Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

के इमेजिंग एचआईवी -1 लिफाफा प्रेरित virological Synapse और सिंथेटिक लिपिड bilayers पर संकेतन

Published: March 8, 2012 doi: 10.3791/3757
Automatic Translation
*1,2, *2,3, 1,2, 1,2, 2, 1,4
1Department of Pathology, New York University Langone School of Medicine, 2Program in Molecular Pathogenesis, Marty and Helen Kimmel Center for Biology and Medicine and Skirball Institute for Biomolecular Medicine, 3Laboratory of Molecular Immunogenetics, National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, National Institutes of Health, 4Veteran Affairs New York Harbor Healthcare System
* These authors contributed equally

Summary

यह लेख एक विधि का वर्णन करने के लिए एक एचआईवी -1 लिफाफा प्रेरित कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TIRF) द्वारा कांच समर्थित तलीय bilayers पर virological synapse के गठन कल्पना. विधि भी immunofluorescence धुंधला के साथ संयुक्त किया जा सकता है. सक्रियण और संकेतन अणुओं है कि एचआईवी -1 लिफाफा प्रेरित virological synapse गठन के दौरान होने की पुनर्वितरण का पता लगाने.

Abstract

मानव इम्यूनो वायरस टाइप 1 (एचआईवी -1) के संक्रमण कोशिका 2,10,11 प्रसारण करने के लिए सेल के माध्यम से सबसे अधिक कुशलता से होता है. सीडी 4 के बीच सेल हस्तांतरण + टी कोशिकाओं के लिए यह सेल virological (वी.एस.) synapse है, जो एफ actin पर निर्भर सेल सेल CD4 और के साथ संक्रमित कोशिका पर एचआईवी -1 gp120 लिफाफा की सगाई पर गठित जंक्शन के गठन शामिल है chemokine (CKR) रिसेप्टर CCR5 लक्ष्य 8 सेल पर या CXCR4. इसके अलावा gp120 करने के लिए और उसके रिसेप्टर्स, अन्य झिल्ली प्रोटीन, विशेष रूप से आसंजन अणु LFA-1 और उसके ligands में, ICAM परिवार, वी.एस. गठन और वायरस संचरण में एक प्रमुख भूमिका निभा रूप में वे वायरस से संक्रमित दाता कोशिकाओं की सतह पर मौजूद हैं और लक्ष्य कोशिकाओं, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एचआईवी -1 1,4,5,6,7,13 virions के लिफाफे पर. वी.एस. गठन भी intracellular संकेत घटनाओं है कि अपने रिसेप्टर्स की gp120 - सगाई का एक परिणाम के रूप में transduced रहे हैं के साथ है. दरअसल, हम हाल ही में पता चला है कि सीडी 4 है <sup> gp120 साथ + टी सेल बातचीत और संकेत TCR signalosome LCK सहित, CD3ζ, ZAP70, अक्षां, SLP-76, Itk, और 15 PLCγ के साथ जुड़े अणुओं की भर्ती की phosphorylation लाती है.

इस अनुच्छेद में, हम एक supramolecular व्यवस्था और झिल्ली समीपस्थ संकेतन वी.एस. गठन के दौरान हो रही घटनाओं की कल्पना विधि प्रस्तुत करते हैं. हम गिलास समर्थित न्यूनकारी वायरल gp120 लिफाफा और सेलुलर आसंजन अणु ICAM-1 असर एचआईवी संक्रमित कोशिकाओं की सतह का प्रतिनिधित्व करने के लिए मॉडल के रूप में planar द्वि परत प्रणाली का लाभ ले लो. प्रोटोकॉल बातचीत कोशिकाओं पर intracellular संकेतन अणुओं का पता लगाने के लिए एचआईवी -1 gp120 प्रेरित वी.एस. विधानसभा और संकेत सक्रियण की घटनाओं में शामिल हैं, कि मैं) द्वि परत और एक प्रवाह कक्ष में तैयारी विधानसभा ii) कोशिकाओं के इंजेक्शन और immunofluorescence धुंधला निगरानी के लिए सामान्य प्रक्रियाओं का वर्णन एचआईवी -1 gp120 और ICAM-1 द्वि - परतों पर, iii) TIRF माइक्रोस्कोपी द्वारा छवि अधिग्रहण के साथ एकएन डी) डेटा विश्लेषण चार. इस प्रणाली पारंपरिक प्रणाली सेल सेल के साथ प्राप्त परे है कि वी.एस. इंटरफ़ेस के उच्च संकल्प छवियों को उत्पन्न के रूप में यह इन उप डोमेन के लिए भर्ती विशिष्ट संकेतन अणुओं के साथ साथ वी.एस. की व्यक्तिगत आणविक घटकों के विशिष्ट समूहों का पता लगाने की अनुमति देता है.

Protocol

1. Gp120 लेबल

इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया फ्लोरोसेंट रंजक प्रोटीन के लिए बाध्य करने के लिए प्रभावी रहे हैं, माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए फोटो स्थिर पर्याप्त हैं, और हमारे खुर्दबीन के साथ उपलब्ध लेजर की उत्तेजना तरंगदैर्य मैच. इन तीन मानदंडों को पूरा करने की जरूरत है जब टैगिंग प्रोटीन के लिए फ्लोरोसेंट अणु का चयन.

