Summary
目前的研究，介绍了胰腺人类胚胎干细胞分化诱导定向分化的方法。具有重要意义的发现，血管内皮细胞共培养介导派生为胰岛素表达细胞的胰腺祖细胞的人类胚胎干细胞的成熟。
Abstract
胚胎干细胞（ESC）上有两个主要特点是：它们可以无限期地在体外培植，在未分化的状态，他们是多能干细胞，因而有可能分化成多种细胞。这种特性使胚胎干细胞非常有吸引力的基于细胞治疗和再生治疗应用1。然而，对于充分发挥其潜力，实现细胞分化成成熟和功能的表型，这是一项艰巨的任务。诱导细胞分化的一个很有前途的方法是在体外设置紧密地模仿器官的路径。胰腺癌的发展被称为发生在特定的阶段，开始与内胚层，它可以发展成多个器官，包括肝脏和胰腺。内胚层诱导可以通过调制节点的通路，通过另外一个3激活素，多种生长因子结合4-7 8环杷此外，它可以在体外抑制胰腺癌的承诺。是由几个平行的事件，包括抑制Notch信号通路介导胰腺成熟;胰腺祖细胞聚集成3维簇;诱导的血管;仅举几例。远远的ESC源性胰岛祖细胞体外成熟的最成功的已实现通过抑制Notch信号DAPT作用补充9。虽然成功了，这个结果中低产减少功能的成熟型。研究较少的地方，是内皮细胞在胰腺成熟细胞信号，这是越来越多地被作为一个重要的因素在体内胰岛成熟10,11赞赏的效果。
目前的研究，探讨内皮素等的影响人类ESC源性胰腺祖细胞的成熟胰岛素的胰岛样细胞胶质细胞信号。我们报告一个多阶段的人类胚胎干细胞首次对胚层诱导激活素抑制PI3K通路的一个定向分化协议。胰腺内胚层细胞的规范实现随着维甲酸诱导此外维甲酸抑制环杷刺猬信号。成熟的最后阶段被诱导内皮细胞共培养的配置实现信号。虽然一些内皮细胞已在共同的文化测试，在此我们提出我们的数据与大鼠心脏微血管内皮细胞（RHMVEC），主要是为便于分析。
Protocol
1。细胞维持
- H1的人类胚胎干细胞（WiCell）均保持在合格的人类胚胎干细胞基底膜涂井mTeSR1媒体，与媒体每天都在变化。井被涂上稀释在25毫升的培养液中加入300μL的人类胚胎干细胞基底膜基底膜解决方案的准备，F12键。被添加到每个六孔板以及1毫升本matrigel的解决方案，或400μL加入到12孔板的每个井，并允许在室温下1小时大衣。机械代细胞刮，一旦他们达到了1至直径1.5mm的殖民地，在分流比为1:4。
- RHMVEC（血管内皮细胞技术）保持MCDB上-131媒体与媒体改变隔日。细胞分裂由胰蛋白酶，一旦达到80％汇合，分流比为1:3。通道3和7之间的内皮细胞被用于这项研究。
2。储备溶液的制备
- 激活素A改组为50微克/毫升无菌带够学士含0.1％牛血清白蛋白。解决的办法是分装并储存于-20°C
- 表皮生长因子在500微克/毫升无菌10毫米醋酸进行了改组。解决的办法是分装并储存于-20°C
- 在10毫克/毫升的胰岛素，重组加入酸化H2O（pH值≤2），由0.1毫升冰醋酸10毫升的水，除了准备。
- DAPT作用进行了改组在DMSO在18毫克/毫升。进一步稀释到300μM浓度的DMEM：F12键，分装和储存在-20°C
- 在DMSO在5mg/ml KAAD环杷被改组。进一步稀释到2μM浓度的DMEM：F12键，分装和储存在-20°C
- 全反式维甲酸在2.7毫克/毫升95％的乙醇进行了改组。它被进一步稀释至2MM浓度的DMEM：F12键，分装和储存在-80°C。
3。明确的内胚层（DE）和胰腺祖（PP）的感应
- 一旦ĤESC键殖民地达到1至直径1.5mm，加入DMEM培养液进行德感应：F12键补充B27的0.2％BSA的100毫微克/毫升，激活素A和1μM的4天渥曼青霉素（0天4日）与媒体每天都在变化。
- 德感应完成后，诱导胰腺祖细胞诱导培养液通过改变媒体：B27的0.2％BSA和0.2μM浓度为24小时（日4日5）KAAD环杷明在F12键补充。
- 媒体24小时后改为DMEM培养基：F12辅以B27的0.2％BSA，0.2μM的浓度，浓度在2μm的全反式维甲酸与媒体每天为3天（5天，8天）KAAD环杷。
4。胰腺成熟
- 聚丙烯诱导后，各组分别改为成熟媒体组成的DMEM：F12键补充B27的钠，0.2％BSA，10毫米的烟，25微克/毫升胰岛素，30纳米2 SEO 3和50微克/毫升转2天媒体ays改变每天（8天，10天）。
