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Immunology and Infection

Detecção de aspergilose pulmonar invasiva em pacientes com doença hematológica maligna usando fluxo lateral Tecnologia

doi: 10.3791/3721 Published: March 22, 2012

Summary

A rápida e precisa de teste ponto-of-care para a aspergilose pulmonar invasiva é apresentado. Leva vantagem de fluxo lateral-tecnologia, utilizando um anticorpo monoclonal específico que se liga a um

Abstract

A aspergilose pulmonar invasiva (IPA) é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em pacientes com doença hematológica maligna e tronco hematopoéticas receptores de transplantes de células 1. Detecção de IPA representa um desafio formidável de diagnóstico e, na ausência de um 'padrão de ouro', depende de uma combinação de dados clínicos e de microbiologia e histopatologia sempre que possível. Diagnóstico do IPA devem estar de acordo com a Organização Européia para Pesquisa e Tratamento do Câncer e do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas Grupo de Estudos de Micologia consenso (EORTC / MSG) definir "comprovada", "provável", e "possível" doenças invasivas por fungos 2 . Actualmente, não à base de ácido nucleico testes foram externamente validado para a detecção de IPA e para que a reacção em cadeia da polimerase (PCR) não está incluído nos actuais critérios da EORTC / MSG de diagnóstico.

Identificação de Aspergillus em cortes histológicos é problemática devido à semedades nas morfologias das hifas com outras invasoras fungos 3, e identificação comprovada exige o isolamento do agente etiológico em cultura pura. Cultura abordagens dependem da disponibilidade de amostras de biópsia, mas estes nem sempre são acessíveis em pacientes doentes, e nem sempre produzir propágulos viáveis ​​para a cultura quando obtido.

Uma característica importante na patogênese de Aspergillus é angio-invasão, uma característica que proporciona oportunidades para controlar o fungo imunologicamente por meio de testes que detectam assinaturas moléculas antigénicas características no soro e lavado broncoalveolar (LBA) líquidos. Isto conduziu ao desenvolvimento do ensaio imunoenzimático Platelia (GM-EIA) que detecta Aspergillus galactomanano e um 'pan-fúngica' ensaio (ensaio Fungitell) que detecta o componente da parede celular conservada fúngica (1 → 3)-β-D- glucano, mas não nas Mucorales que não possuem este componente em suas paredes celulares 1,4. Éprocessa em torno da precisão destes testes 1,4-6 levou ao desenvolvimento recente da próxima geração de anticorpo monoclonal (MAb)-ensaios baseados que detectam marcadores substitutos da infecção 1,5.

Thornton 5 recentemente descrita a geração de um MAb Aspergillus-específico (JF5) usando hibridoma tecnologia ea sua utilização para desenvolver um imuno-cromatografia dispositivo de fluxo lateral (LFD) para o ponto-de-cuidado (POC) diagnóstico de IPA. Uma grande vantagem do LFD é a sua capacidade para detectar a actividade desde MAb JF5 se liga a um antigénio glicoproteina extracelular que é secretado durante o crescimento do fungo activo apenas 5. Esta é uma consideração importante quando se utiliza fluidos tais como BAL pulmão para o diagnóstico de IPA desde esporos de Aspergillus são um componente comum de ar inalado. A utilidade do dispositivo para o diagnóstico de IPA foi demonstrada utilizando um modelo animal de infecção, em que o LFD exibido sensibilidade melhorada e specificity em comparação com o GM Platelia e Fungitell (1 → 3)-glucano β-D-ensaios 7.

Aqui, apresentamos um procedimento simples LFD para detectar o antígeno Aspergillus em humanos soro e fluidos BAL. Sua velocidade e precisão fornece um romance adjunto teste point-of-care para diagnóstico do IPA em pacientes com doença hematológica maligna.