  1. विनिमय उनकी gp120 DH12 (डॉ. माइकल चो, आयोवा स्टेट यूनिवर्सिटी से एक उपहार) प्रोटीन बाँझ पीबीएस बफर एक केन्द्रापसारक फिल्टर यूनिट (30 केडीए MWCO) का उपयोग करते हुए 6 टैग. सुनिश्चित करें कि एकाग्रता gp120 अधिक से अधिक 1 मिलीग्राम / एमएल नहीं है. नोट: उनके 6 टैग अन्य X4 या R5 रेखा उपभेदों से gp120 प्रोटीन भी परीक्षण किया गया है और अब इम्यून टेक्नोलॉजीज से वाणिज्यिक उपलब्ध हैं.
  2. अपने प्रोटीन समाधान के लिए सोडियम बिकारबोनिट पीएच 9.0 सोडियम बिकारबोनिट की ~~ 8.5 पीएच के साथ 50mm अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए.
  3. Amine प्रतिक्रियाशील एलेक्सा 488 Fluor (AF488) फ्लोरोसेंट रंजक, जो di जोड़ेंएक 10 गुना दाढ़ अतिरिक्त पानी में ssolved. 1-2 घंटे के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर इस मिश्रण को सेते हैं.
  4. अतिरिक्त डाई को निकालने के लिए, पहले के रूप में केन्द्रापसारक फिल्टर यूनिट का उपयोग और स्तंभ के ताजा बाँझ पीबीएस जोड़ने. इस चरण को दोहराएँ जब तक सभी मुक्त डाई (4 मिलीलीटर पीबीएस के साथ 3-4 washes के) निकाल दिया जाता है. नीचे स्पिन जब तक gp120 के बारे में 1 मिलीग्राम / एमएल के लिए ध्यान केंद्रित किया है. नोट: डायलिसिस या केन्द्रापसारक फिल्टर इकाई द्वारा मुक्त डाई हटाना ही काम करता है अगर डाई पानी में घुलनशील है, या किसी और जेल निस्पंदन इस्तेमाल किया जा सकता है.
  5. लेबल प्रोटीन (एफ / पी) के प्रोटीन के अणु प्रति प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के लिए, फ्लोरोसेंट रंजक (माइक्रोन) में उपयुक्त (उदाहरण के लिए, 488 AlexaFluor के लिए 488 एनएम) तरंगदैर्ध्य और प्रोटीन में (का उपयोग हम सांद्रता का निर्धारण एक NanoDrop प्रोटीन और लेबल 'सेटिंग) का उपयोग कर और फिर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर इन दो तुम अनुपात / एफ पी देने संख्या विभाजित करते हैं. एक ही प्रक्रिया ICAM-1 और Cy5 जैसे अन्य प्रोटीन और रंजक के लिए प्रयोग किया जाता है. नोट: spectroph के अन्य प्रकार केotometers प्रोटीन एकाग्रता और फ्लोरोसेंट रंजक एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए अनुपात / एफ पी प्राप्त अगर एक NanoDrop उपलब्ध नहीं है के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

2. प्रवाह सेल विधानसभा और bilayer तैयारी

प्रवाह सेल और bilayer तैयारी के लिए सामान्य प्रक्रिया पहले से 14 विस्तार में वर्णित किया गया है. यहाँ हम विशेष रूप से उनके 6 टैग gp120 DH12 युक्त एक Bioptech प्रवाह सेल पर bilayers तैयार प्रोटोकॉल रूपरेखा. संक्रामक वायरस या संक्रमित कोशिकाओं को शामिल अध्ययन के लिए और जब छोटी मात्रा में आवश्यक सीमित अभिकर्मकों, एक डिस्पोजेबल Ibidi प्रवाह कक्ष (चिपचिपा स्लाइड मैं 0.2 Luer) के कारण कर रहे हैं और इस्तेमाल किया जा सकता है वही द्वि परत हैं 2.4-2.9 चरण में तैयार करने की प्रक्रिया के साथ पीछा किया. Ibidi प्रवाह कक्षों के लिए जानकारी कंपनी की वेबसाइट से प्राप्त किया जा सकता है http://www.ibidi.com/service/display_material/CA_8p_EN_150dpi.pdf

