Summary
Midbrain dopamine प्रणाली और striatum से explants के लिए एक कोलेजन मैट्रिक्स परख में उपयोग किया जाता है
Abstract
Midbrain dopamine (mdDA) औसत दर्जे का अग्रमस्तिष्क बंडल telencephalon में striatum एक सहित कई क्षेत्रों की ओर न्यूरॉन्स परियोजना के माध्यम से. आपस में, striatum में मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स कि striatonigral मार्ग (सीधा) को जन्म दे substantia nigra अंदर आना 2. इन इलाकों के अक्षतंतु विकास अक्षतंतु विकास और neurites द्वारा या लक्ष्य (मध्यवर्ती) 3,4 क्षेत्रों के द्वारा जारी कर रहे हैं अणुओं है कि सहित मार्गदर्शन संकेत के एक बहुतायत के मिश्रित कार्रवाई पर निर्भर है. ये घुलनशील कारकों संवर्धन mdDA और / या कोलेजन मैट्रिक्स है जो बाह्य वातावरण की नकल उतार axons के लिए एक तीन आयामी प्रदान करता है सब्सट्रेट में striatal explants द्वारा इन विट्रो में अध्ययन किया जा सकता है. इसके अलावा, कोलेजन मैट्रिक्स अन्य explants या आसपास 5 संदर्भ और 6 (उदाहरण देखें) में रखा कोशिकाओं द्वारा जारी प्रोटीन की अपेक्षाकृत स्थिर ढ़ाल के गठन के लिए अनुमति देता है. यहाँ हम पुर के लिए तरीके का वर्णनचूहे की पूंछ कोलेजन, डोपामिनर्जिक और striatal explants के के microdissection कोलेजन जैल और बाद immunohistochemical और मात्रात्मक विश्लेषण में, उनकी संस्कृति की ification. सबसे पहले, E14.5 माउस भ्रूण के दिमाग अलग और डोपामिनर्जिक हैं और striatal explants microdissected हैं. इन explants तो (सह) coverslips पर कोलेजन जैल में इन विट्रो में 48 से 72 घंटे के लिए सुसंस्कृत. इसके बाद, अक्षतंतु संबंधी अनुमानों neuronal मार्कर (जैसे tyrosine hydroxylase, DARPP32, या βIII ट्यूबिलिन) और अक्षतंतु विकास और आकर्षक या प्रतिकारक अक्षतंतु प्रतिक्रियाओं की मात्रा निर्धारित कर रहे हैं का उपयोग कर कल्पना की जाती है. इस neuronal तैयारी के लिए mesostriatal और striatonigral अक्षतंतु विकास और विकास के दौरान मार्गदर्शन के सेलुलर और आणविक तंत्र की इन विट्रो अध्ययन में एक उपयोगी उपकरण है. इस परख का उपयोग करना, यह भी डोपामिनर्जिक और striatal axons के लिए अन्य (मध्यवर्ती) लक्ष्य का आकलन करने के लिए संभव है या विशिष्ट आणविक संकेत परीक्षण.
Protocol
1. चूहा पूँछ कोलेजन की तैयारी
- 6-10 वयस्क चूहे की पूंछ (यह संभव है करने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर इस्तेमाल जब तक पूंछ की दुकान) ले लीजिए.
- 95% इथेनॉल में पूंछ कमरे के तापमान (आर टी) में रात भर लेना.
चूहे की पूंछ के विच्छेदन (टिशू कल्चर हुड में):
(70% इथेनॉल में उपकरण रखने के लिए जब उन्हें प्रयोग नहीं है और यह सुनिश्चित करें कि सभी समाधान उपकरण, कांच के बने पदार्थ और इस प्रक्रिया के दौरान इस्तेमाल किया बाँझ हैं)
- पूंछ से इकट्ठा, tendons, पूंछ की नोक में कटौती. संदंश की एक जोड़ी के साथ पूंछ के बड़े अंत पकड़ो. संदंश की एक और जोड़ी का उपयोग करने के लिए पकड़, मोड़ और अन्य संदंश के पास पूंछ तोड़ने के. अलग खींच और tendons के पीछे छोड़ दिया जाएगा (चित्र 1 ए, बी).
