Summary
Explants du système dopaminergique mésencéphale et le striatum sont utilisés dans un essai de matrice de collagène pour la
Abstract
Dopamine du mésencéphale (MDDA) neurones du projet via le faisceau médian du cerveau antérieur vers plusieurs domaines dans le télencéphale, y compris le 1 striatum. Réciproquement, à moyen neurones épineux du striatum qui donnent lieu à l'striatonigrale (directe) voie innervent la substantia nigra 2. Le développement de ces secteurs axone dépend des actions combinatoires d'une pléthore de croissance des axones et des signaux de guidage, y compris des molécules qui sont libérées par neurites ou par régions cibles (intermédiaire) 3,4. Ces facteurs solubles peuvent être étudiés in vitro par MDDA culture et / ou des explants de striatum dans une matrice de collagène, qui fournit un substrat en trois dimensions pour les axones mimant l'environnement extracellulaire. En outre, la matrice de collagène permet la formation de gradients relativement stables de protéines libérées par des explants d'autres cellules ou placés dans le voisinage (par exemple voir les références 5 et 6). Nous décrivons ici les méthodes pour les finsification du collagène de queue de rat, de microdissection des explants dopaminergiques du striatum et, de leur culture dans des gels de collagène et après analyse immunohistochimique et quantitative. Tout d'abord, le cerveau des embryons de souris E14.5 sont isolées et dopaminergiques du striatum et les explants sont microdisséqué. Ces explants sont alors (co) cultivées dans des gels de collagène sur des lamelles de 48 à 72 heures in vitro. Par la suite, les projections axonales sont visualisées en utilisant des marqueurs neuronaux (par exemple la tyrosine hydroxylase, DARPP32, ou la tubuline βIII) et la croissance des axones et des réponses axonales attractives ou répulsives sont quantifiés. Cette préparation neuronale est un outil utile pour les études in vitro des mécanismes cellulaires et moléculaires de la croissance axonale et mesostriatal striatonigrale et d'orientation au cours du développement. L'utilisation de ce test, il est également possible d'évaluer d'autres (intermédiaire) pour les cibles des axones dopaminergiques du striatum et de tester ou de signaux moléculaires spécifiques.
Protocol
1. Préparation de collagène de queue de rat
- Recueillir 6-10 queues de rats adultes (il est possible de stocker les queues à -20 ° C jusqu'à son utilisation).
- Faire tremper les queues dans de l'éthanol à 95% du jour au lendemain à la température ambiante (RT).
Dissection de la queue de rat (dans la hotte de culture tissulaire):
(Ranger les outils dans l'éthanol à 70% quand il n'est pas de les utiliser et assurez-vous que toutes les solutions, les outils et la verrerie utilisés tout au long de cette procédure sont stériles)
- Pour recueillir des tendons de la queue, couper l'extrémité de la queue. Tenez gros bout de la queue avec une paire de pince. Utilisez une autre paire de pinces pour tenir, plier et casser la queue près de la pince d'autres. Séparez les tendons et seront laissés derrière (figure 1A, B).
- Recueillir les tendons dans stérile H 2 O et après avoir recueilli tous les tendons les déplacer vers un nouveau PetriDish stérile H 2 O.
- Prendre 2-3 tendons et les déchiqueter à l'aide de 2 paires decèpes dans un boîte de Pétri stérile nouveau H 2 O. Retirez non-tendon tissus tels que les veines (tissu tendineux est brillant et réfléchi; la figure 1C). Après le retrait de tous les tissus non-tendon, chaque queue donne environ 100-150 mg de tendons.
- Transfert des tendons à 300 ml de solution stérile d'acide acétique à 3% et remuer doucement pendant une nuit à 4 ° C.
- Ajouter un supplément de 200 ml de solution stérile d'acide acétique à 3% et remuer doucement pendant une nuit à 4 ° C.
- Centrifuger la solution d'acide acétique contenant les tendons à ~ 2700 xg pendant 120 min à 4 ° C à granulés non-dissous les tendons et les non-tendon tissus.
- Lors de la centrifugation de préparer un tube de dialyse:
- couper des morceaux de 40 cm
- faire bouillir dans 500 uM EDTA pendant 5 min
- cool dans stérile H 2 O
- Attacher un noeud à une extrémité de la tubulure de dialyse et remplir le tube avec le surnageant de la solution du tendon centrifugé sur de la glace dans la hotte de culture tissulaire utilisant une machine automatique pipette et 25 ml d'une pipette. Eviter la production de bulles. Noeud l'autre extrémité de la tubulure et la tuyauterie magasin sur feuille d'aluminium stérile sur la glace jusqu'à ce que tous les morceaux de tube sont remplis (figure 1D).