  1. Pirhana (45 मिलीलीटर सल्फ्यूरिक एसिड (ट्रेस धातु ग्रेड 98%) और 15 मिलीग्राम 30% हाइड्रोजन पेरोक्साइड) समाधान 14 तैयार करें. प्लास्टिक clamps के साथ विसर्जित कवर 15 मिनट के लिए Pirhana समाधान में निकल जाता है.
  2. पिका - शुद्ध जल से भरा बीकर में निकल जाता है कवर और 2 मिनट (प्रत्येक पक्ष पर एक मिनट) के लिए पानी चल रहा है के तहत हर एक को धोने के लिए स्थानांतरण. सूखी रैक पर रखें.
  3. इकट्ठे Bioptechs FCSII कक्षों के रूप में पहले 14 में वर्णित है.
  4. एक liposome 12.5% ​​युक्त मिश्रण 2 नी + chelating lipids पर कब्जा करने और उनकी 6-gp120 पेश bilayer सतह पर 16 के लिए प्रयोग किया जाता है है. Microaqueduct स्लाइड पर कांच के टिप को छू के बिना liposome मिश्रण का 1 μl बूँदें जोड़ें. प्रवाह कोशिका प्रति 5 bilayers की अधिकतम तैयार करने के लिए, 4 से अधिक बार दोहराना इतना है कि वहाँ पाँच 1μl डॉट्स के रूप में 14 पहले से दिखाया.
  5. Lipids के शीर्ष पर कवर पर्ची रखें. एक स्टेनलेस स्टील सीएल के साथ कवर सफेद को बनाए रखना अंगूठीamp के आधार इकाई, पर पूरे तंत्र फ्लिप और सील. मार्क bilayers के एक मार्कर के साथ स्थान. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं.
  6. दो तरह से पानी निकलने की टोंटी बाईं छिड़काव ट्यूब के साथ टयूबिंग देते हैं, के रूप में वीडियो में दिखाया गया. टयूबिंग के अंत में उस पर 50 मिलीलीटर 10x HBS [10x: 3 - जिस तरह से पानी निकलने की टोंटी (टयूबिंग पहले किया गया है (HBS) HEPES-buffered खारा मानव सीरम albumin (HSA) (HBS / HSA से युक्त से भरा है के साथ एक सकारात्मक नवचंद्रक उत्पन्न HEPES खारा बफर: 200 मिमी HEPES, पीएच 7.2, 1.37 एम NaCl, 50 मिमी KCl, 7 2 4 HPO ना मिमी, 60 मिमी D ग्लूकोज] 20 मिलीलीटर 25x HSA, 500 μl 1M 2 CaCl 1 मिलीग्राम, एम 1 2 MgCl और DH 2 0 500ml और फिल्टर 0.22μm फिल्टर के साथ) के लिए कुल मात्रा लाने के लिए और बुलबुले से रहित है सही छिड़काव ट्यूब टयूबिंग कनेक्ट और धीरे प्रवाह सेल के माध्यम से बफर धक्का.
  7. ब्लॉक ~ कैसिइन के 300 μl 100 माइक्रोन 1 मिलीलीटर सिरिंज भरने और 3 तरह से पानी निकलने की टोंटी के खुले हिस्से के लिए संलग्न द्वारा 2 NICL युक्त साथ bilayer. जनरलtly के माध्यम से बफर धक्का और सिरिंज disengaging से पहले दोनों stopcocks बंद. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
  8. उनके 6 टैग AF488 लेबल gp120 (एकाग्रता निर्धारित किया जाता है के रूप में 16 में पहले से वर्णित) जोड़ें. हम ~ 2 gp120/μm के 250 अणुओं का उपयोग लि एचआईवी -1 में virion 17 सतह पर पाया समूहों की स्थानीय घनत्व नकल के. इसी तरह, हम bilayer ~ 250 अणुओं / माइक्रोन 2 ICAM - 1 उपयोग के रूप में पहले से 14 की सूचना दी. प्रवाह सेल में लोड के रूप में कैसिइन के साथ किया. अंधेरे में 30 मिनट (पन्नी के साथ कवर) कमरे के तापमान पर के लिए सेते हैं. एक ही प्रक्रिया के लिए उनकी 12 टैग bilayer पर ICAM-1 Cy5 लेबल के रूप में अन्य प्रोटीन को शामिल करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
  9. बफर के 5 मिलीलीटर के साथ bilayers धो लें.

3. FRAP के माध्यम से bilayers की गुणवत्ता नियंत्रण

Bilayers में प्रोटीन के laterally प्रसारण होना चाहिए. Bilayers पर कोशिकाओं को जोड़ने से पहले, यह महत्वपूर्ण है आश्वासनbilayer में तैयार प्रोटीन की गतिशीलता. यहाँ हम (FRAP) 3 तरीका है कि सबसे TIRF, व्यापक क्षेत्र epifluorescence, या लेजर प्रबुद्ध confocal सूक्ष्मदर्शी स्कैनिंग उद्देश्य पर मैन्युअल रूप से प्रदर्शन किया जा सकता है Photobleaching के बाद एक फ्लोरोसेंट वसूली का वर्णन. लक्ष्य छवि लिपिड bilayer, ब्लीच एक स्थान, और अणुओं की unquenched प्रक्षालित क्षेत्र में लौटने की निगरानी में पूरी तरह से वर्दी प्रतिदीप्ति के क्षेत्रों के लिए है. 2 मिनट में 50% की वसूली स्वीकार्य हो सकता है. सभी प्रमुख माइक्रोस्कोप निर्माताओं (Leica, Nikon, ओलिंप, Zeiss) उद्देश्य प्रबुद्ध TIRF प्रणाली है कि इस आवेदन के लिए अच्छी तरह से काम करते हैं बेचते हैं. जबकि प्रत्येक कंपनी TIRF रोशनी और अन्य परिचालन विशेषताएं बदलाव प्रदान करता है, छवि गुणवत्ता को अनिवार्य रूप से एक ही है.

