Summary
En hurtig og præcis point-of-care test for invasiv pulmonal aspergillose præsenteres. Den udnytter lateral-flow-teknologi med et specifikt monoklonalt antistof, der binder til en
Abstract
Invasiv pulmonal aspergillose (IPA) er en førende årsag til sygelighed og dødelighed i hæmatologiske malignitet patienter og HSCT modtagere 1. Påvisning af IPA er en formidabel diagnostisk udfordring, og i mangel af en "gold standard", på en kombination af kliniske data og mikrobiologi og histopatologi hvor det er muligt bygger på. Diagnose af IPA, skal i overensstemmelse med den Europæiske Organisation for forskning og behandling af kræft og National Institute of Allergy og smitsomme sygdomme Mykologi Study Group (EORTC / MSG) konsensus definere "bevist", "sandsynligt", og "muligt" invasive svampesygdomme 2 . Dag, har ingen nukleinsyre-baserede tests er eksternt valideret for IPA påvisning og så polymerasekædereaktion (PCR) er ikke inkluderet i de aktuelle EORTC / MSG diagnostiske kriterier.
Identifikation af Aspergillus i histologiske snit er problematisk på grund af simiuregelmæssigheder i hyfe morfologier med andre invasive svampepatogener 3 og afprøvet identifikation kræver isolering af det ætiologiske middel i ren kultur. Kultur-baserede tilgange afhængige af tilgængeligheden af biopsiprøver, men disse er ikke altid tilgængelige i syge patienter, og ikke altid giver levedygtige formeringsorganer for kultur, når det er opnået.
Et vigtigt element i patogenesen af Aspergillus er angio-invasion, et træk, der giver muligheder for at spore svampen immunologisk ved hjælp af test, der registrerer karakteristiske antigene signatur molekyler i serum og bronkoalveolær lavage (BAL) væske. Dette har ført til udviklingen af Platelia enzymimmunoassay (GM-EIA), som detekterer Aspergillus galactomannan og en "pan-fungale" assay (Fungitell test), der detekterer den konserverede svampecellen vægkomponent (1 → 3)-β-D- glucan, men ikke i Mucorales, der mangler denne komponent i deres cellevægge 1,4. Ersagsøger omgiver nøjagtigheden af disse tests 1,4-6 har ført til den nylige udvikling af den næste generation monoklonalt antistof (MAb)-baserede assays, som påviser surrogatmarkører for infektion 1,5.
Thornton 5 nylig beskrevet dannelsen af en Aspergillus-specifik MAb (JF5) under anvendelse af hybridoma-teknologi og dens anvendelse til at udvikle en immuno-kromatografisk lateral-flow-anordning (LFD) til point-of-care (POC) diagnosticering af IPA. En væsentlig fordel ved LFD er dens evne til at detektere aktivitet, eftersom MAb JF5 binder til et ekstracellulært glycoprotein-antigen, der udskilles under aktiv vækst af svampen kun 5. Dette er en vigtig overvejelse, når der anvendes væsker, såsom lunge BAL til diagnosticering IPA idet Aspergillus sporer er en almindelig komponent af inhaleret luft. Anvendeligheden af indretningen til diagnosticering af IPA er blevet påvist ved anvendelse af en dyremodel for infektion, hvor LFD viste forbedret følsomhed og specificity forhold til Platelia GM og Fungitell (1 → 3)-β-D-glucan assays 7.
Her præsenterer vi en simpel LFD procedure til at påvise Aspergillus antigen i human serum og BAL væsker. Dens hastighed og præcision giver en ny adjungeret point-of-care test til diagnose af IPA med hæmatologiske malignitet patienter.
Protocol
1. Indsamling, opbevaring og tilberedning af serum og bronchoalveolær udskylningsvæsker
- Indsamle serum fra ubehandlede blodprøver ved at lade blodet størkne ved 4 ° C, og opbevares serum som alikvoter ved -20 ° C før brug. Bronkoalveolære lavageceller væsker (BAL) bør også opbevares som aliquoter ved -20 ° C. Bemærk: Lagring af serum og BAL som aliquots begrænser potentialet for nedbrydning af mål-antigen ved gentagne fryse-optøning af prøver under gentagne målinger.
