En hurtig og præcis point-of-care test for invasiv pulmonal aspergillose præsenteres. Den udnytter lateral-flow-teknologi med et specifikt monoklonalt antistof, der binder til en<em> Aspergillus</em> Antigen udskilles under lungeinfektioner. Assayet er kompatibel med serum og brochoalveolar lavage og repræsenterer en hidtil ukendt supplement test for sygdomsdiagnose.
Invasiv pulmonal aspergillose (IPA) er en førende årsag til sygelighed og dødelighed i hæmatologiske malignitet patienter og HSCT modtagere 1. Påvisning af IPA er en formidabel diagnostisk udfordring, og i mangel af en "gold standard", på en kombination af kliniske data og mikrobiologi og histopatologi hvor det er muligt bygger på. Diagnose af IPA, skal i overensstemmelse med den Europæiske Organisation for forskning og behandling af kræft og National Institute of Allergy og smitsomme sygdomme Mykologi Study Group (EORTC / MSG) konsensus definere "bevist", "sandsynligt", og "muligt" invasive svampesygdomme 2 . Dag, har ingen nukleinsyre-baserede tests er eksternt valideret for IPA påvisning og så polymerasekædereaktion (PCR) er ikke inkluderet i de aktuelle EORTC / MSG diagnostiske kriterier.
Identifikation af Aspergillus i histologiske snit er problematisk på grund af simiuregelmæssigheder i hyfe morfologier med andre invasive svampepatogener 3 og afprøvet identifikation kræver isolering af det ætiologiske middel i ren kultur. Kultur-baserede tilgange afhængige af tilgængeligheden af biopsiprøver, men disse er ikke altid tilgængelige i syge patienter, og ikke altid giver levedygtige formeringsorganer for kultur, når det er opnået.
Et vigtigt element i patogenesen af Aspergillus er angio-invasion, et træk, der giver muligheder for at spore svampen immunologisk ved hjælp af test, der registrerer karakteristiske antigene signatur molekyler i serum og bronkoalveolær lavage (BAL) væske. Dette har ført til udviklingen af Platelia enzymimmunoassay (GM-EIA), som detekterer Aspergillus galactomannan og en "pan-fungale" assay (Fungitell test), der detekterer den konserverede svampecellen vægkomponent (1 → 3)-β-D- glucan, men ikke i Mucorales, der mangler denne komponent i deres cellevægge 1,4. Ersagsøger omgiver nøjagtigheden af disse tests 1,4-6 har ført til den nylige udvikling af den næste generation monoklonalt antistof (MAb)-baserede assays, som påviser surrogatmarkører for infektion 1,5.
Thornton 5 nylig beskrevet dannelsen af en Aspergillus-specifik MAb (JF5) under anvendelse af hybridoma-teknologi og dens anvendelse til at udvikle en immuno-kromatografisk lateral-flow-anordning (LFD) til point-of-care (POC) diagnosticering af IPA. En væsentlig fordel ved LFD er dens evne til at detektere aktivitet, eftersom MAb JF5 binder til et ekstracellulært glycoprotein-antigen, der udskilles under aktiv vækst af svampen kun 5. Dette er en vigtig overvejelse, når der anvendes væsker, såsom lunge BAL til diagnosticering IPA idet Aspergillus sporer er en almindelig komponent af inhaleret luft. Anvendeligheden af indretningen til diagnosticering af IPA er blevet påvist ved anvendelse af en dyremodel for infektion, hvor LFD viste forbedret følsomhed og specificity forhold til Platelia GM og Fungitell (1 → 3)-β-D-glucan assays 7.
Her præsenterer vi en simpel LFD procedure til at påvise Aspergillus antigen i human serum og BAL væsker. Dens hastighed og præcision giver en ny adjungeret point-of-care test til diagnose af IPA med hæmatologiske malignitet patienter.