Protocol

1. Recolha, Armazenamento e Preparação de soro e fluidos de lavagem broncoalveolar

  1. Recolher o soro de amostras de sangue não tratados, permitindo que o sangue coagular a 4 ° C, e soro de armazenamento, conforme alíquotas a -20 ° C antes de usar. Fluidos lavado broncoalveolar (BAL) deve também ser armazenados como alíquotas a -20 ° C. Nota: Armazenamento de soro e LBA como alíquotas limita o potencial de degradação do antigénio alvo por repetidos de congelamento-descongelamento das amostras durante a repetição do teste.
  2. As amostras descongelamento e misturar o amostras de soro e BAL completamente por vórtice e centrifugação durante 1 min a 14.000 rpm.
  3. Para os testes de rotina de amostras de soro humano, diluir a 1:01 de soro (v / v) com meio de cultura de tecidos (TCM). TCM consiste em meio RPMI-1640, 10% (v / v) de soro de vitelo fetal, 1% (v / v) de solução de L-glutamina 200mM, e azida de sódio (0,02% w / v) como conservante. O meio é preparado antecipadamente e podem ser armazenadas a 4 ° C durante vários meses. Aplicar 100 uL da diluted soro para o LFD.
  4. Para humanos fluidos BAL, e para fluidos BAL de modelos animais, aplicam-se 100 uL de amostra pura para o LFD, sem pré-tratamento.
  5. Para soro a partir de modelos animais, diluir soro 1:2 (v / v) com tampão fosfato salino contendo 4% (w / v) de EDTA, o calor para 3min num banho de água a ferver, de centrifugação durante 5 min a 14.000 rpm, e aplicar 100 ul de sobrenadante limpo para o dispositivo de LFD.

2. Aplicação de Soro e BAL para o dispositivo de fluxo lateral-

  1. Armazenar os dispositivos de fluxo lateral, à temperatura ambiente (23 ° C). A esta temperatura, os dispositivos são estáveis ​​durante 12 meses. Remova os dispositivos de suas bolsas e coloque sobre uma superfície plana.
  2. Usando uma ponta de pipeta estéril, aplicar 100 uL de pré-tratado amostra de soro ou puro BAL para a porta de libertação do dispositivo.
  3. Permitir que o ensaio para executar durante 15 min à temperatura ambiente, momento em que os resultados dos testes devem ser registados. Nota: No segundo o fluido vai ser sien migrar por acção capilar ao longo da membrana de nitrocelulose na janela de observação.

3. Gravação e Interpretação dos Resultados LFD

  1. O LFD consiste de uma linha de controlo interno (indicado pela letra C na caixa de plástico) e uma linha de teste (indicado pela letra T). A linha de controlo deve aparecer sempre independentemente do antigénio Aspergillus na amostra de soro ou BAL. Isso mostra que o ensaio foi executado corretamente.
  2. Se o antigénio Aspergillus está presente na amostra de soro ou BAL, a linha de teste também aparece dentro 15min de aplicação da amostra. Devido à intensidade da linha de teste é proporcional à quantidade de Aspergillus presente antigénio na amostra, a linha de teste pode aparecer como um positivo fraco (+), um positivo moderado (+ +) ou como uma forte positivo (+ + +) . No entanto, qualquer linha de teste positivo, independentemente da intensidade, que indicam a presença de Aspergillus antigénio na amostra. Em diaausência de antigénio e Aspergillus, nenhuma linha de teste irá aparecer, eo resultado é registado como negativo (-).

4. Os resultados representativos

Os exemplos representativos de negativas, fracamente positivo, moderada positivos, e forte positivos LFD com amostras de BAL e soro são mostrados na Figura 1.

Resultados de testes positivos de antígeno-LFD (fraca e forte) ou negativo testes LFD utilizando fluidos de BAL de leucemia mielóide aguda (LMA) dos pacientes diagnosticados de acordo com critérios da EORTC / MSG de diagnóstico são mostrados na Tabela 1. Incluem-se nesta tabela são os correspondentes clínicos e micológicos (galactomanano e cultura) de dados e resultados de um teste de PCR Aspergillus específico desenvolvido no Hospital St. Bartholomews 8, para cada paciente. O diagnóstico da doença foi baseada em fatores do hospedeiro (neutropenia, uso prolongado de corticosteróides, o tratamento com outros reconhecidos de células T immunosuppressants), os critérios clínicos e GM positividade para BAL (aqui definida como um índice GM> 0,8 valor). Sob os 2002 EORTC / MSG 10 diretrizes, os pacientes 12, 13 e 16 foram diagnosticados com IA "possível" com base em fatores do hospedeiro e os critérios clínicos ou positividade GM. De acordo com a revista (2008) EORTC / MSG diretrizes 2, fatores do hospedeiro e positividade GM isoladamente ou fatores do hospedeiro e os critérios clínicos si só, não indicam "possível" infecção fúngica invasiva, a menos que acompanhado de prova a partir de dados clínicos e micológicos, respectivamente. Paciente 6 foi diagnosticada com IA "provável" em ambos os 2002 e 2008, porque as orientações de fatores do hospedeiro, maiores e menores características clínicas e positividade GM. Note, que, embora nem o LFD nem PCR estão incluídas nas diretrizes do EORTC / MSG, há um consenso forte entre os dois ensaios eo teste de galactomanano comercial indicando a presença de Aspergillus antígeno e ácido nucléico na amostra BAL s de pacientes 6 e 12. Resultados adicionais de ensaios que demonstram a eficácia dos ensaios LFD e PCR no diagnóstico IPA podem ser encontrados em Johnson et al 8.