- Tø prøver og blandes serum og BAL-prøver grundigt ved hvirvelbehandling og centrifugeres i 1 minut ved 14.000 rpm.
- Til rutinemæssig testning af humane serumprøver, fortyndes serum 1:1 (v / v) med vævskulturmedium (TCM). TCM består af RPMI-1640 medium, 10% (v / v) føtalt kalveserum, 1% (v / v) 200 mM L-glutamin-opløsning og natriumazid (0,02% vægt / vol) som konserveringsmiddel. Mediet fremstilles på forhånd og kan opbevares ved 4 ° C i adskillige måneder. Anvende 100 ul af diluted serum til LFD.
- For humane BAL fluider, og BAL-væsker fra dyremodeller anvendes 100 ul ublandet prøven LFD uden forbehandling.
- For serum fra dyremodeller, fortyndet serum 1:2 (v / v) med phosphatpufret saltvand indeholdende 4% (w / v) EDTA, varme til 3min i et kogende vandbad, centrifugeres i 5 minutter ved 14.000 rpm, og anvende 100 ul ublandet supernatant til LFD indretningen.
2. Anvendelsen af serum og BAL til lateral-flow-enhed
- Gemme lateral-flow-enheder ved stuetemperatur (23 ° C). Ved denne temperatur, er indretninger stabile i 12 måneder. Fjern enheder fra deres poser og sted på en plan overflade.
- Anvendelse af en steril pipettespids, anvendes 100 pi forbehandlet serum eller ublandet BAL-prøven til frigivelse port af indretningen.
- Tillader assay til at køre i 15 minutter ved stuetemperatur, på hvilket tidspunkt resultaterne af tests bør registreres. Bemærk: Inden for få sekunder væsken vil være sig selven til at migrere ved kapillarvirkning langs nitrocellulosemembranen i observation vinduet.
3. Optagelse og tolkning LFD resultater
- Den LFD består af en intern styreledningen (angivet ved bogstavet C ved plasthus) og en prøve linie (angivet ved bogstavet T). Styreledningen skal altid forekommer uafhængigt af Aspergillus antigen i serummet eller BAL-prøven. Dette viser, at assayet er fungere korrekt.
- Hvis Aspergillus antigenet er til stede i serumet eller BAL-prøven, vil testen linie forekommer også i 15min af prøven anvendelse. Fordi intensiteten af testlinien er proportional med mængden af Aspergillus antigen til stede i prøven, kan prøven linie vist som en svagt positiv (+), et moderat positiv (+ +) eller en stærk positiv (+ + +) . Men enhver positiv test linie, uanset intensiteten, ville indikere tilstedeværelsen af Aspergillus antigen i prøven. I the fravær af Aspergillus antigen, vil testlinie vises, og resultatet registreres som negativ (-).
4. Repræsentative resultater
Repræsentative eksempler på negative og svage positive moderate positive og stærkt positive LFD resultater med BAL og serumprøver er vist i figur 1.