- बाँझ एच 2 हे, tendons लीजिए और सभी tendons के संग्रह के बाद बाँझ एच 2 ओ के साथ एक नया petridish के लिए उन्हें ले जाने के
- 2-3, tendons ले लो और उन्हें टुकड़ा के लिए 2 जोड़ी का उपयोगबाँझ एच 2 ओ के साथ एक नया petridish में ceps नसों (चित्र 1C कण्डरा ऊतक चमकदार और चिंतनशील है) जैसे गैर कण्डरा ऊतक निकालें. सभी गैर कण्डरा ऊतक को हटाने के बाद, प्रत्येक पूंछ tendons की लगभग 100-150 मिलीग्राम पैदावार.
- बाँझ 3% एसिटिक एसिड की 300 मिलीलीटर के लिए tendons, स्थानांतरण और 4 बजे धीरे - धीरे रातोंरात हलचल डिग्री सेल्सियस
- बाँझ 3% एसिटिक एसिड की एक अतिरिक्त 200 मिलीलीटर जोड़ें और 4 बजे धीरे - धीरे रातोंरात हलचल डिग्री सेल्सियस
- एसिटिक एसिड ~ 2700 XG में 4 पर 120 मिनट के लिए, tendons युक्त समाधान अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस गोली गैर भंग tendons और गैर - कण्डरा ऊतक.
- Centrifugation दौरान डायलिसिस टयूबिंग तैयार:
- 40 सेमी के टुकड़ों में कटौती
- 5 मिनट के लिए 500 माइक्रोन EDTA में उबाल
- बाँझ एच 2 हे में शांत
- डायलिसिस टयूबिंग की एक छोर पर एक गाँठ बाँध और टिशू कल्चर हुड में बर्फ पर Centrifuged पट्टा समाधान की सतह पर तैरनेवाला के साथ टयूबिंग भर एक स्वचालित pipett का उपयोग करई और एक 25 मिलीलीटर विंदुक. बुलबुले के उत्पादन से बचें. गाँठ और बर्फ पर बाँझ एल्यूमीनियम पन्नी पर टयूबिंग टयूबिंग की दुकान के दूसरे छोर तक टयूबिंग की सभी टुकड़ों (चित्रा -1) भर रहे हैं.
- ऊतक संस्कृति हुड में 10 बाँझ 0.1X सदस्य, पीएच 4.0, मैं तैयार. टयूबिंग के टुकड़े के लिए सामयिक मज़दूर जोड़ें और पूर्व ठंडा एक 10 एल बीकर के में 0.1X सदस्य के समाधान के लिए इन जोड़ने. 4 में रातोंरात Dialyze डिग्री सेल्सियस, जबकि धीरे धीरे आलोड़न. यह डायलिसिस अतिरिक्त एसिड को हटा जबकि पीएच कम रखने.
- नई ठंडा पूर्व 10 एल 0.1X सदस्य के साथ बदलें और 4 में रात हलचल डिग्री सेल्सियस
- नई ठंडा पूर्व 10 एल 0.1X सदस्य के साथ जगह से पिछले चरण दोहराएँ और 4 में रात हलचल डिग्री सेल्सियस
- अशेष भाजक बाँझ 50 मिलीलीटर ट्यूब में कोलेजन समाधान. डिग्री सेल्सियस 4 में स्टोर aliquots 6-12 महीने रखें, केवल ऊतक संस्कृति हुड में कोलेजन स्टॉक संभाल.
- यह परीक्षण है कि क्या शुद्ध कोलेजन (0.1x सदस्य) पतला होना चाहिए के कोलेजन matr में इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैनौ परख. इसलिए, एक कोलेजन कमजोर पड़ने श्रृंखला उत्पन्न (undiluted कोलेजन, 1:1, 1:02 और 1:05 पतला) और मैट्रिक्स कोलेजन assays के प्रदर्शन के रूप में नीचे वर्णित करने के लिए इष्टतम कोलेजन कमजोर पड़ने निर्धारित.
2. डोपामिनर्जिक 7,8 midbrain के विच्छेदन
- मां के गर्भाशय से E14.5 माउस भ्रूण काटना और बर्फ पर l15 के मध्यम में रखने की जरूरत तक.
सभी बाद विच्छेदन कदम बर्फ पर l15 मध्यम में प्रदर्शन कर रहे हैं.
- बाहर मस्तिष्क काटना.