A Figura 1
Figura 1. Negativo (linha de controlo apenas) e positivo (de controlo e da linha de teste) os resultados dos testes LFD usando soro e BAL. As intensidades das reacções da linha de teste são proporcionais às concentrações do antigénio alvo nas amostras de soro e BAL. Reacções tipicamente variar de fraco (+) através moderada (+ +) a forte (+ + +). Independentemente da intensidade da linha de teste, todos os três séricos reacções positivas indicaria doença aspergilose invasiva pulmonar devido à presença de circulação de antigénio Aspergillus na corrente sanguínea. Positivos reacções BAL (fraco, moderado ou forte) indicaria a germinação de esporos e desenvolvimento de hifas potencialmente patogénicos nos pulmões.

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Nenhum paciente. Patiinformações ent Os critérios clínicos 1 LBA cultura 2 GM EIA índice 3 EORTC / MSG (2002) 4 EORTC / MSG (2008) 5 Aspergillus resultado da PCR Resultado LFD
6 - Principais sinais de TC (nódulo e halo) e um menor Negativo 0,9 (positivo) Provável Provável Positivo Fracamente positivo (+)
12 Presume infecção fúngica anterior Não maior, uma menor Candida glabrata 6,43 (positivo forte) Possível Nenhum Positivo Strong positivo (+ + +)
13 Staph coagulase-negativoylococcus e E. coli no sangue Não maior, menor dois Negativo 0,25 (negativo) Possível Nenhum Negativo Negativo (-)
16 Infecção no peito 3 critérios menores, incluindo derrame plural novo infiltrado mais Negativo 0,16 (negativo) Possível Nenhum Negativo Negativo (-)

1 Nódulos ou halos em uma tomografia computadorizada é sugestivo de infecção fúngica
2 Cândida glabrata no fluido BAL seria considerado como um contaminante como é o segundo de levedura mais comum isolado como parte de flora normal humanos 9
3 Um índice de> 0,8 no teste de EIA GM do LBA é indicativo de infecção por Aspergillus
4 Com base nas 2002 EORTC / MSG critérios diagnósticos para 'pose ',' provável 'ou' comprovada 'doença fúngica 10
5 Com base na revista (2008) EORTC / MSG critérios diagnósticos para 'possível', 'provável' ou 'comprovada' doença fúngica 2

Tabela 1. Resultados dos testes de LFD de amostras de LBA de pacientes com leucemia mielóide aguda com provável IPA e controle de pacientes com LMA (sem evidência de infecção), e EORTC / MSG diagnóstico de infecção.

Discussion

A identificação definitiva do IPA só pode verdadeiramente ser alcançado pelo isolamento do agente etiológico a partir de amostras de biópsia, mas a recuperação de amostras adequadas muitas vezes não é possível em pacientes muito doentes e Aspergillus é raramente recuperável a partir de sangue. Enquanto grandes avanços foram feitos no uso de tomografia computadorizada de varredura do peito no diagnóstico IPA, características que são sugestivos do IPA pulmonar, como o "halo" ou "ar crescentes" sinais são ou transitória ou pode ser atribuído a artefatos respiratórios ou outras infecções fúngicas 11,12. Tais dados são, portanto, suplementado com técnicas serológicas que visam identificar moléculas de assinatura (GM e β-glucano) a partir de fungos que são em circulação no soro do paciente ou que estão presentes nos fluidos BAL, expectoração ou amostras de urina 13. Embora estes testes exibir sensibilidade satisfatória, falta-lhes a especificidade suficiente ou se sofre de interferência sob certas condições 1,6