Resultaterne af antigen-positive LFD tests (svag og stærk) eller negative LFD test under anvendelse af Bal fluider fra akut myeloid leukæmi (AML) patienter diagnosticeret ifølge EORTC / MSG diagnostiske kriterier er vist i tabel 1. Inkluderet i denne tabel er de tilsvarende kliniske og mykologiske (galactomannan og kultur) data, og resultaterne af en Aspergillus-specifik PCR-test udviklet på St. Bartholomews Hospital 8, for hver patient. Diagnose af sygdom var baseret på værtsfaktorer (neutropeni, forlænget anvendelsen af corticosteroider, behandling med andre anerkendte T-celle immunosuppressants), kliniske kriterier og GM positivitet for BAL (her defineret som en GM-index værdi> 0,8). Under 2002 EORTC / MSG retningslinjer 10, patienter 12, 13 og 16 blev diagnosticeret med 'muligt' IA på grundlag af vært faktorer og kliniske kriterier, eller GM positivitet. Ifølge de reviderede (2008) EORTC / MSG retningslinjer 2, vært faktorer og GM positivitet alene eller host faktorer og kliniske kriterier alene ikke ville indikere 'muligt' invasiv svampeinfektion medmindre de ledsages af dokumentation fra kliniske data og Mykologi hhv. Patient 6 blev diagnosticeret med 'sandsynligt' IA i både 2002 og 2008 retningslinjer på grund af vært faktorer, større og mindre kliniske funktioner og GM positivitet. Bemærk, at mens hverken LFD eller PCR-assays for øjeblikket er inkluderet i EORTC / MSG retningslinier, der er stærk mellem de to assays og den kommercielle galactomannan test indikerer tilstedeværelsen af Aspergillus antigen og nucleinsyre i BAL-prøven s af patienter 6 og 12. Yderligere resultaterne af forsøg viser effektiviteten af den LFD og PCR-assays i diagnosticering IPA kan findes i Johnson et al 8.
Figur 1. Negativ (styreledning alene) og positive (kontrol og prøve linie) Resultaterne af LFD forsøg med serum og BAL. Intensiteten af testlinie reaktioner er proportional med koncentrationen af target-antigen i serum og BAL-prøver. Reaktioner typisk fra svag (+) gennem moderat (+ +) til stærk (+ + +). Uanset testlinie intensitet, vil alle tre serum positive reaktioner indikerer invasiv pulmonal aspergillose sygdom på grund af tilstedeværelsen af cirkulerende Aspergillus antigen i blodet. Positive BAL reaktioner (svag, moderat eller kraftig) ville indikere spiring af sporer og udvikling af potentielt patogene hyfer i lungerne.
| Patienten ikke. | PatiENT oplysninger | Kliniske kriterier 1 | BAL kultur 2 | GM VVM-indeks 3 | EORTC / MSG (2002) 4 | EORTC / MSG (2008) 5 | Aspergillus PCR-resultat | LFD resultat |
| 6 | - | Større CT tegn (knuder og halogen) og en mindre | Negativ | 0,9 (positiv) | Sandsynlig | Sandsynlig | Positiv | Svag positiv (+) |
| 12 | Formodes foregående svampeinfektion | Ingen større, en mindre | Candida glabrata | 6,43 (stærk positiv) | Mulig | Ingen | Positiv | Stærk positive (+ + +) |
| 13 | Koagulase-negative Staphylococcus og E. coli i blod | Ingen større, to mindre | Negativ | 0,25 (negativ) | Mulig | Ingen | Negativ | Negativ (-) |
| 16 | Infektion i brystet | 3 mindre kriterier, herunder nye infiltrere plus flertal effusion | Negativ | 0,16 (negativ) | Mulig | Ingen | Negativ | Negativ (-) |
1 Knuder eller glorier på en CT-scanning er tyder på svampeinfektion
2 Candida glabrata i BAL væske ville blive betragtet som en urenhed, som det er den anden mest almindelige gær isoleret som led i den normale menneskelige flora 9
3 Et indeks> 0,8 i GM EIA prøve BAL er indikativ for Aspergillus infektion
4 Baseret på 2002 EORTC / MSG diagnostiske kriterier for 'possible ',' sandsynligt 'eller' bevist 'invasiv svampesygdom 10
5 Baseret på de reviderede (2008) EORTC / MSG diagnostiske kriterier for 'muligt', 'sandsynligt' eller 'bevist' invasive svampesygdom 2
Tabel 1. Resultater af LFD undersøgelser af BAL-prøver fra akut myeloid leukæmi patienter med sandsynlig IPA og fra kontrol AML-patienter (ikke tegn på infektion) og EORTC / MSG diagnose af infektion.