  1. विरंजन कम से कम एक कम उत्तेजना तीव्रता का प्रयोग. एनए 1,3 करने के लिए 1,45 40x 60x, या 100x के रूप में एक उच्च उद्देश्य संख्यात्मक एपर्चर का उपयोग करें. जब एक मानक फ्लोरोसेंट या TIRF माइक्रोस्कोप का उपयोग कर, प्रकाश intens को कम करनेअल्पसंख्यक, उत्तेजना प्रकाश पथ में तटस्थ घनत्व फिल्टर डाल दिया. अधिकांश लेजर प्रणाली कम वोल्टेज के साथ एक acusto ऑप्टिकल tunable के AOTF () फिल्टर या acusto ऑप्टिकल बीम फाड़नेवाला (AOBS) की स्थापना द्वारा कम रोशनी के लिए सेट किया जा सकता है.
  2. एक "पूर्व ब्लीच" छवि रिकार्ड. यदि एक ठंडा सीसीडी कैमरे का उपयोग कर, कम प्रकाश स्थितियों binning के लिए क्षतिपूर्ति 2x2 या 4x4 के लिए सेट किया जा सकता है, लाभ के उच्च, या लंबे समय तक जोखिम (सेकंड के आदेश पर उदाहरण के लिए) सेट किया जा सकता है इस्तेमाल किया जा सकता है. एक confocal का उपयोग अगर, pinhole एपर्चर खोला जा सकता है; लाभ उच्च सेट, और धीमी गति स्कैनिंग या प्रयोग किया जाता औसत.
  3. एक स्थान ब्लीच. एक मानक प्रतिदीप्ति या TIRF माइक्रोस्कोप का उपयोग अगर, एन डी फिल्टर को दूर करने के लिए अधिकतम तीव्रता रोशनी के लिए अनुमति देने के लिए, क्षेत्र डायाफ्राम को बंद करने, और कुछ सेकंड के लिए नमूना बेनकाब. यदि एक confocal स्कैनिंग लेजर का प्रयोग, लेजर शक्ति और लगभग 8x एक स्थान ब्लीच करने के लिए 4x में अधिकतम जूम सेट. Confocal उपयोग के लिए चेतावनी: बहुत अधिक में ज़ूम नहीं है क्योंकि bilayer exces द्वारा क्षतिग्रस्त किया जा सकता हैsively फोटॉनों ध्यान केंद्रित किया.
  4. दस से पंद्रह सेकंड के अंतराल पर, 3.1 और 3.2 में रिकॉर्ड छवियों के रूप में एक ही रोशनी और रिकॉर्डिंग सेटिंग्स का उपयोग कर. दो से तीन मिनट के भीतर जगह है कि "पूर्व ब्लीच" छवि की आ तीव्रता को ठीक करना चाहिए. त्वरित वसूली एक सफल मोबाइल bilayer का संकेत है. यदि स्थान अंधेरा रहता है, और विशेष रूप से उच्च विपरीत अगर बढ़त बरकरार रखती है, फ्लोरोसेंट प्रोटीन bilayer में स्थिर कर रहे हैं और प्रयोग के लिए नहीं किया जाना चाहिए.

नोट: हमारे वर्तमान खुर्दबीन में, हम 240 2 माइक्रोन का एक क्षेत्र है जो कम से कम 4 सेकंड में ठेठ सांद्रता में फ्लोरोसेंट ICAM bleaches के साथ 641 एनएम के प्रकाश की 0.9 मेगावाट एक परिपत्र स्थान के लिए वितरित कर सकते हैं. पाठकों विरंजन 30 सेकंड से कम समय के लिए एक repeatable ढंग से इस परख प्रदर्शन करने के लिए पर्याप्त से अधिक है के साथ एक पारा या Xe दीपक महत्वपूर्ण है कि संरेखण का पता लगाना चाहिए. हम भी आप अतिरिक्त det के लिए संदर्भित करने के लिए 3 उल्लेख होगाबीमारी.

4. कक्ष और immunofluorescence धुंधला इंजेक्शन

  1. 37 डिग्री सेल्सियस (यह कोई सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में के बारे में 30 मिनट के लिए किया जा सकता है) गर्म प्रवाह सेल.
  2. 1 मिलीलीटर सिरिंज द्वारा सक्रिय मानव HBS / ~ 400 μl HSA में सीडी 4 + टी कोशिकाओं (6 प्रवाह / 2 5x10 सेल) जोड़ें. चलो सेल ~ 37 ° सी इनक्यूबेटर में 45 मिनट के लिए bilayer देते हैं. यदि Ibidi कक्षों का उपयोग किया जाता है, अतिरिक्त बफर हर 15-20 मिनट आपूर्ति.
  3. 2% paraformaldehyde के इंजेक्शन लगाने के द्वारा कोशिकाओं को ठीक करें और 37 पर 10 मिनट के लिए सेते हैं ° सी.
  4. 1ml कमरे के तापमान पीबीएस बफर के साथ 3x धो लें. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 0.1% ट्राइटन X-100 इंजेक्शन लगाने के द्वारा कोशिकाओं Permeabilize.
  5. 1ml (phosphorylated प्रोटीन के लिए जांच, जब आप सोडियम वैनेडेट 1mm अंतिम या पीबीएस में एक और फॉस्फेट अवरोध करनेवाला एकाग्रता में जोड़ने के लिए प्रसंस्करण के दौरान फॉस्फेट हटाने को रोकने के कर सकते हैं) कमरे के तापमान पीबीएस बफर के साथ 3x धो लें. 5% बकरी सीरम के साथ कैसिइन का उपयोग करने के लिए ब्लॉककमरे के तापमान पर 25 मिनट. माध्यमिक एंटीबॉडी पशु सीरम के प्रकार पर निर्भर करता है.
  6. कमरे के तापमान पीबीएस बफर के 1 मिलीग्राम के साथ 3x धो लें. 1 घंटे कमरे के तापमान पर - ~ 30 मिनट के लिए 300 μl / बफर प्रवाह सेल में प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें. प्रारंभिक सक्रियण झिल्ली समीपस्थ संकेत है पता लगाने के, हम phosphorylated लिए (pLck) LCK, LCK कुल या फ़िन विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करें.
  7. कमरे के तापमान पीबीएस बफर के 1 मिलीग्राम के साथ 3x धो लें. बफर में उचित fluorescently लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में जोड़ें प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ किया. हमारे प्रयोगों के लिए, हम एलेक्सा Fluor उपयोग बकरी विरोधी खरगोश माध्यमिक 568 लेबल. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए सेते हैं. पीबीएस बफर के 1 मिलीग्राम के साथ 3x धो लें.
  8. नोट: यह आवश्यक है कि केवल माध्यमिक एंटीबॉडी (कोई प्राथमिक एंटीबॉडी) के साथ व्यवहार किया जाता है एक नियंत्रण bilayer है. में 4.1-4.5 कदम और 4.6 छोड़ का पालन करें, तो 4.7 कदम के साथ आगे बढ़ना. यह गैर विशिष्ट अपने माध्यमिक एंटीबॉडी के बंधन के स्तर को निर्धारित करेगा. वैकल्पिक रूप से, एक सीधे लेबल का उपयोग कर सकते हैंएड प्राथमिक एंटीबॉडी.