O teste para a detecção LFD IPA aqui apresentado permite o diagnóstico o «ponto-de-cuidado 'de IPA e exploits tecnologia que tem sido utilizada até à data em testes para a detecção de vírus, bactérias, parasitas e toxinas 14-19 e, mais notoriamente, para a gravidez em casa testa introduzido pela primeira vez por Unipath em 1988. No LFD Aspergillus descrito aqui, o Aspergillus específico MAb JF5 é imobilizado a uma zona de captação (a linha de teste) em uma membrana de nitrocelulose poroso. Imunoglobulina anti-rato imobilizado para a membrana numa zona separada serviu como um controlo interno (linha de controlo). Por adição de soro ou fluido BAL para a porta de libertação, o MAb conjugado de ouro coloidal JF5-no bloco de libertação se liga ao antigénio alvo e do complexo, em seguida, passa ao longo da membrana porosa por acção capilar. MAb JF5 imobilizado na zona de captura liga-se ao JF5-coloidal complexo ouro-antigénio, resultando em uma linha de teste vermelho. Qualquer desacoplado ouro coloidal-JF5conjugado liga-se ao controlo interno, indicando que o ensaio foi executado correctamente. Isso resulta em uma linha de controle vermelho.

O teste é rápido, tendo apenas 15 minutos para realizar, é barata em comparação com os testes de soro e BAL baseado em GM e β-glucano de detecção, e não requer equipamentos caros ou instalações laboratoriais extensas para ser executado. Além disso, o MAb JF5 não reagem de forma cruzada com as drogas ou contaminantes que foram mostrados para causar falso-positivo de reacção na GM e β-glucano testes 1,4,6. Uma vantagem adicional importante sobre os actuais testes de diagnóstico é a capacidade para detectar a actividade LFDs que é indicativo de crescimento invasivo de espécies de Aspergillus.

Um passo essencial no processo de LFD é a necessidade de ler os resultados 15 minutos após a aplicação da amostra de soro ou LBA para o dispositivo. O teste não deve ser deixada para mais de 15 min antes de gravar os resultados, como este viés de resultado pode interpretatipor diante. A fraca reação não será reforçada mediante o alargamento do período de incubação. O tratamento térmico de soro a partir de modelos animais de infecção foi encontrada para melhorar a sensibilidade do ensaio. Uma limitação do teste é que ele é qualitativa, e conta com o operador para fazer uma avaliação subjetiva de positividade. A intensidade da linha de teste varia de acordo com o conteúdo de antigénios das amostras de soro e BAL (Figura 1). No entanto, qualquer reacção positiva (determinada por comparação com negativos conhecidos) indica a presença de Aspergillus antigénio e, por conseguinte, a infecção. Para limitar a subjetividade de ensaios LFD, dispositivos portáteis estão disponíveis, que possibilita a quantificação das intensidades de linhas LFD teste e permitir o estabelecimento de limiares para a detecção de antígenos 20.

Desenvolvimentos futuros do LFD incluem a sua comercialização e no desenvolvimento de um LFD multiplex, que permite a detecção simultânea de outros agentes patogénicos fúngicos invasivasutilizando os AcM altamente específicos 3.

Disclosures

Não temos nada a divulgar.

Acknowledgments

Financiamento para o Dr. Thornton da Pfizer Limited é reconhecido agradecimento.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aspergillus LFD University of Exeter Available from the corresponding author on request
RPMI-1640 Sigma-Aldrich R0883
L-Glutamine Sigma-Aldrich G7513
Fetal calf serum Biosera S9100 Other sources of fetal calf serum can be used in the preparation of TCM
EDTA Fisher Scientific BPE120-1

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References

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Thornton, C., Johnson, G., Agrawal, S. Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology. J. Vis. Exp. (61), e3721, doi:10.3791/3721 (2012).More

Thornton, C., Johnson, G., Agrawal, S. Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology. J. Vis. Exp. (61), e3721, doi:10.3791/3721 (2012).

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