Discussion
Definitiv identifikation af IPA kun lige kan opnås ved isolering af det ætiologiske middel fra biopsiprøver, men genvinding egnede prøver ofte ikke er muligt i meget syge patienter og Aspergillus sjældent erstattes af blod. Mens store fremskridt er gjort i brugen af CT-scanning af brystkassen i IPA diagnose, egenskaber, der tyder på pulmonal IPA såsom "halo" eller "luft-halvmåne" tegn er enten forbigående eller kan henføres til vejrtrækning artefakter eller andre svampeinfektioner 11,12. Sådanne data er derfor suppleres med serologiske teknikker, der skal afdække signatur molekyler (GM og β-glucan) fra svampe, der cirkulerer i patientens serum eller som er til stede i BAL-væsker, spyt eller urin prøver 13. Selv om disse tests viser tilfredsstillende følsomhed, de mangler tilstrækkelig specificitet eller lider af forstyrrelser under visse betingelser 1,6
Den LFD test for IPA opdagelse præsenteres her gør det muligt for 'point-of-care "diagnose af IPA og udnytter teknologi, der er blevet brugt til dato i test til påvisning af virus, bakterier, parasitter og toksiner 14-19, og mest berømt, for hjemmet graviditetstest første gang indført ved Unipath i 1988. I Aspergillus LFD beskrevet her, er Aspergillus-specifikke MAb JF5 immobiliseret til en indfangningszone (test linje) på en porøs nitrocellulosemembran. Anti-muse-immunoglobulin immobiliseret til membranen i en separat zone tjente som en intern kontrol (kontrol linie). Ved tilsætning af serum eller BAL-væsken til frigivelse port, binder MAb JF5-kolloidt guld-konjugat i frigivelsen puden til målantigenet og komplekset passerer derpå langs den porøse membran ved kapillarvirkning. MAb JF5 immobiliseret i indfangningszonen binder til JF5-kolloidale guld-antigen-kompleks resulterer i en rød testlinien. Eventuelt ubundet JF5-kolloidt guldkonjugat binder til den interne kontrol viser, at assayet er fungere korrekt. Dette resulterer i en rød styreledningen.
Testen er hurtig, idet kun 15 minutter at udføre, er billigt sammenlignet med serum og BAL tests baseret på GM-og β-glucan detektering, og som ikke kræver dyrt udstyr eller omfattende laboratoriefaciliteter at køre. Endvidere har MAb JF5 ikke krydsreagerer med de lægemidler eller kontaminanter, som har vist sig at forårsage falsk positiv reaktion i GM-og β-glucan tests 1,4,6. En yderligere væsentlig fordel i forhold til nuværende diagnostiske tests er LFDs evnen til at detektere aktivitet, som er indikativ for invasiv vækst af Aspergillus-arter.
Et kritisk trin i LFD fremgangsmåde er behovet for at læse resultaterne 15 minutter efter anvendelse af serum-eller BAL-prøven til anordningen. Testen bør ikke stå længere end 15 minutter før registrering af resultaterne, da dette kan skævhed resultat interpretatiden. En svag reaktion vil ikke blive forbedret ved at udvide inkubationsperioden. Varmebehandling af serum fra dyremodeller for infektion er blevet fundet at forbedre assayets følsomhed. En begrænsning af testen er, at det er kvalitativ, og er afhængig af operatøren til at foretage en subjektiv vurdering af positivitet. Intensiteten af testlinien varierer afhængigt af de antigen-indholdet i serum og BAL-prøver (figur 1). Men enhver positiv reaktion (bestemt ved sammenligning med kendte negativer) indikerer tilstedeværelsen af Aspergillus antigen og derfor infektion. For at begrænse subjektivitet LFD analyser, håndholdte enheder er til rådighed, som tillader kvantificering af LFD testlinie intensiteter og muliggøre etablering af tærskelværdier for påvisning af antigen 20.