5. TIRF माइक्रोस्कोपी द्वारा छवि अधिग्रहण

TIRF माइक्रोस्कोपी फ्लोरोसेंट एक 250 एनएम या ग्लास सब्सट्रेट और सेल इंटरफ़ेस में पतली विमान तक सीमित संकेतों की उत्तेजना की अनुमति देता है. यह केवल संकेतों के लिपिड bilayer और तुरंत के लिए apposed कोशिका झिल्ली से छवि अधिग्रहण की गारंटी देता है. इसलिए, synapse में केवल अणुओं है imaged. TIRF चित्र केवल सेल के नीचे झिल्ली समीपस्थ क्षेत्र क्योंकि, प्रोटीन है कि भली भाँति या पृष्ठीय झिल्ली में पुनः वितरित कर रहे हैं पाया नहीं किया जाएगा. यह तो महत्वपूर्ण हो करने के लिए अतिरिक्त मानक widefield या संचय या synaptic क्षेत्र में प्रोटीन का वितरण निर्धारित करने के लिए के रूप में सेल के अन्य संस्करणों की तुलना में confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा छवियों को प्राप्त कर सकते हैं.

सभी प्रमुख माइक्रोस्कोप निर्माताओं (Leica, Nikon, ओलिंप, Zeiss) उद्देश्य प्रबुद्ध TIRF प्रणाली है कि इस एपी के लिए अच्छी तरह से काम करते हैं बेचते हैंतह. जबकि प्रत्येक कंपनी TIRF रोशनी और अन्य परिचालन विशेषताएं बदलाव प्रदान करता है, छवि गुणवत्ता को अनिवार्य रूप से एक ही है. प्रत्येक TIRF खुर्दबीन ऑपरेशन के लिए अपने स्वयं के विवरण है, लेकिन निम्नलिखित सामान्य नियमों के लिए उच्च संकल्प इमेजिंग प्राप्त करने के लिए लागू होते हैं.

  • रोशनी विरंजन से बचने के लिए कम होना चाहिए.
  • कैमरा एक रेखीय प्रतिक्रिया होनी चाहिए.
  • कैमरा नहीं संतृप्ति के साथ एक व्यापक गतिशील रेंज इमेजिंग के लिए सक्षम होना चाहिए.
  • सभी सेटिंग्स मात्रात्मक विश्लेषण के लिए लगातार सेट किया जाना चाहिए.

6. डेटा विश्लेषण

Intracellular + टी सेल बातचीत gp120 साथ वी.एस. में सीडी 4 का एक परिणाम के रूप में सक्रिय संकेतों का अध्ययन करने के लिए, TIRF छवियों की मात्रात्मक विश्लेषण LCK और फ़िन कर रहे हैं और सक्रिय और 15 गुणसूत्रीयसंयोजन के लिए भर्ती किया जाए या नहीं के रूप में intracellular संकेतन अणुओं का निर्धारण किया जाता है. यहाँ हम एक सरल सबसे छवि विश्लेषण के लिए लागू विधि का वर्णनआवेदन संकुल ऐसे ImageJ और Metamorph रूप में. हम हमारे यहाँ विधि 12 के लिए, जो Windows, Macintosh, और Linux पर चलाता है ImageJ, का इस्तेमाल किया है.

विश्लेषण> सेट माप टैब में, क्षेत्र के लिए चेक बक्सों और ग्रे मूल्य मतलब है. जब आप छवि है कि एक बहुभुज या एक का पता लगाया बंद आकार मुक्तहस्त पर ब्याज की एक क्षेत्र बनाने के लिए और> उपाय नहीं है विश्लेषण, सॉफ्टवेयर एक परिणाम तालिका में इस माप से डेटा रखा जाएगा. क्षेत्र पिक्सेल की संख्या में या 2 माइक्रोन में होगा. मीन मनमाना इकाइयों में औसत तीव्रता है. यह पृष्ठभूमि से subtracted तीव्रता होना चाहिए. क्षेत्र द्वारा मतलब ऋण पृष्ठभूमि गुणा मनमाना इकाइयों में प्रोटीन की एकीकृत तीव्रता देता है.

