأولية.
الشكل 1. يحتاج مقاومة ليتم تطبيع بعد إضافة خلايا تي. لوحة A: يدل على أن الخلايا السرطانية (خط أحمر) وليس الخلايا التائية (الخط الأزرق) هي المسؤولة عن مقاومة. أظهرت هي اقتفاء أثر مقاومة على مدى 40 ساعة لخلايا الورم إما أو تي وحده. وتم الحصول على نتائج مماثلة من التجربة الثانية. علما بأن اضطراب إشارة إلى ما يقرب من 20 ساعة تمثل وجهة إضافة خلايا T إلى الآبار لا تحتوي على الخلايا السرطانية لوحة (ب): تبين أن قياسات مقاومة تتعطل عابر مع إضافة الخلايا التائية إلى الخلايا السرطانية. وهذا يتطلب التطبيع في بعض نقطة زمنية بعد إضافة خلايا T (انظر النقطة التطبيع ملحوظ في الرسم البياني). وتتكون آثار من نقاط البيانات المكررة. يظهر أثر للخلايا السرطانية وحدها في أحمر. آثار أخرى تمثل الخلايا السرطانية شارك في تربيتها مع HER-2/neu الخلايا التائية p369 محددة (الأزرق: نسبة 1.25 خلايا T / الخلية السرطانية، الأخضر:نسبة من 40 خلايا T / الخلية السرطانية). ويحسب كل أثر من نقاط البيانات المكررة التي تم جمعها كل 5 دقائق خلال فترة من الثقافة. النتائج هي ممثل من 3 تجارب منفصلة. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل 2. تخفيض في بوساطة مقاومة من قبل خلايا تي هي الجرعة التي تعتمد. لوحة A: ظاهر هي آثار مقاومة الخلايا السرطانية من SKBR3 حضنت وحدها أو مع وجود تركيزات من الخلايا T ورم محددة متفاوتة. ويحسب كل أثر من نقاط البيانات التي تم جمعها ثلاث نسخ كل 5 دقائق خلال فترة من الثقافة. النتائج هي ممثل من 3 تجارب منفصلة لوحة B:. المعروضة هي مؤشرات الخلية في 10 ساعة عبر كل خلية / ورم تركيزات الخلايا التائية. خط متقطع يمثل مؤشر الخلية عن الخلايا السرطانية آلواحد. كل رمز هو يعني (± SEM) من ثلاث نسخ التحديدات. النتائج هي ممثل من 3 تجارب منفصلة. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل (3). فحص مقاومة القائم بالكشف السامة للخلايا استجابات محددة مستضد الخلايا التائية. لوحة ويظهر مستوى من تحلل من SKBR3 الخلايا عن طريق خلايا T HER-2/neu p369 محددة (الأحمر) أو الخلايا FLU محددة T (الأزرق) في 5 و 10 و 15 ساعة بعد ثقافة مشتركة. كل نقطة البيانات هي متوسط (± SEM) من قياسات ثلاث نسخ. النتائج هي ممثل من 3 تجارب منفصلة. لوحة B يظهر تحلل من SKBR3 من قبل خلايا تي p369 محددة أو تنشيط خلايا تي غير وجه التحديد، مما يدل على أن تحلل مستضد معين لا يعود إلى تفاعلات يجند فاس-فاس. تمثل أشرطة سوداء المشترك الثقافات التييحتوي على الأجسام المضادة يجند فاس. كل شريط هو يعني تحلل (± SEM) في ثلاث نسخ في 5 ساعات بعد إضافة خلايا تي. النتائج هي ممثل من 3 تجارب منفصلة. لوحة C يظهر تحلل بعد 10 ساعة T بالإضافة خلية من خلايا T SKBR3 بواسطة p369 محددة هي HLA-فئة أنا التابعة. وأضيف إما HLA-فئة أنا حجب أو مراقبة نمط إسوي خلال ثقافة مشتركة. كل شريط هو يعني تحلل (± SEM) في ثلاث نسخ. وتكررت هذه التجربة مرتين مع نتائج مماثلة. لوحة D يظهر تحلل٪ بعد 10 ساعة T بالإضافة خلية من عدة HLA-A2 +، HER-2/neu-expressing خطوط الخلايا السرطانية عن طريق الخلايا التائية p369 محددة. BT20، تم استخدام خط خلية سرطان الثدي HLA-A2-سلبية كعنصر تحكم سلبية. يمثل كل بقعة تجربة فريدة من نوعها تحسب من قرارات ثلاث نسخ. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل 4. الفحص القائم على مقاومة هو أكثر حساسية من الإفراج مقايسة الكروم للكشف عن خلايا T مستضد محددة الورم. أظهرت هي تحلل٪ من SKBR3 ردا على تركيزات الخلايا التائية p369 محددة متفاوتة كما تم قياسها في 5 ساعات بعد الورم والخلايا التائية خلط باستخدام كل من مقايسة على أساس مقاومة وإطلاق سراح مقايسة الكروم. كل رمز هو يعني (± SEM) من ثلاث مكررات. النتائج هي ممثل من 3 تجارب منفصلة.
الشكل 5. ٪ معاملات داخل فحص التباين للخلية T-المستندة إلى مقاومة مقايسة السمسة. أظهرت هي متوسط (± SD)٪ معاملات داخل فحص التباين في تحلل من SKBR3 على مجموعة من تركيزات من خلايا T مستضد محددة. كل رمز هو يعني من ثلاث مكررات. أرقام مبين في الرسم البياني هي رانه يعني السير الذاتية٪. تظهر لوحة أقحم يعني (± SEM، ن = 3) تحلل٪ من SKBR3، في تركيزات الخلايا التائية p369-377-محددة متفاوتة. وترد اثنين من خطوط الخلايا T-p369 محددة ولدت بشكل مستقل باستخدام خلايا T من اثنين من المانحين منفصلة.
Discussion
CD8 خلايا تي هي مهمة للاستجابة المناعية التكيفية، أن تكون قادرة على قتل الخلايا المصابة مباشرة أو خبيثة 4. في حين أن هناك عدة طرق لقياس أعداد CD8 خلايا تي مستضد محددة (على سبيل المثال ELISPOT، tetramer، التدفق الخلوي)، غالبا ما يكون من المفيد أن نعرف ما إذا كانت هذه الخلايا هي السامة للخلايا وظيفيا 3. الفحص الأكثر تميزا لتقييم وظيفة السامة للخلايا هو CRA، التي تعتبر المعيار الذهبي فحص 4. القيود الرئيسية للCRA هي (1) شرط من النشاط الإشعاعي، (2) عدم وجود حساسية، (3) عدم وجود معلومات الآلي، (4) الحاجة إلى كميات كبيرة من خلايا، و (5) مجموعة شاقة تصل. وهكذا، على مدى العقد الماضي، كان هناك اهتمام في تبني استراتيجيات جديدة للحد من هذه القيود. أحدث المناهج وتشمل تلك التي تقيس كاسباس الإصدار 4، BLT استريز activity5، والتعبير سطح CD107 6. يوحي هذا المخطوط أنمقايسة على أساس مقاومة، التي تجرى على نظام xCelligence روش، قد يكون من المفيد كبديل لCRA أيضا. القدرة على التكيف مع النهج القائم على مقاومة تقوم على ملاحظة أن الخلايا التائية، التي لا تلتزم بإحكام على السطوح، لا يبدو أن يكون لها تأثير كبير على مقاومة مما يقلل أي قلق من التدخل المباشر للخلايا T مع القياس. ومن المتوقع أن تكون أقل بكثير في المقام الأول بسبب القضاء على المخاوف التنظيمية لاستخدام النشاط الإشعاعي العمالة اللازمة لاستخدام نظام الفحص مقاومة. والعيب الوحيد الملحوظ من النظام القائم على مقاومة هو أن انفاق 50000 $ إلى 60،000 دولار مطلوب للشراء وحدة xCelligence. ومع ذلك، فإن وحدة xCelligence يلغي الحاجة لمكافحة الإشعاع وأكثر تنوعا، كونها مفيدة لتقييم استجابة الخلايا الى المخدرات والهجرة بالإضافة إلى T السمية لخلايا 8.