- निकालें प्रत्येक telencephalic पुटिका (striatal explants लिए telencephalic vesicles का उपयोग करें) की औसत दर्जे का हिस्सा साथ काटने के द्वारा telencephalon.
- तानिका संबंधी म्यान निकालें.
- एक dorsoventral कटौती सिर्फ mesencephalic वंक की विजय - स्तम्भ.
- बनाओ बस mesencephalic वंक की दुम का एक और dorsoventral कटौती.
- पृष्ठीय midline के साथ एक rostrocaudal कटौती एक microdissectio का उपयोग करेंn अंतर्निहित उदर मध्यमस्तिष्क ऊतक का पर्दाफाश चाकू. उदर मध्यमस्तिष्क ऊतक हिट नहीं के रूप में यह डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स (चित्रा 2) में शामिल करने के लिए सावधान रहें.
- दो rostrocaudal कटौती पार्श्व और उदर के लिए से पृष्ठीय मध्यमस्तिष्क ऊतक को हटाने के midline के समानांतर है.
- शेष उदर मध्यमस्तिष्क ऊतक explants microdissection चाकू का उपयोग में विभाजित करते हैं.
- L15 का उपयोग करें जब तक बर्फ पर 5% FBS युक्त मध्यम में explants स्टोर.
3. Striatum के विच्छेदन
सभी विच्छेदन कदम बर्फ पर l15 मध्यम में प्रदर्शन कर रहे हैं.
- Telencephalic मध्यमस्तिष्क विच्छेदन के दौरान विच्छेदित vesicles का उपयोग करें.
- चेतक और striatum संदंश का उपयोग कर के बीच में काटने के द्वारा चेतक निकालें.
- एक mediolateral कटौती striatum विजय - स्तम्भ घ्राण बल्ब के रूप में विजय - स्तम्भ संरचनाओं को हटाने बनाओ. , Striatum करने के लिए दुमदारी से स्थित ऊतक के लिए यह कदम दोहराएँ.
- स्थितिशेष striatum के राज्याभिषेक दृश्य प्राप्त टुकड़ा (चित्रा 2).
- striatum ऊतक के एक से थोड़ा कम घना और अधिक पारदर्शी हिस्से के रूप में पहचाना जा सकता है. बाहर explants एक microdissection चाकू का इस्तेमाल करते हैं में striatum और कटौती टुकड़े करना. थोड़ा गहरा ऊतक midline के करीब है, जो पार्श्व और औसत दर्जे का ganglionic श्रेष्ठता का पलायन न्यूरॉन्स होते हैं से बचें.
- L15 का उपयोग करें जब तक बर्फ पर 5% FBS युक्त मध्यम में explants स्टोर.
4. विधानसभा कोलेजन मैट्रिक्स Assays
कोलेजन की तैयारी (बर्फ पर सभी कदम, विंदुक युक्तियाँ ठंडा का उपयोग करें)
- 100 10x सदस्य की μl और 1M सोडियम बिकारबोनिट का 40 μl (3 NaHCO) के साथ मिश्रण पतला कोलेजन की 860 μl और बर्फ पर रहते हैं. यदि इस बिंदु पर में कोलेजन ऊपर warms यह जमना.
- एक coverslip के लिए एक 4 अच्छी तरह से Nunc पकवान की एक अच्छी तरह से तैयार कोलेजन के 20 μl की एक बूंद (व्यास में लगभग 5 मिमी) में जोड़ेंऔर यह 37 पर एक सीओ 2 इनक्यूबेटर में खड़े डिग्री सेल्सियस और 30 मिनट (परिवेश हे 2 एकाग्रता के लिए पर्याप्त है) के लिए 5% सीओ 2. इस ऊष्मायन के दौरान कोलेजन सरेस लगाना होगा.
कोलेजन जेल में सेटअप सह संस्कृति
- के बाद कोलेजन gelatinized है, एक 200 μl टिप के साथ एक विंदुक उपयोग कोलेजन डोपामिनर्जिक या striatal explant हस्तांतरण.
- एक दूसरे के करीब निकटता एक सुई का उपयोग में explants हटो. उन्हें लगभग एक explant (~ 200-300 माइक्रोन) (चित्रा 2) के व्यास की दूरी पर अलग रखें.