  1. माप सेट मतलब करने के लिए और क्षेत्र के लिए.
  2. एक प्रयोगात्मक हालत के लिए छवियों को खोलें.
  3. प्रत्येक कक्ष के लिए पता लगा, और ब्याज (मतलब) के क्षेत्र को मापने के लिए और पता लगाने और ब्याज (पृष्ठभूमि) के क्षेत्र के बाहर एक क्षेत्र को मापने.
  4. जब एक प्रयोगात्मक शर्त के साथ किया, या तो प्रतिलिपि माप और एक्सेल या अन्य स्प्रेडशीट प्रोग्राम में चिपकाएँ या माप को बचाने.
  5. प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए 6.2 कदम लौटें.
  6. जब माप पूरा कर रहे हैं, परिणाम की गणना. सूत्र होते हैं:
    पृष्ठभूमि औसत तीव्रता = मतलब
    एकीकृत तीव्रता = टूटने की तीव्रता * क्षेत्र

7. प्रतिनिधि परिणाम

वी.एस. पर gp120 साथ बातचीत का एक परिणाम के रूप में सक्रियण और प्रारंभिक झिल्ली समीपस्थ LCK संकेतन अणुओं और फ़िन की भर्ती के उपाय, प्राथमिक मानव सीडी 4 + टी कोशिकाओं gp120 और ICAM - 1 15 असर bilayers पर शुरू किए गए थे. Bilayers के लिए केवल ICAM-1 के साथ शुरू की कोशिकाओं संकेत के बेसल स्तर को परिभाषित करने के लिए एक नियंत्रण के रूप में सेवा की. Specific प्रतिदीप्ति तीव्रता gp120 संपर्क क्षेत्र के भीतर ICAM bilayer-1 के साथ बातचीत की कोशिकाओं के लिए gp120 और ICAM-1 युक्त bilayers और पूरे संपर्क क्षेत्र के भीतर कोशिकाओं के लिए मापा गया था. औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता की वृद्धि हुई है संवर्धित का एक संकेत है भर्ती और वी.एस. के लिए संकेत अणु की सक्रियता है. यह आगे एकीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता में एक तुलनीय वृद्धि के द्वारा प्रदर्शन किया जाएगा. यदि फिर भी, वहाँ एकीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता में कोई परिवर्तन नहीं है, यह संकेत अणु के एक पुनर्वितरण इंगित करता है.

के बाद कोशिकाओं gp120 और ICAM-1, LCK कुल pLck (Y394) युक्त bilayers वी.एस. इंटरफ़ेस के साथ बातचीत करने के लिए भर्ती किया गया और gp120 (Figs. 1 & 2) के साथ colocalized. कुल का औसत LCK तीव्रता छवि (1) अकेले ICAM-1 से युक्त bilayer दोनों gp120 और ICAM-1 पर अधिक था, लेकिन एकीकृत तीव्रता के स्तर छवि (1) समान थे, सुझाव है कि LCK में पुनः वितरित है+ टी सेल CD4 gp120 करने के लिए बाध्य पर एक केंद्रीय क्लस्टर. हालांकि, pLck (Y394) (छवि 2) की मात्रा का ठहराव से पता चला है कि gp120 और ICAM-1 युक्त bilayers औसत तीव्रता ICAM 1 अकेले bilayers पर है कि अधिक से अधिक था, और एकीकृत तीव्रता दोनों gp120 ICAM और के साथ bilayers पर अधिक था -1 से ICAM 1 अकेले bilayers पर. यह है कि इंगित करता है, जबकि इंटरफेस में LCK कुल का स्तर कोशिकाओं में समान हैं gp120 और ICAM-1 और ICAM 1 अकेले bilayers, gp120 सक्रियण पाश LCK पर बाध्यकारी Y394 अवशेषों की वृद्धि की phosphorylation पर पालन. इसके विपरीत, वी.एस. फ़िन नहीं भर्ती छवि (3) किया गया था, के रूप में अधिक फ़िन कोशिकाओं के संपर्क में क्षेत्र में ICAM 1 दोनों gp120 और ICAM-1 युक्त bilayers पर से अकेले bilayers पर मौजूद था. नतीजतन, हम निष्कर्ष है कि, नहीं LCK फ़िन, एचआईवी -1 gp120 प्रेरित वी.एस. में सक्रिय kinase है.

आंकड़े: झिल्ली समीपस्थ पर सिगनल एचआईवी -1 gp120 प्रेरित वी.एस.. पर प्रतिनिधि कोशिकाओं की छवियाँgp120 + ICAM-1 (शीर्ष पैनल) bilayer और ICAM - 1 bilayer (नीचे पैनलों) दिखाए जाते हैं. व्यक्ति की कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति तीव्रता सेल पैरों के निशान के मैन्युअल का पता लगाया क्षेत्रों के भीतर मात्रा के रूप में चित्र 1 में पीले रंग की लाइन के साथ चिह्नित क्षेत्र द्वारा सचित्र है. औसत और एकीकृत TIRF माइक्रोस्कोपी द्वारा पता लगाया तीव्रता की मात्रा छोड़ दिया और सही रेखांकन में प्रस्तुत कर रहे हैं, क्रमशः. हर हालत के लिए 30 से 350 कोशिकाओं की कुल मात्रा गया. बार्स = 5 माइक्रोन. तीन दोहराने प्रयोगों से डेटा दिखाए जाते हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1 सीडी 4 + टी कोशिकाओं gp120 और ICAM 1 या ICAM 1 - 45 मिनट के लिए अकेले युक्त bilayers पर शुरू किए गए थे और फिर तय LCK कुल के लिए दाग.