Fremtidig udvikling af LFD omfatter kommercialisering og udviklingen af en multiplex LFD, der tillader samtidig påvisning af andre invasive patogene svampeved hjælp af meget specifikke MAbs 3.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Finansiering af Dr. Thornton fra Pfizer Limited er taknemmeligt anerkendt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aspergillus LFD | University of Exeter | Available from the corresponding author on request | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Fetal calf serum | Biosera | S9100 | Other sources of fetal calf serum can be used in the preparation of TCM |
| EDTA | Fisher Scientific | BPE120-1 |
References
- Thornton, C. R. Detection of invasive aspergillosis. Adv. Appl. Microbiol. 70, 187-216 (2010).
- De Pauw, B., Walsh, T. J., Donnelly, J. P. Revised definitions of invasive fungal disease from the European Organization for Research and Treatment of Cancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycology Study Group (EORTC/MSG) concensus group. Clin. Infect. Dis. 46, 1813-1821 (2008).
- Thornton, C. R. Tracking the emerging human pathogen Pseudallescheria boydii by using highly specific monoclonal antibodies. Clin. Vacc. Immunol. 16, 756-764 (2009).
- Pickering, J. W. Evaluation of a (1 -> 3)-β-D-glucan assay for diagnosis of invasive fungal infections. J. Clin. Microbiol. 43, 5957-5962 (2005).
- Thornton, C. R. Development of an immunochromatographic lateral-flow device for rapid serodiagnosis of invasive aspergillosis. Clin. Vacc. Immunol. 15, 1095-1105 (2008).
- Verweij, P. E., Mennink-Kersten, M. A. S. H. Issues with galactomannan testing. Med. Mycol. 44, 179-183 (2006).
- Wiederhold, N. P. Comparison of lateral flow technology and galactomannan and (1 -> 3)-β-D-glucan assays for detection of invasive pulmonary aspergillosis. Clin. Vacc. Immunol. 16, 1844-1846 (2009).
- Johnson, G. L., Bibby, D., Bustin, S. Detection of Aspergillus in broncho-alveolar lavage fluid using two biological assays; evidence of active infection. Mycoses. 54, Suppl 2. 130-131 (2011).
- Malani, A. Candida glabrata fungemia: experience in a tertiary care centre. Clin. Infect. Dis. 41, 975-981 (2005).
- Ascioglu, S. Defining opportunistic invasive fungal infection in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international concensus. Clin. Infect. Dis. 34, 71-74 (2002).
- Denning, D. Early diagnosis of invasive aspergillosis. Lancet. 355, 423-424 (2000).
- Greene, R., Shibuya, K., Ando, T. Aspergillus fumigatus and Aspergillosis. Latge, J. -P., Steinbach, W. J. , ASM Press. 353-363 (2009).
- Klont, R. R., Mennink-Kersten, M. A. S. H., Verweij, P. E. Utility of Aspergillus antigen detection in specimens other than serum samples. Clin. Infect. Dis. 39, 1467-1474 (2004).
- Iweala, O. I. HIV diagnostic tests: an overview. Contraception. 70, 141-147 (2004).
- Ketema, F., Zeh, C., Edelman, D. C. Assessment of the performance of a rapid, lateral flow assay for the detection of antibodies to HIV. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 27, 63-70 (2001).
- Moody, A. Rapid diagnostic tests for malaria parasites. Clin. Microbiol. Rev. 15, 66-78 (2002).
- Parkash, O. Performance of a lateral flow test for the detection of leprosy patients in India. J. Med. Microbiol. 57, 130-132 (2008).
- Sharma, S. K. Evaluation of lateral-flow Clostridium botulinum neurotoxin detection kits for food analysis. Appl. Environ. Microbiol. 71, 3935-3941 (2005).
- Smits, H. L. Lateral-flow assay for rapid serodiagnosis of human leptospirosis. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8, 166-169 (2001).
- Faulstich, K. Lateral Flow Immunoassay. Wong, R., Tse, H. , Humana Press. 157-185 (2009).