- 经过2天的成熟媒体，最终成熟的第一步是进行并行使用几个不同的条件下进行比较。根据下列条件：（一）缺口抑制剂DAPT作用（二）使用联合培养媒体只，无内皮细胞作为对照组及（iii）使用RHMVEC细胞接触共培养诱导分化。细胞维持在一个星期（10日17日）与媒体每天DAPT作用或联合培养媒体。
- DAPT作用媒体准备补充DAPT作用的成熟媒体30微米。第一次接触这个群体中的细胞24小时内完成MCDB131，然后暴露于DAPT作用媒体为6天（11天17天）。
- 合作文化传媒准备补充MCDB上-131媒体与B27的0.2％BSA，10毫米的烟，10纳克/毫升表皮生长因子，1微克/毫升氢化可的松，10毫克EndoGro，90微克/毫升的肝素。对媒体的控制条件下的分化细胞暴露MCDB上完全培养基-131（10日11日）24小时后，媒体被改变为6天（11天17天）（内皮细胞）共培养媒体。
- 接触共培养条件下，一百万RHMVEC添加到完整MCDB上131媒体24小时的分化细胞（血管内皮细胞技术）（10日11日）允许附件。 24小时后，媒体被改变为6天（11天17天），与媒体的合作，文化传媒每天都在变化。
5。 QRT-PCR分析
- 在每个阶段的分化（内胚层，胰腺祖成熟胰岛）年底裂解和RNA的提取使用NucleoSpin RNA II提取试剂盒，根据制造商的指示。
- RNA的质量进行检查，随后通过RNA科学研究SmartSpec Plus分光光度计使用量化RNA的吸光度在260 nm和280 nm。
- 逆转录使用ImProm II逆转录ķ它根据制造商的指示。所有的反应进行了100纳克的RNA。
- 根据制造商的指示使用的Mx3005P QPCR系统（安捷伦）和辉煌II的SYBR Green QPCR的主混合QRT-PCR进行。表1列出所用的引物。初始化步骤进行，在50°C为10分钟，95℃2分钟。 50个扩增循环如下：95℃30秒，54°，30秒和72℃1分钟，
- 倍的目标mRNA表达的变化是未分化的细胞，从CT值使用下列公式计算：
的ΔCT（标记我 ）= CT诊断（标记我 ） - CT（GAPDH的）
Δ的ΔCT（标记I）=的ΔCT（标记）（样本） -的ΔCT（标记）（未分化的细胞）
相对表达（标记）= 2-ΔΔCT（标记）
6。免疫组化
- 细胞在分化的每个阶段结束（内胚层，胰腺祖成熟胰岛）被固定在4％多聚甲醛在室温为15分钟。
- 透固定细胞，用0.25％的Triton X-100（TX）的15分钟。
- 非特异性染色被挡在10％驴血清孵育30分钟TX的0.05％。
- 初级抗体孵化一夜之间在4°C推荐抗体稀释（见表1）在阻塞缓冲区。
- 细胞用0.05％的TX 3次5分钟。
- 一小时，在黑暗与相应的抗体封闭液稀释的二级抗体在室温下进行孵化。
- 细胞用0.05％的TX 3次5分钟。
- 赫司特进行核染色染色在1:1000稀释在PBS孵育用PBS洗涤5分钟。
- 固定和染色细胞成像使用奥林巴斯IX81倒置显微镜和Metamorph成像软件。
7。代表结果
此外激活和Wortmannin 4天的未分化的胚胎干细胞诱导明确的内胚层QRT-PCR分析证实“Sox17德标记”，CXCR4，和FOXA2 Sox17免疫如图2所示。胰腺祖细胞标记和免疫组织化学染色为图3所示为PDX1 QRT-PCR证实了胰腺祖细胞分化后，除了环杷和维甲酸。
在分化的最后阶段，联系RHMVEC强烈的人类胚胎干细胞衍生的胰腺祖细胞诱导胰岛素表达上调的细胞共培养。合作文化介导的分化效率，通过共同分析mparing与控制条件下使用DAPT作用。 DAPT作用是用来作为阳性对照，因为它是目前使用最广泛的实现胰腺成熟的方法之一。由于共同的文化支持因素，血管内皮细胞补充修改后的媒体，与媒体进行额外的控制，在内皮细胞的情况下，以验证媒体上分化的影响。这一分析的详情载于图4。
图1。多阶段的人类胚胎干细胞分化为胰岛素表达细胞的协议。
图2。明确的内胚层诱导人类胚胎干细胞。一）QRT-PCR分析代表性DE暴露激活素A和渥曼青霉素4天的胚胎干细胞的标记。结果AR é正常化方面未分化的胚胎干细胞。乙）Sox17染色（绿）和DAPI（蓝色）显示Sox17核表达。比例尺：50微米。
图3。胰源性内胚层细胞的胚胎干细胞的祖细胞诱导。一）在胰腺癌早期人类胚胎干细胞衍生的内胚层细胞暴露环杷和维甲酸4天德诱导后，标记的QRT-PCR分析。结果未分化的胚胎干细胞正常化。二）PDX1染色（紫色）和DAPI（蓝色）显示PDX1核表达。比例尺：50微米。