- अतिरिक्त मध्यम निकालें और explants के शीर्ष पर तैयार कोलेजन के 20 μl जोड़ें. इस बार explants चारों ओर स्थानांतरित करने के लिए कारण होगा. एक सुई का उपयोग कर 4.4 में वर्णित के रूप में explants स्थान.
- कोलेजन आरटी पर 15 मिनट के लिए जमना 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में 30 मिनट के द्वारा पीछा किया.
- कोलेजन के बाद की स्थापना की है, ई के 400 μl जोड़नेxplant मध्यम और सीओ 2 इनक्यूबेटर में 2-3 दिनों के लिए विकसित 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.
5. Immunohistochemistry और मात्रा द्वारा विश्लेषण
विशेष तकनीक द्वारा ऊतकों में विशिष्ट एन्टिजनों का प्रदर्शन
- Explants को ठीक करने के लिए, धीरे पीबीएस में माध्यम की 400 μl (जिससे 4% पीएफए गिराए) 8% paraformaldehyde के 400 μl (पीएफए) और जोड़ने के आरटी में 1 घंटे के लिए खड़े हो जाओ.
- आर टी में पीबीएस में 3x 15 मिनट के धो लें.
- बफर अवरुद्ध में सेते हैं (बी बी, पीबीएस + 1% FBS + 0.1% एक्स 100 ट्राइटन) 2 घंटे के लिए.
- बी बी में प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं के लिए डोपामिनर्जिक axons striatal. विरोधी DARPP32 एंटीबॉडी (1:500) 9 के axons के लिए और सभी विरोधी βIII (1:3000) में ट्यूबिलिन 7 axons दृश्यमान करने के लिए विरोधी tyrosine hydroxylase (1:1000) एंटीबॉडी 7, का उपयोग करें.
- पीबीएस में आरटी पर 5x 1 घंटा धो लें.
- बी बी (1:500) में उचित fluorophore संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ रात भर सेते हैं 4 बजेडिग्री सेल्सियस इस कदम से explants के जोखिम को कम प्रकाश के लिए (जैसे उन्हें एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर).
- पीबीएस में 4 बजे रात धो डिग्री सेल्सियस अगले दिन के दौरान कई washes के द्वारा पीछा किया.
- माइक्रोस्कोप पर explants माउंट का उपयोग कर स्लाइड Antifade अभिकर्मक मध्यम बढ़ते लम्बा. एक गिलास खुर्दबीन स्लाइड पर ~ 10 μl की एक बूंद जोड़ें. Coverslip ले लो और धीरे explant नीचे का सामना करना पड़ की ओर से बढ़ते मध्यम के ड्रॉप पर यह जगह. डे coverslip के तहत किसी भी हवा फँसाने बहुत धीरे से बढ़ते मध्यम के ड्रॉप पर कम से बचें.
पी / डी अनुपात की गणना की मात्रा का ठहराव
- एक epifluorescence खुर्दबीन (चित्रा 3) का उपयोग explants के डिजिटल छवियों मोल.
- इन छवियों का उपयोग करना, quadrants में प्रत्येक explant विभाजित करने के लिए एक प्रॉक्सिमल (निकटतम आसन्न explant explant का हिस्सा यानी) वृत्त का चतुर्थ भाग और बाहर (वृत्त का चतुर्थ भाग आसन्न expla से दूर दूर explant का हिस्सा उत्पन्नNT) (चित्रा 2, 4).
- 20 सबसे लंबे समय तक प्रॉक्सिमल और बाहर दोनों quadrants में explant से उभरते neurites की लंबाई को मापने के.
- 20 सबसे लंबे समय तक neurites की औसत लंबाई का उपयोग करने के लिए प्रत्येक व्यक्ति explant के लिए पी / डी अनुपात की गणना. एपी / डी अनुपात> 1 अक्षतंतु आकर्षण का संकेत है, जबकि एक अनुपात <1 अक्षतंतु प्रतिकर्षण इंगित करता है.
- कुछ मामलों में, neurites के घने विकास व्यक्ति neurite लंबाई के मूल्यांकन को रोकता है. इन स्थितियों में, मात्रा का ठहराव explant और प्रॉक्सिमल और बाहर का quadrants में अक्षतंतु विकास के अग्रणी सामने के किनारे के बीच की दूरी को मापने के द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है.