الملاحظات التيهذا التقليص في مقاومة الخلايا السرطانية هي تعتمد على الجرعة، كما هو مبين في الشكل 2، مع منحدر حاد معقول بعد وظيفة بسيطة من الدرجة الثانية الثانوية تشير إلى أن مقايسة يمكن استخدامها في الحد من المقايسات تخفيف (LDAs) لتقدير تردد من الخلايا السامة للخلايا 9 . ميزة واحدة مع النهج القائم على مقاومة هو أن عدد الخلايا T والخلايا السرطانية المطلوب هو أقل من CRA، مما يجعل LDA يحتمل أكثر جدوى. على سبيل المثال، في CRA، في نسبة 1:40، 1 × 10 5 الخلايا السرطانية لكل بئر ومطلي الذي يتطلب 4 × 10 6 خلايا T المشاركات لكل بئر. ومع ذلك، في مقايسة على أساس مقاومة، وهناك حاجة فقط 1.5 × 10 4 الخلايا السرطانية لكل بئر، والذي يستهلك فقط 6 × 10 5 مجموع الخلايا التائية لكل بئر. وهكذا، يستخدم الفحص القائم على مقاومة الخلايا T 85٪ أقل والخلايا السرطانية. يشير هذا الانخفاض إلى أن النظام القائم على مقاومة يمكن تكييفها لرصد المناعية في تجارب اكلينيكية على البشر حيث tكان حجم الدم تلفت قد تكون محدودة. أيضا، بينما هو CRA يقتصر على نقطة مرة واحدة، ومقايسة على أساس مقاومة بجمع البيانات في الوقت الحقيقي المستمر، مما يتيح للمستخدم لمقارنة عدة نقاط وقت تحلل على نفس التجربة مع الحد الأدنى من العمل وخلايا إضافية. يحتمل أن تكون مجتمعة الحسابات تردد مع الاستراتيجيات الأخرى التي لا قياس وظيفة مثل التحليلات tetramer لإقامة نسبة الخلايا التائية السامة للخلايا وظيفية إلى مجموع مستضد محددة CD8 خلايا T 10. واحدة من السمات الأكثر جاذبية من النهج القائم على مقاومة هو أنه، وخلافا لمعظم فحوصات أخرى، السمسة يمكن رصدها في الوقت الحقيقي، ويحتمل أن تكون مما يجعل من الاسهل لدراسة التفاعلات الخلوية مع استخدام مثبطات أو الأجسام المضادة. آخر هو أن الطريقة قد تكون مناسبة لالخلايا السرطانية التي تقاوم وضع العلامات. وأخيرا، منذ الخلايا السرطانية غير قتل لا وصفت وتبقى عقيمة، مزيد من الحصاد ودراسة الخلايا مقاومة للخلية T هو وقت possibجنيه.
في ملخص، في حين توفر كلا النظامين قتل البيانات ورم في استجابة لخلايا T معينة، الفحص القائم على مقاومة هو أكثر حساسية من CRA وتوفر منصة أكثر مرونة.