图4。胰腺成熟阶段）QRT-PCR分析人类胚胎干细胞的胰腺激素胰腺癌使用DAPT作用成熟后，与媒体联合培养或联合培养（对照组）。结果未分化的胚胎干细胞正常化。 P值获得学生t-检验。 B）与DIL-AC-LDL标记RHMVEC（红色）共培养内皮细胞附着板，如果有空白（顶部）显示区域，被发现在其他RHMVEC可以区分ESC（底部）直接接触。 c）C-肽（绿色）染色分化细胞共培养方法。比例尺：12.5微米（顶部）和50微米（底部）四）RHMVEC的免疫染色表明胰岛素表达没有在RHMVEC的。
| 标记 | primer1（5'至3'）</ TD> | primer2（5'至3'） | 价 |
| SOX17 | CTCTGCCTCCTCCACGAA | CAGAATCCAGACCTGCACAA | 12 |
| CXCR4的 | CACCGCATCTGGAGAACCA | GCCCATTTCCTCGGTGTAGTT | 4 |
| FOXA2 | GGAGCGGTGAAGATGGAA | TACGTGTTCATGCCGTTCAT | 12 |
| 含PDX1 | AAGTCTACCAAAGCTCACGCG | GTAGGCGCCGCCTGC | 4 |
| PTF1 | CATAGAGAACGAAACCACCCTTTGAG | GCACGGAGTTTCCTGGACAGAGTTC | 12 |
| HLXB9 | CACCGCGGGCATGATC | ACTTCCCCAGGAGGTTCGA | 4 |
| HNF6 | TGTGGAAGTGGCTGCAGGA | TGTGAAGACCAACCTGGGCT | 5 |
| PAX6的 | CGAATTCTGCAGGTGTCCAA | ACAGACCCCCTCGGACAGTAAT | 5 |
| NKX6.1 | AGACCCACTTTTTCCGGACA | CCAACGAATAGGCCAAACGA | 5 |
| ISL1 | GATCTATGTCACCTCGCAAGG | TACAACCACCATTTCACTG | 12 |
| 胰高血糖素 | AGGCAGACCCACTCAGTGA | AACAATGGCGACCTCTTCTG | 4 |
| 胰岛素 | AAGAGGCCATCAAGCAGATCA | CAGGAGGCGCATCCACA | 12 |
表1。用于定量PCR反应的引物。
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Discussion
胰腺发育期间，胰腺细胞的分化是在靠近主动脉内皮细胞;此外，胰岛细胞密集的血管，促进血糖和胰岛激素的迅速交流。鉴于这些事实，这并不奇怪，内皮细胞在胰腺器官的过程中发挥重要作用。虽然胰腺发育过程中血管内皮细胞的重要性日益受到重视，及其在胚胎干细胞体外分化中的作用研究。在我们前面的报告中，我们建立了小鼠胚胎干细胞的13对胰腺癌成熟内皮细胞的积极作用。在目前的研究中，我们探讨人类胚胎干细胞分化的内皮细胞信号转导的影响。
在本协议中使用多个内皮细胞，这导致类似的整体效果althouGH的分化效率的变化。在目前的报告中，我们提出的大鼠心脏微血管内皮细胞（RHMVEC）合作培养的人类胚胎干细胞源性胰腺祖细胞的影响。 AC-LDL的染色，这是具体的只有内皮细胞，内皮细胞，可以很方便的可视化。预染的内皮细胞分化的胚胎干细胞共培养结果显示，而血管内皮细胞的最可行的文化很长一段时间，RHMEV逐渐消失后4天，再也不能成熟后6天检测。缺席的RHMVEC简化消除需要排序的分析，从而为文化合作协议的优化选择。
虽然目前的研究清楚地表明，内皮细胞的诱导胰腺癌成熟的积极作用，这种诱导的确切机制仍是未知的，目前在我们的实验室研究。对Fe瓦特合理的机制可能是：（一）细胞分泌的分子（二）血管内皮细胞介导的抑制Notch信号（三）由内皮细胞分泌的细胞外基质的作用效果。第一类，而并不需要细胞与细胞接触，这种接触是强制性的第二和第三类。因此，我们进行了一些初步的分析，采用不同的合作文化配置：（一）接触共培养（二）Transwell小合作，文化及（iii）空调的媒体文化。据观察，接触共培养，导致最大的差异，作为判断胰岛素表达;由Transwell小室共培养;媒体的文化条件，而导致对胰岛素的表达（数据未显示）的影响最小。这些分析表明，而细胞与细胞接触是重要的，可能会有一些短暂的分泌，以及重要的分子。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