- Préparer 10 litres de solution stérile de 0,1 X MEM, pH 4,0, dans la hotte de culture tissulaire. Ajouter flotteur à des morceaux de tuyaux et les ajouter à la solution pré-refroidie MEM 0,1 X dans un bécher de 10 l. Dialyser une nuit à 4 ° C tout en remuant lentement. Cette dialyse élimine l'excès d'acide tout en maintenant le pH le plus bas.
- Remplacez-la par une nouvelle pré-refroidi 10 l à 0,1 X MEM et agiter pendant une nuit à 4 ° C.
- Répétez l'étape précédente en remplaçant avec le nouveau pré-refroidi 10 l à 0,1 X MEM et agiter pendant une nuit à 4 ° C.
- Solution de collagène Aliquoter dans stériles tubes de 50 ml. Aliquotes conserver à 4 ° C. Gardez les 6-12 mois, seulement gérer le stock de collagène dans la hotte de culture tissulaire.
- Il est important de vérifier si le collagène purifié doit être dilué (en 0.1x MEM) pour obtenir des résultats optimaux dans le matr collagèneix dosage. Par conséquent, générer une série de dilution de collagène (collagène pur, 1:1, 1:2 et 1:5 dilué) et effectuer des essais de la matrice de collagène comme décrit ci-dessous pour déterminer la dilution optimale du collagène.
2. Dissection du mésencéphale dopaminergique 7,8
- Disséquer E14.5 embryons de souris de l'utérus de la mère et de garder dans du milieu L15 sur la glace jusqu'à ce que nécessaire.
Toutes les étapes suivantes sont effectuées dissection dans du milieu L15 sur la glace.
- Disséquer le cerveau.
- Retirez le télencéphale en coupant le long de la partie médiane de chaque vésicule télencéphalique (utiliser les vésicules télencéphaliques pour explants striatum).
- Retirer la gaine méningée.
- Faites une coupe dorsoventral juste rostrale de la flexion mésencéphalique.
- Faire une autre coupe dorsoventral juste caudale de la flexion mésencéphalique.
- Faire une entaille le long rostrocaudal la ligne médiane dorsale en utilisant un microdissection couteau pour exposer le tissu sous-jacent du mésencéphale ventral. Soyez prudent de ne pas frapper le tissu mésencéphale ventral, car il contient les neurones dopaminergiques (figure 2).
- Effectuer deux coupes rostrocaudal latérale et parallèle à la ligne médiane ventrale pour enlever les tissus du mésencéphale dorsal.
- Diviser le tissu mésencéphale ventral restant dans des explants aide d'un couteau de microdissection.
- Conserver les explants dans du milieu L15 contenant FBS 5% sur la glace jusqu'à utilisation.
3. Dissection du striatum
Toutes les étapes de dissection sont réalisées dans du milieu L15 sur la glace.
- Utilisez vésicules télencéphaliques disséqués lors de la dissection du mésencéphale.
- Retirez le thalamus en coupant entre le thalamus et le striatum en utilisant une pince.
- Faites une coupe médio-latérale rostrale dans le striatum de supprimer les structures rostrales tels que le bulbe olfactif. Répétez cette étape pour le tissu situé caudalement dans le striatum.
- Positionla tranche restante pour obtenir une vue coronale du striatum (figure 2).
- Le striatum peut être reconnue comme une partie un peu moins dense (plus transparent) de tissu. Disséquer le striatum et le couper en explants aide d'un couteau de microdissection. Eviter la fermeture des tissus légèrement plus foncée à la ligne médiane, qui contient des neurones migrent de l'éminence ganglionnaire latérale et médiale.
- Conserver les explants dans du milieu L15 contenant FBS 5% sur la glace jusqu'à utilisation.
4. Assemblée de collagène essais de Matrix
Préparation du collagène (toutes les étapes sur la glace, utilisez refroidi pointes de pipette)
- Mélanger 860 pi de collagène dilué avec 100 ul de MEM 10x et 40 pi de bicarbonate de sodium 1M (NaHCO 3) et de garder sur la glace. Si, à ce point, le collagène se réchauffe, elle va se solidifier.
- Ajouter une goutte de 20 pl (environ 5 mm de diamètre) de collagène préparés à une lamelle dans un puits d'un plat à 4 puits Nuncet laissez reposer dans un incubateur à CO 2 à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 30 min (ambiante concentration d'O 2 est suffisant). Au cours de cette incubation, le collagène gélatiniser.
Configuration de co-culture en gel de collagène
- Après le collagène a gélatinisé, utiliser une pipette avec une pointe de 200 pi de transférer un explant dopaminergique striatale ou au collagène.
- Déplacer les explants à proximité immédiate de l'autre à l'aide d'une aiguille. Gardez-les en dehors à une distance d'environ le diamètre d'un explant (environ 200-300 um) (Figure 2).