चित्रा 2
चित्रा 2 सीडी 4 + टी कोशिकाओं bilayer पर पेश किए गएgp120 और ICAM-1 या ICAM-1 अकेला और 45 मिनट के लिए तो तय युक्त और pLck (Y394) के लिए दाग.

चित्रा 3
चित्रा 3 सीडी 4 + टी कोशिकाओं gp120 और ICAM 1 या ICAM 1 - 45 मिनट के लिए अकेले युक्त bilayers पर शुरू किए गए थे और फिर तय की और कुल फ़िन के लिए दाग.

Discussion

पिछले अध्ययनों में कल्पना वी.एस. सेल सेल संयुग्म प्रणाली है, लेकिन इन अध्ययनों के लिए पर्याप्त उच्च संकल्प छवियों को प्रदान नहीं synapse में supramolecular संरचनाओं कल्पना. हमारी प्रयोगशाला में, हम गिलास समर्थित तलीय bilayer प्रणाली का उपयोग करने के लिए संक्रमित वायरस लिफाफा gp120 और सेलुलर आसंजन अणु ICAM-1 व्यक्त कोशिकाओं की सतह का प्रतिनिधित्व. TIRF माइक्रोस्कोपी, जो एक उच्च संकेत से शोर अनुपात के साथ bilayer सतह से 100-200 एनएम के भीतर प्रतिदीप्ति संकेत का पता लगाता है के साथ संयोजन के रूप में, हम ICAM-1 से वी.एस. पर gp120 की supramolecular अलगाव का पता लगाने में सक्षम थे. इसके अलावा, मानक Immunostaining विधि bilayer प्रणाली को लागू किया जा सकता है और यहां इस्तेमाल किया गया था का पता लगाने और LCK सक्रिय की विशिष्ट भर्ती यों, लेकिन नहीं फ़िन क्षेत्र gp120 15 वी.एस. पर संपर्क करने के लिए,. इसलिए, तलीय bilayer TIRF सूक्ष्म से एक 2d हवाई जहाज़ में एक गुणसूत्रीयसंयोजन इंटरफ़ेस का उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए एक प्रायोगिक प्रणाली प्रदान करता हैscopy, के रूप में अच्छी तरह से व्यापक क्षेत्र या confocal रोशनी के तरीके के रूप में. हालांकि, इस प्रणाली को भी ligand गतिशीलता का समायोजन, झुकने बाहर के विमान के रूप में सीमाएँ हैं, और जैविक झिल्लियों के उतार चढ़ाव तलीय bilayers द्वारा reproduced नहीं कर रहे हैं. इसके अलावा, इस प्रणाली में इन विट्रो और इसलिए अन्य झिल्ली अणुओं है कि एक संक्रमित कोशिका cytoskeleton है और मशीनरी है कि आणविक गतिशीलता और सेलुलर गतिशीलता को नियंत्रित पर उपस्थित होना होगा की कमी के रूप में अन्य सीमाओं,. इसके अलावा, अणु, जैसे trimers बनाम gp120 की monomers, गतिशीलता और वितरण physiologically bilayer पर प्रतिनिधित्व नहीं किया जा सकता है. फिर भी, इन सीमाओं के साथ भी, इस प्रणाली को अभी भी बहुत मूल्यवान है वायरस सेल या सेल सेल बातचीत के अध्ययन के लिए, और इन तरीकों के शोधकर्ताओं ने उच्च संकल्प छवियों की मांग कर रहे हैं supramolecular संगठन का पता लगाने के लिए एक उपयोगी गाइड के रूप में सेवा कर सकते हैं कि प्रत्यक्ष नहीं है पारंपरिक सेल सेल संयुग्म प्रणाली में.

Disclosures

लेखकों हितों का कोई संघर्ष की घोषणा.