我们承认美国国立卫生研究院新的创新奖DP2 116520 ORAU拉尔夫·鲍威青年教师提升奖的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mTeSR1 (with supplement) | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| hESC qualified matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| DMEM:F12 | Invitrogen | 11330-032 | |
| MCDB-131 | Invitrogen | 10372019 | |
| MCDB-131 (Complete) | VEC Technologies | MCDB-131 | |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | 100ng/ml |
| Wortmannin | Invitrogen | W3144 | 1μM |
| KAAD-Cyclopamie | Sigma-Aldrich | C4116 | 0.2μM |
| All-Trans Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R2625 | 2μM |
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | 30μM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 30 nM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I1882 | 25 μg/ml |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | 50 μg/ml |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | 10ng/ml |
| EndoGro | VEC Technologies | ENDOGRO | 10mg |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 90μg/ml |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 1μg/ml |
| NucleoSpin RNA II | Macherey-Nagel | 740955 | |
| ImProm II reverse transcription System | Promega Corp. | A3800 | |
| Brilliant II SYBR Green QPCR master mix | Stratagene, Agilent Technologies | 600548 | |
| Sox17 goat polyclonal IgG | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-17355 | 1/500 |
| PDX1 goat polyclonal IgG | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-14662 | 1/500 |
| C-Peptide Rabbit polyclonal | Cell Signaling Technology | 4593 | 1/500 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-21206 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-goat IgG | Invitrogen | A-21447 | 1/1000 |
| Table 2. Reagents and Kits | |||
References
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