- Retirer excès du milieu et ajouter 20 ul de collagène préparé au-dessus des explants. Ce sera souvent la cause des explants de se déplacer. Repositionner les explants à l'aide d'une aiguille, comme décrit au paragraphe 4.4.
- Laissez-le collagène solidifier pendant 15 min à température ambiante puis 30 min à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Après le collagène a mis, ajouter 400 ul de emoyennes xplant et de grandir pendant 2-3 jours dans un incubateur à CO 2 à 37 ° C et 5% de CO 2.
5. Analyse par immunohistochimie et la quantification
Immunohistochimie
- Pour fixer des explants, doucement ajouter 400 ul de paraformaldéhyde 8% (PFA) dans du PBS à 400 pi de milieu (ce qui dilue la PFA à 4%) et laisser reposer pendant 1 heure à température ambiante.
- Laver 3x 15 min dans du PBS à la température ambiante.
- Incuber dans un tampon bloquant (BB; PBS + 1% de FBS + 0,1% de Triton X-100) pendant 2 heures.
- Incuber une nuit avec l'anticorps primaire en BB à 4 ° C. Pour les axones dopaminergiques utilisent anticorps anti-tyrosine hydroxylase (1:1000) 7, pour les axones striataux anti-DARPP32 anticorps (1:500) 9 et pour la visualisation de tous les axones anti-tubuline βIII (1:3000) 7.
- Laver 5x 1 heure dans du PBS à la température ambiante.
- Incuber avec un anticorps secondaire conjugué à la fluorophore approprié (1:500) dans la nuit à 4 BB° C A partir de cette étape sur le minimiser l'exposition des explants à la lumière (par exemple les couvrir de papier d'aluminium).
- Laver la nuit dans du PBS à 4 ° C suivie de plusieurs lavages pendant la journée suivante.
- Montez sur les explants lames de microscope à l'aide Prolongez réactif Antifade milieu de montage. Ajouter une goutte de ~ 10 pi sur une lame de microscope en verre. Prendre la lamelle et la placer délicatement sur la goutte de milieu de montage avec le côté explant vers le bas. Évitez de piéger l'air sous la lamelle de par de très abaissant doucement sur la goutte de milieu de montage.
Quantification par le calcul de P / D
- Acquérir des images numériques des explants en utilisant un microscope à épifluorescence (Figure 3).
- L'utilisation des images, diviser chaque explant en quadrants pour générer un quadrant proximale (à savoir une partie de l'explant la plus proche de l'explant adjacente) et un quadrant distale (partie de l'explant plus éloignée de l'explication adjacentent) (figure 2, 4).
- Mesurer la longueur de la plus longue de 20 neurites émergents de l'explant la fois dans les quadrants proximale et distale.
- Utilisez la longueur moyenne des 20 plus longs neurites pour calculer le ratio P / D pour chaque explant individuelle. AP / rapport D> 1 indique attraction axone, tandis qu'un ratio <1 indique la répulsion des axones.
- Dans certains cas, la croissance des neurites dense empêche l'évaluation de la longueur des neurites individuelle. Dans ces situations, la quantification peut être réalisée en mesurant la distance entre le bord de l'explant et le front avancé de la croissance des axones dans les quadrants proximale et distale.
6. Images représentatives
Après la culture réussie des explants dopaminergiques du striatum et un grand nombre d'axones sont visibles en utilisant la microscopie en champ clair ou visualisée par immunocytochimie anti-tubuline βIII (non représentée). Un sous-ensemble de ces axones sera dopaminergique ou s axones triatal que immunocytochimie à l'aide visualisées (figure 3). En divisant les explants en quadrants telle que décrite et la détermination de P / D ratios, un effet axone putatif attractive ou répulsive peut être quantifiée (Figure 3E).
Figure 1. Photos illustrant la préparation du collagène de tendons de rats. A) tirer en dehors de la queue de rat expose les tendons. B) Les tendons sont visibles que de corde comme des paquets. C) Les tendons sont faciles à distinguer des veines par leur aspect blanc brillant. D) après dissolution des tendons dans l'acide acétique, la solution est transférée à un tube de dialyse. Pour garder le froid collagène dissous, les tubes sont placés sur une feuille d'aluminium stérile sur la glace.
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Figure 2. Schématique indiquant les différentes étapes de la procédure. Régions du cerveau appropriées sont disséqués et coupés pour générer des explants. Un mésencéphale unique et explant striatale sont positionnés à proximité immédiate dans une matrice de collagène et de gauche à se développer pendant 48-72 heures à 37 ° C. Axones sont visualisés par immunohistochimie fluorescence et un rapport P / D est calculée à quantifier les réponses chimiotactique.