6. प्रतिनिधि छवियाँ
Axons की एक बड़ी संख्या डोपामिनर्जिक और striatal explants के के सफल संस्कृति के बाद उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी का उपयोग दृश्य या रूप में विरोधी βIII ट्यूबिलिन immunocytochemistry के द्वारा visualized हैं (नहीं दिखाया गया है). इन axons की एक सबसेट डोपामिनर्जिक या होगा कल्पना का उपयोग immunocytochemistry (चित्रा 3) के रूप में triatal axons. Quadrants में explants विभाजन के रूप में वर्णित किया और पी / डी अनुपात का निर्धारण करने के द्वारा, एक ख्यात अक्षतंतु आकर्षक या प्रतिकारक प्रभाव (3E चित्रा) की मात्रा निर्धारित किया जा सकता है.
चित्रा 1 चूहे की पूंछ tendons से कोलेजन की तैयारी illustrating के तस्वीरें. एक अलग चूहे की पूंछ खींच), tendons को उजागर करता है. बी) tendons रस्सी की तरह बंडलों के रूप में दिखाई दे रहे हैं. सी), tendons करने के लिए अपने चमकदार सफेद रूप से नसों से भेद करने के लिए आसान कर रहे हैं. डी) एसिटिक एसिड में tendons भंग करने के बाद, डायलिसिस टयूबिंग समाधान के लिए स्थानांतरित कर रहा है. भंग कोलेजन ठंडा रखने के लिए, ट्यूब बर्फ पर बाँझ एल्यूमीनियम पन्नी पर रखा जाता है.
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चित्रा 2 योजनाबद्ध प्रक्रिया के विभिन्न चरणों का संकेत है. उचित मस्तिष्क क्षेत्रों को विच्छेदित और explants उत्पन्न कटौती. एक एकल मध्यमस्तिष्क और striatal explant कोलेजन मैट्रिक्स में करीब निकटता में तैनात हैं और 37 डिग्री सेल्सियस पर 48-72 घंटे के लिए विकसित करने के लिए छोड़ दिया Axons प्रतिदीप्ति immunohistochemistry द्वारा visualized हैं और एक पी / डी अनुपात chemotropic प्रतिक्रियाओं यों गणना की है.
चित्रा 3 प्रतिनिधि कोलेजन मैट्रिक्स संस्कृति में अक्षतंतु विकास दिखा परिणाम. ए) midbrain explant विरोधी tyrosine hydroxylase प्रतिरक्षी खुलासा अक्षतंतु परिणाम के साथ दाग. बिंदीदार रेखा आसन्न explant इंगित करता है. बी) एक व्यक्ति दिखा के neurites और विकास शंकु (तीर) का इज़ाफ़ा. सी) striatal explant विरोधी DARPP32 के साथ दाग. डी) सी बढ़ाई व्यक्ति neurites दिखा. ई) का उदाहरणपी / डी अनुपात मात्रा का ठहराव. Explants बराबर quadrants में विभाजित कर रहे हैं. समीपस्थ वृत्त का चतुर्थ भाग आसन्न explant का सामना करना पड़ रहा है, जबकि बाहर का वृत्त का चतुर्थ भाग से दूर का सामना करना पड़ रहा है. स्केल सलाखों के 100 माइक्रोन से संकेत मिलता है.
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Discussion
कोलेजन मैट्रिक्स परख यहाँ वर्णित इस्तेमाल किया गया है और पिछले दशकों में कई अलग अलग प्रयोगशालाओं द्वारा सुधार अक्षतंतु मार्गदर्शन अणुओं और neuronal प्रणालियों की एक किस्म की जांच (जैसे 5-8 संदर्भ देखें). इन अध्ययनों से पता चला है कि इस परख अक्षतंतु मार्गदर्शन अलग लक्ष्य (मध्यवर्ती) ऊतकों द्वारा secreted अणुओं के प्रभाव और विनियमन के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है.
