هذا التقرير وصفا للاستخدام التصوير الخلية الحية وتقنيات photobleach لتحديد التعبير السطح، ومسارات النقل وحركية الاتجار خارجيا أعرب GFP الموسومة درجة الحموضة حساسة، والبروتينات في الغشاء البلازمي للخلايا العصبية.
وصفنا ووضع استراتيجية مبتكرة لتصور مكونات غشاء البلازما الاتجار البروتين. النهج التوافقي من photobleaching التقنيات مع بروتين سبتمبر الموسومة تمكن بشكل انتقائي على أن يقسم الأحداث البلازما الإدراج غشاء. بواسطة photobleaching باستمرار بروتينات غشاء في المناطق المحيطة أثناء الانتعاش، وهي طريقة "FRAP-FLIP 'يقيم مساهمة الاتجار حويصلي إلى انتعاش مضان. هذا النهج الجديد يسمح للتسجيل المباشر لإدخال غشاء من البروتين، وتمكين كل من عدد من الغرف الفرعية حيث لوحظ انتعاش واتساع الانتعاش (ΔF) في حالة مستقرة يحدد لاحقا. كذلك، مقارنة مع FRAP ودون FLIP يسمح نسبة الانتعاش يعزى إلى انتشار الأفقي يتم حسابها.
وعلاوة على ذلك، في التجربة ذاتها، ويمكن مناطق غير photobleached التغصنات المتاخمة للمناطق المحيطة photobleached تكونتقييم نوعيا خلال الانتعاش، وفقدان مضان لوحظ في هذه المناطق سوف يكون راجعا إلى نشر الوحشي للمستقبلات photobleached في هذه القطاعات غير photobleached من التغصنات.
ويمكن استخدام هذا البروتوكول انتقائي photobleaching للتحقيق في مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية مثل الاتجار تميز excocytosis في غشاء البلازما في المناطق الفرعية محددة (على سبيل المثال التشعبات أو العمود الفقري،) FRAP أو تقييم مساهمة الجانبي نشر الإدراج مقابل عن طريق إجراء FRAP متوازية و' -FLIP 'البروتوكولات على طول التشعبات المجاورة (الشكل 3).
بوضوح، في حين تم تقديم مبادئ توجيهية محددة، وسوف تحتاج إلى كل مختبر تحسين المعلمات التصوير وفقا لنماذج محددة والمعدات. الأهم من ذلك، كل المستقبلات السطحية في العائد على الاستثمار تحتاج إلى أن تكون photobleached، مستقلة عن الطائرة Z-محور التركيز، ولكن دون وقوع خسائر كبيرة الضوئية أو photobleaching غير محددة. لناوينبغي توخي الحذر المتطلبات البيئية عند محاولة هذا البروتوكول في وسوما الخلية، حيث أن نسبة عالية من مقصورات درجة الحموضة منخفضة نسبيا داخل الخلايا عادة النتائج في مضان خلفية عالية في هذه المناطق. وعلاوة على ذلك، في حين أننا أظهرنا كيف يمكن تطبيق هذه التقنية في تختلف طرق، قبل البدء انتقائية التجارب photobleaching على جديد سبتمبر الموسومة بناء، فإننا ننصح أن تتم أولا إلى توصيف الأولي للمستقبلات المفتاحية، كما وصفها آشبي وآخرون 2.
وعموما، هذا الأسلوب هو التكيف مع قوة وتنوعا من بروتوكول FRAP القياسية، تمكن أحداث الإدراج في غشاء البلازما التي يتم تقييمها في الوقت الحقيقي القريب.
The authors have nothing to disclose.
ونحن ممتنون لويلكوم ترست والمنسق للدعم المالي. IMGG هو زميل EMBO. KLH وهو طالب دكتوراه BBSRC التي تمولها. نشكر فيليب روبين وTidball باتريك لدعم الثقافة الفنية والخلية، والدكتور أندرو دوهرتي للصيانة والمساعدة مع المجاهر.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
24mm glass coverslips | VWR International | 631-0161 | |
Poly-l-lysine | Sigma | P2636 | 1mg/ml in borate buffer to coat coverslips |
Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103 | |
B27 | Invitrogen | 17504-044 | 2% in neuronal plating and feeding medium |
Penicillin Streptomycin | Sigma | P0781 | 1% in neuronal plating and feeding medium |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 2mM / 0.8mM in plating/feeding medium |
Horse Serum | Biosera | DH-291H | 10% in neuronal plating media only |
pSIN ReP5 cloning vector | Invitrogen | K75001 | For Sindbis virus production |
LSM510 META confocal system | Zeiss | ||
Image J Software | NIH | open access software. All plugins described herein are available at http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/ |