Disclosures
وترعى الإنتاج وحرية الوصول من هذا الفيديو المادة من قبل شركة روش تشخيص.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة إلى كيث L. كنوتسون من سوزان جي كومن من أجل العلاج ومؤسسة المعاهد الوطنية للصحة / NCI 9R01 CA152045 P50-CA116201 و.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | Used to isolate PBMCs from blood |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | Cell culture media |
| FBS | Denville Scientific | FB5001-H | Cell culture media |
| Human IL-2 | eBioscience | 14-8029-81 | For stimulating growth of T cells |
| Human Interferon gamma | Cell Sciences | CR2026 | For stimulating MHC expression in tumor cells |
| HER-2/neu p369-377 peptide | Mayo Clinic peptide synthesis core | amino acid sequence KIFGSLAFL | Binds to HLA-A2 |
| Influenza p58-66 peptide | Mayo Clinic peptide synthesis core | amino acid sequence GILGFVFTL | Binds to HLA-A2 |
| Human CD3/CD28 Dynabeads | Invitrogen | 111-61D | For non-specific T cell activation and expansion |
| Chromium-51 | MP Biomedicals | 62015 | CRA labeling reagent |
| E-plate |  Roche Group |
05469830001 | For xCelligence impedance unit |
| Luma plate 96 | PerkinElmer, Inc. | 6005630 | For measuring radioactivity in the Top Count NXT. |
| xCelligence RTCA DP Station | Roche Applied Science |
RTCA DP | Impedance unit |
| Top Count NXT | PerkinElmer, Inc. | C990601 | Scintillation & Luminescence Counter |
| Fas Ligand antibody | BD Biosciences | 556372 | For blocking Fas-Fas ligand interactions |
| HLA-A2 BB7.2 antibody | BD Biosciences | 551230 | For blocking HLA class I |
| Mouse IgG2b, κ | BD Biosciences | 555740 | Isotype control for HLA class I |
| SKBR3 tumor line | ATCC | HTB-30 | Adenocarcinoma |
| MCF7 tumor line | ATCC | HTB-22 | Adenocarcinoma |
| HCC1419 tumor line | ATCC | CRL-2326 | Primary ductal carcinoma |
| BT20 tumor line | ATCC | HTB-19 | Carcinoma |
References
- Zhang, N., Bevan, M. J. CD8(+) T cells: foot soldiers of the immune system. Immunity. 35, 161-168 (2011).
- Garboczi, D. N. Structure of the complex between human T-cell receptor, viral peptide and HLA-A2. Nature. 384, 134-141 (1996).
- Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. Laboratory analysis of T-cell immunity. Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).
- Andersen, M. H., Schrama, D., Thor Straten, P., Becker, J. C. Cytotoxic T cells. J. Invest. Dermatol. 126, 32-41 (2006).
- Weren, A., Bonnekoh, B., Schraven, B., Gollnick, H., Ambach, A. A novel flow cytometric assay focusing on perforin release mechanisms of cytotoxic T lymphocytes. J. Immunol. Methods. 289, 17-26 (2004).
- Aktas, E., Kucuksezer, U. C., Bilgic, S., Erten, G., Deniz, G. Relationship between CD107a expression and cytotoxic activity. Cell Immunol. 254, 149-154 (2009).
- Knutson, K. L., Schiffman, K., Disis, M. L. Immunization with a HER-2/neu helper peptide vaccine generates HER- 2/neu CD8 T-cell immunity in cancer patients. J. Clin. Invest. 107, 477-484 (2001).
- Asiedu, M. K., Ingle, J. N., Behrens, M. D., Radisky, D. C., Knutson, K. L. TGFbeta/TNF(alpha)-mediated epithelial-mesenchymal transition generates breast cancer stem cells with a claudin-low phenotype. Cancer Res. 71, 4707-4719 (2011).
- Strijbosch, L. W., Buurman, W. A., Does, R. J., Zinken, P. H., Groenewegen, G. Limiting dilution assays. Experimental design and statistical analysis. J. Immunol. Methods. 97, 133-140 (1987).
- Gallimore, A. Induction and exhaustion of lymphocytic choriomeningitis virus-specific cytotoxic T lymphocytes visualized using soluble tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complexes. J. Exp. Med. 187, 1383-1393 (1998).