हालांकि, यह नोट किया जाना चाहिए कि कोलेजन मैट्रिक्स बाह्य वातावरण (ईसीएम) के लिए एक विकल्प है, लेकिन स्पष्ट रूप से कई सामान्य रूप से ईसीएम में मौजूद प्रोटीन का अभाव है. ईसीएम के घटक अक्षतंतु मार्गदर्शन के 10 अणुओं के प्रभाव को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है. फिर भी, कोलेजन मैट्रिक्स परख इन विट्रो में और अन्य ऊतक संस्कृति (जैसे organotypic टुकड़ा संस्कृतियों 11) दृष्टिकोण या अनुवांशिक इंजीनियर पशु मॉडल का विश्लेषण के साथ संयोजन में बुनियादी आणविक तंत्र की जांच के लिए विशेष रूप से उपयोगी है. कई कारकों कोलेजन मैट्रिक्स परख की सफलता का निर्धारण करते हैं. सबसे पहले, explants की आकार इष्टतम अक्षतंतु विकास के लिए महत्वपूर्ण है. बड़े डोपामिनर्जिक और striatal explants अक्सर सीमित अक्षतंतु विकास को प्रदर्शित करते हैं, जबकि छोटे explants अनियमित और पूलिकाओं अथवा गुच्छों में उत्पन्न होने वाला परिणाम दिखाते हैं. इसके अलावा, व्यक्तिगत explants के बीच की दूरी बहुत प्रभाव एक secreted अणु आसन्न explants पर लागू कर सकते हैं को प्रभावित करती है. यदि explants भी दूर कर रहे हैं, प्रसारण अणुओं explants तक पहुँचने के लिए असफल हो जायेगी. इसके विपरीत, जब दूरी है बहुत छोटा axons आसन्न explants में बढ़ती है, यह मुश्किल गुणात्मक और मात्रात्मक अक्षतंतु विकास और मार्गदर्शन का आकलन करने के लिए बना सकते हैं. अंत में, चूहे की पूंछ कोलेजन की गुणवत्ता महत्वपूर्ण है और सीधे axons और explants के अस्तित्व के परिणाम के साथ सहसंबद्ध है.
यहाँ वर्णित परख अलग अलग तरीके के लिए विशिष्ट अनुसंधान सवालों के पते में संशोधित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, के अलावामध्यम विकास के लिए एंटीबॉडी अवरुद्ध समारोह अणुओं (उम्मीदवार) के कार्यात्मक निषेध के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, explants सेल समुच्चय स्रावित विशिष्ट अक्षतंतु विकास और मार्गदर्शन कारकों के साथ जोड़ा जा सकता है. अंत में, explants को GFP संवाददाता चूहों में जो विशिष्ट neuronal आबादी और उनके axons में चिह्नित कर रहे हैं से प्राप्त किया जा सकता है. इस स्थापना का उपयोग कर, axons कोलेजन मैट्रिक्स परख के दौरान पीछा किया जा सकता है है.
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
कोलेजन मैट्रिक्स परख विकसित किया गया है और पिछले दो से तीन दशकों के दौरान कई विभिन्न अनुसंधान समूहों के काम में सुधार है. डोपामिनर्जिक और striatal explants के के लिए यहाँ वर्णित दृष्टिकोण बहुत इन अध्ययनों से लाभ. इसके अलावा, लेखक के लिए उसकी मदद के लिए striatal explant संस्कृतियों की स्थापना में Asheeta प्रसाद धन्यवाद करना चाहते हैं. प्रयोगशाला में काम मानव फ्रंटियर विज्ञान कार्यक्रम संगठन (कैरियर विकास पुरस्कार) द्वारा वित्त पोषित किया गया था, नीदरलैंड स्वास्थ्य अनुसंधान और विकास संगठन (ZonMW - Vidi और ZonMW के टॉप), Europanian संघ (mdDA NeuroDev, FP7/2007-2011 के 222,999 अनुदान) (लिए RJP के लिए), और वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए नीदरलैंड संगठन (TopTalent, ERES).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum | BioWhittaker | 14-801F | |
| Glutamine (200mM) | PAA Laboratories | M11-004 | |
| Hepes | VWR international | 441476L | |
| β-Mercapt–thanol | Merck & Co., Inc. | 444203 | |
| Minimum Essential Media (MEM) | GIBCO, by Life Technologies | 61100-087 | |
| Neurobasal | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | GIBCO, by Life Technologies | 11415-049 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15070-063 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132660 | |
| Rabbit anti-Tyrosine Hydroxylase | Pel-Freez Biologicals | P40101-0 | |
| Rabbit anti-Darpp32 (H-62) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-11365 | |
| Mouse anti-βIII tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | |
| Alexa Fluor labeled secondary antibodies | Invitrogen |
References
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