Figure 3. Les résultats représentatifs montrant la croissance des axones dans une culture matrice de collagène. A) explant Mésencéphale colorées avec un anticorps anti-tyrosine hydroxylase révélant la croissance axonale. La ligne pointillée indique explant adjacente. B) Grossissement d'une neurites montrant individuels et des cônes de croissance (flèches). C) explant striatale colorées avec des anticorps anti-DARPP32. D) Grossissement de C montrant neurites individuels. E) Exemple deLa quantification du ratio P / D. Les explants sont divisés en quadrants égaux. Le quadrant proximale est confrontée à l'explant adjacente tandis que le quadrant distale est opposé à lui. Barres d'échelle indiquent 100 um.
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Discussion
Le test matrice de collagène décrit ici a été utilisé et amélioré par de nombreux laboratoires différents dans les dernières décennies pour étudier une variété de molécules de guidage axonal et des systèmes neuronaux (par exemple voir les références 5-8). Ces études ont montré que ce test est un outil puissant pour étudier les effets et la régulation des molécules de guidage axonal sécrétées par différents tissus cibles (intermédiaire).
Toutefois, il convient de noter que la matrice de collagène est un substitut pour l'environnement extracellulaire (ECM), mais manque clairement de nombreuses protéines normalement présentes dans l'ECM. Composants de l'ECM sont connus pour influencer les effets de molécules de guidage axonal 10. Néanmoins, le dosage matrice de collagène est particulièrement utile pour étudier les mécanismes moléculaires fondamentaux in vitro et en combinaison avec d'autres approches de culture de tissus (par exemple cultures organotypiques de tranches 11) ou l'analyse de modèles animaux génétiquement modifiés. Plusieurs facteurs déterminent le succès de l'essai matrice de collagène. Tout d'abord, la taille des explants est cruciale pour la croissance axonale optimale. Les grandes explants dopaminergiques du striatum et affichent souvent la croissance des axones limitée, tandis que les petits explants montrent excroissance irrégulière et fasciculée. En outre, la distance entre les explants individuels grande influence sur l'effet d'une molécule sécrétée peut exercer sur les explants adjacentes. Si les explants sont trop éloignés, les molécules diffusibles ne parviendra pas à atteindre les explants. Inversement, lorsque la distance est trop petite axones peuvent se développer dans les explants adjacentes, ce qui rend difficile à évaluer qualitativement et quantitativement la croissance des axones et des conseils. Enfin, la qualité du collagène de queue de rat est important et est en corrélation directe avec l'excroissance des axones et la survie des explants.
La méthode décrite ici peut être modifié de différentes façons pour répondre aux questions de recherche spécifiques. Par exemple, l'ajout dela fonction de blocage d'anticorps au milieu de croissance permet pour l'inhibition fonctionnelle de (candidat) molécules. En outre, les explants peuvent être combinés avec la cellule sécrétant des agrégats de la croissance axonale spécifique et les facteurs d'orientation. Enfin, les explants pourrait être obtenu à partir de souris rapporteur GFP dans lequel des populations neuronales spécifiques et de leurs axones sont marqués. En utilisant cette configuration, les axones peuvent être suivies au cours de l'essai matrice de collagène.
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Disclosures
Nous n'avons rien à communiquer.
Acknowledgments
Le test matrice de collagène a été développé et amélioré par le travail de nombreux groupes de recherche différents au cours des deux à trois dernières décennies. Les approches décrites ici pour explants dopaminergiques du striatum et grandement bénéficier de ces études. En outre, les auteurs tiennent à remercier Asheeta Prasad pour son aide dans la mise en place des cultures d'explants du striatum. Les travaux dans le laboratoire a été financé par l'Organisation Human Frontier Science Program (Prix du développement de carrière), l'Organisation néerlandaise de recherche en santé et le développement (ZonMw-VIDI et ZonMw-TOP), l'Union Europanian (MDDA-NeuroDev, FP7/2007-2011 , Grant 222 999) (à RJP), et l'Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (TopTalent; à ERES).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum | BioWhittaker | 14-801F | |
| Glutamine (200mM) | PAA Laboratories | M11-004 | |
| Hepes | VWR international | 441476L | |
| β-Mercapt–thanol | Merck & Co., Inc. | 444203 | |
| Minimum Essential Media (MEM) | GIBCO, by Life Technologies | 61100-087 | |
| Neurobasal | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | GIBCO, by Life Technologies | 11415-049 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15070-063 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132660 | |
| Rabbit anti-Tyrosine Hydroxylase | Pel-Freez Biologicals | P40101-0 | |
| Rabbit anti-Darpp32 (H-62) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-11365 | |
| Mouse anti-βIII tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | |
| Alexa Fluor labeled secondary antibodies | Invitrogen |
References
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