Definitiv identifikation af IPA kun lige kan opnås ved isolering af det ætiologiske middel fra biopsiprøver, men genvinding egnede prøver ofte ikke er muligt i meget syge patienter og Aspergillus sjældent erstattes af blod. Mens store fremskridt er gjort i brugen af CT-scanning af brystkassen i IPA diagnose, egenskaber, der tyder på pulmonal IPA såsom "halo" eller "luft-halvmåne" tegn er enten forbigående eller kan henføres til vejrtrækning artefakter eller andre svampeinfektioner 11,12. Sådanne data er derfor suppleres med serologiske teknikker, der skal afdække signatur molekyler (GM og β-glucan) fra svampe, der cirkulerer i patientens serum eller som er til stede i BAL-væsker, spyt eller urin prøver 13. Selv om disse tests viser tilfredsstillende følsomhed, de mangler tilstrækkelig specificitet eller lider af forstyrrelser under visse betingelser 1,6 </sup>.
Den LFD test for IPA opdagelse præsenteres her gør det muligt for 'point-of-care "diagnose af IPA og udnytter teknologi, der er blevet brugt til dato i test til påvisning af virus, bakterier, parasitter og toksiner 14-19, og mest berømt, for hjemmet graviditetstest første gang indført ved Unipath i 1988. I Aspergillus LFD beskrevet her, er Aspergillus-specifikke MAb JF5 immobiliseret til en indfangningszone (test linje) på en porøs nitrocellulosemembran. Anti-muse-immunoglobulin immobiliseret til membranen i en separat zone tjente som en intern kontrol (kontrol linie). Ved tilsætning af serum eller BAL-væsken til frigivelse port, binder MAb JF5-kolloidt guld-konjugat i frigivelsen puden til målantigenet og komplekset passerer derpå langs den porøse membran ved kapillarvirkning. MAb JF5 immobiliseret i indfangningszonen binder til JF5-kolloidale guld-antigen-kompleks resulterer i en rød testlinien. Eventuelt ubundet JF5-kolloidt guldkonjugat binder til den interne kontrol viser, at assayet er fungere korrekt. Dette resulterer i en rød styreledningen.
Testen er hurtig, idet kun 15 minutter at udføre, er billigt sammenlignet med serum og BAL tests baseret på GM-og β-glucan detektering, og som ikke kræver dyrt udstyr eller omfattende laboratoriefaciliteter at køre. Endvidere har MAb JF5 ikke krydsreagerer med de lægemidler eller kontaminanter, som har vist sig at forårsage falsk positiv reaktion i GM-og β-glucan tests 1,4,6. En yderligere væsentlig fordel i forhold til nuværende diagnostiske tests er LFDs evnen til at detektere aktivitet, som er indikativ for invasiv vækst af Aspergillus-arter.
Et kritisk trin i LFD fremgangsmåde er behovet for at læse resultaterne 15 minutter efter anvendelse af serum-eller BAL-prøven til anordningen. Testen bør ikke stå længere end 15 minutter før registrering af resultaterne, da dette kan skævhed resultat interpretatiden. En svag reaktion vil ikke blive forbedret ved at udvide inkubationsperioden. Varmebehandling af serum fra dyremodeller for infektion er blevet fundet at forbedre assayets følsomhed. En begrænsning af testen er, at det er kvalitativ, og er afhængig af operatøren til at foretage en subjektiv vurdering af positivitet. Intensiteten af testlinien varierer afhængigt af de antigen-indholdet i serum og BAL-prøver (figur 1). Men enhver positiv reaktion (bestemt ved sammenligning med kendte negativer) indikerer tilstedeværelsen af Aspergillus antigen og derfor infektion. For at begrænse subjektivitet LFD analyser, håndholdte enheder er til rådighed, som tillader kvantificering af LFD testlinie intensiteter og muliggøre etablering af tærskelværdier for påvisning af antigen 20.
Fremtidig udvikling af LFD omfatter kommercialisering og udviklingen af en multiplex LFD, der tillader samtidig påvisning af andre invasive patogene svampeved hjælp af meget specifikke MAbs 3.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering af Dr. Thornton fra Pfizer Limited er taknemmeligt anerkendt.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Aspergillus LFD | University of Exeter | Available from the corresponding author on request | |
RPMI-1640 | Sigma | R0883 | |
L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
Fetal calf serum | Biosera | S9100 | Other sources of fetal calf serum can be used in the preparation of TCM |
EDTA | Fisher Scientific | BPE120-1 |