Acknowledgments

यह काम एनआईएच AI071815 अनुदान (CEH) और रोडमैप Nanomedicine विकास केंद्र PN2EY016586 पुरस्कार (एमएलडी) द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
His tagged HIV gp120 Gift from Dr. Cho DH12
His tagged HIV gp120 Immune Technology Various X4 or R5 tropic
HSA Williams Medical Company 521302 Human Serum Albumin 25%
Amicon Ultra Centrifugal Filters EMD Millipore UFC803024 Ultracel-30K
Lck Rabbit mAb Cell Signaling Technology 2787
p-Lck Rabbit pAb Santa Cruz Biotechnology, Inc. Sc-101728 Tyr 394
Fyn Rabbit mAb EMD Millipore 04-353
Alexa Fluor 568 2° Ab Molecular Probes, Life Technologies A11034 Goat anti-Rabbit IgG (H+L)
Alexa Fluor 488 Molecular Probes, Life Technologies A-20000 carboxylic acid succinimidyl ester
FCS2 Chamber Bioptechs 060319-2-03
Microaqueduct Slide Bioptechs 130119-5
30mm Round w/holes Bioptechs 1907-08-750 0.75mm thick
Rectangle Gasket Bioptechs 1907-1422-250 14x24 0.25mm thick
Tygon Tubing Bioptechs 20202275 1/16" (25ft)
Three-way Stopcock Bio-Rad 7328103
Two-way Stopcock Bio-Rad 7328102
Sticky Slide I 0.2 Luer Ibidi 80168
Cover glasses Ibidi 10812
1ml syringe BD Biosciences 309659
DOGS-NTA Avanti Polar Lipid, Inc 790404C
DOPC Avanti Polar Lipid, Inc 850375C
Glass coverslip Bioptechs 40-1313-0319 40mm
TIRF microscope Nikon Instruments
ImageJ National Institutes of Health http://rsbweb.nih.gov/ij/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bastiani, L., Laal, S., Kim, M., Zolla-Pazner, S. Host cell-dependent alterations in envelope components of human immunodeficiency virus type 1 virions. J. Virol. 71, 3444-3450 (1997).
  2. Dimitrov, D. S., Willey, R. L., Sato, H., Chang, L. J., Blumenthal, R., Martin, M. A. Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 infection kinetics. J. Virol. 67, 2182-2190 (1993).
  3. Dustin, M. L. Adhesive Bond Dynamics in Contacts between T Lymphocytes and Glass-supported Planar Bilayers Reconstituted with the Immunoglobulin-related Adhesion Molecule CD58. J. Biol. Chem. 272, 15782-15788 (1997).
  4. Fortin, J. F., Cantin, R., Lamontagne, G., Tremblay, M. Host-derived ICAM-1 glycoproteins incorporated on human immunodeficiency virus type 1 are biologically active and enhance viral infectivity. J. Virol. 71, 3588-3596 (1997).
  5. Frank, I., Stoiber, H., Godar, S., Stockinger, H., Steindl, F., Katinger, H. W., Dierich, M. P. Acquisition of host cell-surface-derived molecules by HIV-1. Aids. 10, 1611-1620 (1996).
  6. Hioe, C. E., Bastiani, L., Hildreth, J. E., Zolla-Pazner, S. Role of cellular adhesion molecules in HIV type 1 infection and their impact on virus neutralization. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 14, Suppl 3. S247-S254 (1998).
  7. Hioe, C. E., Chien, P. C., Lu, C., Springer, T. A., Wang, X. H., Bandres, J., Tuen, M. LFA-1 expression on target cells promotes human immunodeficiency virus type 1 infection and transmission. J. Virol. 75, 1077-1082 (2001).
  8. Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse. J. Exp. Med. 199, 283-293 (2004).
  9. Jolly, C., Mitar, I., Sattentau, Q. J. Requirement for an intact T-cell actin and tubulin cytoskeleton for efficient assembly and spread of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 81, 5547-5560 (2007).
  10. McDonald, D., Wu, L., Bohks, S. M., KewalRamani, V. N., Unutmaz, D., Hope, T. J. Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions. Science. 300, 1295-1297 (2003).
  11. Pearce-Pratt, R., Malamud, D., Phillips, D. M. Role of the cytoskeleton in cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus. J. Virol. , 682898-682905 (1994).
  12. Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. (1997).
  13. Rizzuto, C. D., Sodroski, J. G. Contribution of virion ICAM-1 to human immunodeficiency virus infectivity and sensitivity to neutralization. J. Virol. 71, 4847-4851 (1997).
  14. Vardhana, S., Dustin, M. Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse. J. Vis. Exp. (19), e947-e947 (2008).
  15. Vasiliver-Shamis, G., Cho, M. W., Hioe, C. E., Dustin, M. L. Human immunodeficiency virus type 1 envelope gp120-induced partial T-cell receptor signaling creates an F-actin-depleted zone in the virological synapse. J. Virol. 83, 11341-11355 (2009).
  16. Vasiliver-Shamis, G., Tuen, M., Wu, T., Starr, T., Cameron, T., Thomson, R., Kaur, G., Liu, J., Visciano, M., Li, H., Kumar, R., Ansari, R., Han, D., Cho, M., Dustin, M. L., Hioe, C. E. Human immunodeficiency virus type 1 envelope gp120 induces a stop signal and virological synapse formation in noninfected CD4+ T cells. J. Virol. 82, 9445-9457 (2008).
  17. Zhu, P., Liu, J., Bess, J., Chertova, E., Lifson, J., Grise, H., Ofek, G., Taylor, K., Roux, K. Distribution and three-dimensional structure of AIDS virus envelope spikes. Nature. 441, 847-852 (2006).

Tags

इम्यूनोलॉजी 61 अंक TIRF माइक्रोस्कोपी तलीय bilayer एचआईवी लिफाफा virological synapse
के इमेजिंग एचआईवी -1 लिफाफा प्रेरित virological Synapse और सिंथेटिक लिपिड bilayers पर संकेतन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Prins, K. C., Vasiliver-Shamis, G.,… More

Prins, K. C., Vasiliver-Shamis, G., Cammer, M., Depoil, D., Dustin, M. L., Hioe, C. E. Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers. J. Vis. Exp. (61), e3757, doi:10.3791/3757 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter