Analyse de l'interaction avec la chromatine Tag appariés Fin de séquençage (Chia-PET) pour la cartographie des interactions Chromatine et transcription Comprendre le règlement

Summary

Analyse de l'interaction de la chromatine par Tag appariés Fin de séquençage (Chia-PET) est une méthode pour

Abstract

Les génomes sont organisés en structures tridimensionnelles, l'adoption d'un ordre supérieur conformations à l'intérieur des espaces de taille micronique nucléaires ^{7, 2, 12.} De telles architectures ne sont pas aléatoires et font intervenir des interactions entre les promoteurs des gènes et des éléments régulateurs ^13. La liaison des facteurs de transcription à des séquences régulatrices spécifiques provoque un réseau de régulation de la transcription et la coordination ^{1, 14.}

Analyse de l'interaction de la chromatine par Tag appariés Fin de séquençage (Chia-PET) a été développé pour identifier ces structures chromatiniennes d'ordre supérieur ^5,6. Les cellules sont fixées et en interaction locus sont capturés par covalentes ADN-protéine liaisons transversales. Pour minimiser la non-spécifique du bruit et de réduire la complexité, ainsi que d'augmenter la spécificité de l'analyse de l'interaction de la chromatine, immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est utilisé contre les facteurs protéiques spécifiques pour enrichir des fragments de chromatine d'intérêt avant la ligature de proximité. La ligature impliquant demi-linkers fait suite liaisons covalentes entre des paires de fragments d'ADN attachés ensemble au sein de complexes chromatiniens individuels. Les sites d'accompagnement MmeI enzymes de restriction dans les linkers demi-permettre l'extraction de paires de balise de fin-linker-tag constructions (PET) sur la digestion MmeI. Comme les linkers sont des demi-biotinylé, ces constructions en PET sont purifiés en utilisant la streptavidine-billes magnétiques. Les PET purifiés sont ligués avec des adaptateurs de séquençage de nouvelle génération et un catalogue des fragments d'interaction est généré par l'intermédiaire de la prochaine génération des séquenceurs tels que l'analyseur de Génome Illumina. Cartographie et analyse bioinformatique est ensuite réalisée afin d'identifier ChIP-enrichi sites de liaison et de ChIP-enrichis interactions chromatine ^8.

Nous avons produit une vidéo pour démontrer les aspects critiques du protocole de Chia-PET, en particulier la préparation de la puce comme la qualité de ChIP joue un rôle majeur dans l'issue d'une bibliothèque Chia-PET. Comme les protocoles sonttrès longtemps, seules les étapes critiques sont montrées dans la vidéo.

Protocol

A. immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) (voir Figure 1)

1. Réticulation double de la chromatine protéines liées et récolte des cellules

(À 02:10 de la vidéo)

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est la première étape critique impliqué dans la construction d'une bibliothèque Chia-PET. Cette étape est importante pour réduire le niveau de bruit de fond de la complexité, et d'ajouter une spécificité. La préparation de ChIP devra être optimisé pour le type de cellule et le facteur d'intérêt. Ce protocole est basé sur l'ARN polymérase II Chia-PET bibliothèque préparée à partir de cellules MCF-7 ⁹ construits dans notre laboratoire. Pour veiller à ce que la bibliothèque qui en résulte est d'une complexité suffisante, nous vous recommandons d'utiliser 1 x 10 ⁸ cellules pour préparer le matériel ChIP. En fonction de la ligne de cible et la cellule, le rendement obtenu peut être comprise entre 100 ng à 300 ng. Nous recommandons que un minimum de 100 ng ChIP devrait être utilisé pour construct une bibliothèque Chia-PET avec des cycles de PCR de moins de 20 pour réduire la redondance au cours de séquençage. Des quantités plus élevées de matériel puce permettra de nouvelles réductions dans la redondance, l'amélioration de la qualité des bibliothèques.

1. Laver 1 x 10 ⁸ cellules MCF-7 (l'équivalent de cinq à 500 cm ² plaques carrées de 2 x 10 ⁷ cellules) à deux reprises avec tampon phosphate salin (PBS) pré-chauffé à 37 ° C.
2. Crosslink cellules MCF-7 avec 1,5 mM fraîchement préparée éthylglycol bis (succinimidylsuccinate) (EGS)) pendant 45 minutes à température ambiante (22 ° C) avec la rotation dans une hotte.
3. Ajouter le formaldéhyde 37% à une concentration finale de 1% pendant 20 minutes à température ambiante (22 ° C) avec la rotation dans une hotte.

4. Étancher les agents de réticulation en ajoutant 2 M de glycine à une concentration finale de 200 mM. Incuber pendant 10 minutes à température ambiante(22 ° C) avec la rotation.

5. Jeter réticulants trempés dans un flacon de déchets et laver les cellules deux fois avec du PBS froid.
6. Jeter PBS et les cellules de récolte par grattage. Gardez cellules récoltées sur la glace. Rincer la plaque avec 5ml de PBS (les inhibiteurs de protéase ("+ PI") a été ajouté selon les instructions du fabricant) pour maximiser la collecte de cellules.
7. Pellet les cellules à 1800 xg (3000 tours par minute) pendant 10 minutes à 4 ° C. Rejeter le surnageant et procéder à la lyse cellulaire. Sinon, stocker le culot à -80 ° C.

2. Lyse cellulaire

(À 04:15 de la vidéo)

1. Resuspendre le culot dans 15 ml de tampon de lyse SDS à 0,1% (50 mM HEPES pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1% de Triton X-100, le désoxycholate de sodium 0,1%, 0,1% SDS + PI) à fond par pipetage. Tourner pendant 15 minutes à 4 ° C.
2. Pellet lysées cellules de 800 xg (2,000 rpm) pendant 10 minutes à 4 ° C.
3. Rejeter le surnageant et répéter la lyse des cellules une fois comme pour l'étape 2.1 et 2.2.
4. Le nucléaire isolée culot est prêt pour la lyse nucléaire. Alternativement, silo à granulés à -80 ° C.

3. Lysis nucléaire

(À 05:00 de la vidéo)

Lyse nucléaire est effectuée pour libérer la chromatine réticulé avant fragmentation de la chromatine. En l'absence de membrane nucléaire, la chromatine réticulé peut être traité par ultrasons en utilisant douces conditions. Parfois, la force sonication peut-être pas suffisante pour briser la membrane nucléaire et dans ce cas, moins la chromatine sera obtenue parce que le noyaux intacts seront jetés après centrifugation. Cependant, différents types de cellules peuvent exiger des conditions différentes.

1. Resuspendre noyaux isolés culot dans 15 ml 1% de SDS Lysis Buffer (50 mM pH 7,5 HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% de Triton X-100, de sodium 0,1% Deoxycholate, 1% SDS + PI). Transfert de suspension noyaux à une haute vitesse-tube à centrifuger (tubes Oak Ridge Centrifugeuse (polypropylène)) et faire tourner pendant 15 minutes à 4 ° C.
2. Pellet lysées noyaux de bouletage à 47810 xg (20.000 tpm) pendant 30 minutes à 4 ° C.
3. Décanter le surnageant et pause culot avec une pipette P1000.
4. Laver culot avec 30 ml 0,1% SDS Lysis Buffer (+ PI).
5. Tourner pendant 15 minutes à 4 ° C.
6. Pellet chromatine au 47810 xg (20.000 tpm) pendant 30 minutes à 4 ° C.
7. Rejeter le surnageant et répéter laver une fois comme pour l'étape 3.4 à 3.6 avant de procéder à fragmentation de la chromatine. Alternativement, magasin de chromatine culot à -80 ° C.

4. La fragmentation de la chromatine

(À 07:03 de la vidéo)

1. Transfert chromatine granulés à un tube en polystyrène ronde essai de 14 ml à fond.
2. Ajouter 1 ml SDS à 0,1% Lysis Buffer (+ PI) à la chromatine pellet. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles dans le mélange, car cela affecterait l'efficacité sonication.
3. Cisaillement chromatine-ADN à une taille de 200 à 600 paires de bases avec un Branson numérique Sonifer Disrupter mobile (35% d'amplitude, 9 minutes (30 secondes sur, 30 secondes réduite)) et conserver des échantillons à froid, à tout moment pour empêcher la surchauffe en effectuant l' sonication dans une chambre froide (voir Figure 2).
4. Reverse-réticuler une partie aliquote de la chromatine et vérifier l'efficacité de la fragmentation avec les étapes suivantes. (Les étapes suivantes ne sont pas montrées dans la vidéo).
   • Aliquote de 10 pl de la chromatine après sonication.
   • Centrifugeuse soniqué chromatine au 16110 xg (13.200 tpm) pendant 5 minutes à 4 ° C.
   • Transférer le surnageant dans un nouveau tube et ajouter 2 pi de solution de protéinase K.
   • Incuber pendant 30 minutes à 50 ° C.
   • Résoudre inverser réticulé chromatine sur un gel d'agarose 1,5%.
   • REPEAsonication t si les tailles de l'ADN sont plus importantes que prévu.
5. Centrifuger lysat restant à 16110 xg (13.200 tpm) pendant 30 minutes à 4 ° C et le transfert de la chromatine soniquée (surnageant) dans un nouveau tube avant précontrôle avec des billes magnétiques. Alternativement, magasin soniqué chromatine à -80 ° C jusqu'à ce que la chromatine est suffisante pour commencer à recueillir une puce.

5. Lavage, précontrôle et de revêtements de l'anticorps à Perles

(À 08:17 de la vidéo)

1. Précontrôle de la chromatine
   1. Utilisez 300 pi de billes magnétiques aux protéines G pour une adresse IP.
   2. Laver trois fois avec 5 perles Perles ml du tampon de lavage (PBS, 0,1% de Triton X-100). Cette lavages et futurs impliquant magnétiques protéines G perles comprend les étapes suivantes. Assurez-billes magnétiques ne se dessèchent pas.
      • Reclaim perles en utilisant un concentrateur de particules magnétiques.
      • Discard surnageant.
      • Remettre en suspension des perles avec un tampon.
      • Tournez pendant 5 minutes à 4 ° C.
      • Centrifuger à 129 xg (800 rpm) pendant 1 minute à 4 ° C.
      • Reclaim perles en utilisant un concentrateur de particules magnétiques.
      • Rejeter le surnageant.
   3. Combinez la chromatine soniqué avec des perles prélavées, pour enlever la liaison de fond de la chromatine à des billes.
      • Gardez 10 pl de la chromatine soniqué comme "entrée" pour le contrôle de l'enrichissement ultérieur par PCR quantitative (qPCR). Conserver à 4 ° C.
   4. Tourner la nuit à 4 ° C.
   5. Centrifugeuse soniqué chromatine à 129 xg (800 rpm) pendant 1 minute à 4 ° C.
   6. Placer le tube sur le concentrateur de particules magnétiques.
2. Anticorps revêtement à des billes magnétiques
   1. Aliquoter 300 pi de billes magnétiques aux protéines G dans un nouveau tube.
   2. Laver trois fois avec des perles de tampon de lavage 5ml Perles (PBS, 0,1% de Triton X-100).
   3. Ajouter un volume équivalent (comme à l'étape 5.1.3) de solution de lavage Perles tampon.
   4. Ajouter 35 pg de l'ARN polymérase II (8WG16) anticorps monoclonal.
   5. Tourner la nuit à 4 ° C.
   6. Laver recouvertes d'anticorps perles deux fois avec 5 ml de tampon de lavage Perles.
   7. Récupérer l'anticorps billes revêtues à l'aide d'un concentrateur de particules magnétiques.

6. Immunoprécipitation de la chromatine

(À 10:03 de la vidéo)

Pour réduire le niveau de complexité et de bruit de fond, des anticorps contre les facteurs protéiques spécifiques sont utilisées pour enrichir des fragments de chromatine spécifiques d'intérêt avant le ⁶ ligature de proximité.

Ici, nous avons utilisé une souris ARN polymérase II monoclonalAnticorps (8WG16) qui reconnaît la forme d'initiation de la protéine. Par fragments d'ADN enrichissantes qui sont associés à l'ARN polymérase II, la spécificité de la bibliothèque peut être augmentée, permettant l'identification des interactions à longue portée chromatine entre les promoteurs actifs et de leurs correspondants des régions régulatrices ^9.

1. Supprimer le tampon de lavage de l'anticorps de billes revêtues à l'aide d'un concentrateur de particules magnétiques.
2. Transfert soniqué chromatine (surnageant de l'étape 5.1.6) à l'aide du concentrateur de particules magnétiques recouvertes d'anticorps à billes (à partir de l'étape 5.2.7).
3. Tourner la nuit à 4 ° C.

7. Lavage et élution de l'ADN immunoprécipités complexes protéine-

(À 11:13 de la vidéo)

1. Laver la chromatine immunoprécipitées perles trois fois avec 5 ml de tampon de lyse SDS à 0,1%.
2. Laver perles fois avec 5 ml de sel tampon de lavage haute (50 mM HEPES pH 7,5, 350 mM de NaCl, 1 mM d'EDTA, de 1% Triton X-100, désoxycholate de sodium 0,1%, 0,1% de SDS).
3. Laver une fois avec 5 perles ml de tampon de lavage Lithium Chlorure (10 mM Tris pH 8,0, 250 mM LiCl, EDTA 1 mM, 0,5% de Nonidet P-40, le désoxycholate de sodium 0,5%).
4. Jeter le tampon de lavage et remettre en suspension billes lavées avec 1 ml de tampon TE.
5. Tournez pendant 5 minutes à 4 ° C. L'échantillon est prêt pour la quantification et la vérification d'enrichissement ChIP. Une fois que les copeaux suffisante a été recueilli, l'échantillon est prêt à être construit dans une bibliothèque Chia-PET. Cette étape est essentielle, et doit être fait pour assurer le succès de la construction de bibliothèques Chia-PET. ChIP-enrichis perles peuvent être stockés pour un maximum de 2 semaines à 4 ° C tout en subissant la quantification, le contrôle d'enrichissement ChIP, et l'accumulation de suffisamment de matériel.
   1. Eluer et inverse-réticulation "entrée" de l'ADN et de ChIP-enrichis de perles avec les étapes suivantes. (Les étapes suivantes ne sont pas montrées dans la vidéo.)
      • Éluer 20% de ChIP-enrichis avec 200 billes tampon ChIP élution ul (50 mM Tris pH 8,0, EDTA 10 mM, SDS 1%). Tourner pendant 30 minutes à 37 ° C. Centrifuger perles éluées à 6100 xg (800 rpm) pendant 1 minute à 4 ° C. Transfert éluées complexes puce (surnageant) dans un nouveau tube à l'aide du concentrateur de particules magnétiques.
      • Complexes ChIP Reverse-réticulation "entrée" et éluée avec 2 pi Protéinase K (concentration finale de 0,2 g / ml) pendant 2 heures à 50 ° C.
      • Transfert inverse réticulé "entrée" de l'ADN et l'ADN ChIP éluée dans un 2 ml à haute densité MaXtract (respectivement). Ajouter 200 ul 25:24:1 pH alcool au phénol-chloroforme-Isoamyl 7,9 à des tubes dans une hotte et inverser pour bien mélanger. Faites tourner les tubes pendant 5 minutes à 16110 xg (13.200 rpm) à température ambiante.
      • Transfert supérieure phase aqueuse dans un nouveau tube et précipiter l'ADN d'inverser l'esprit réticuléh 20 pi 3 M pH acétate de sodium 5.5, 200 ul d'isopropanol et 1 pi 15 mg / ml Glycoblue. Incuber à -80 ° C pendant 30 minutes et le culot d'ADN pendant 30 minutes à 16110 xg (13.200 rpm) à 4 ° C.
      • Après la centrifugation d'ADN précipité l'isopropanol, laver culot d'ADN avec 75% éthanol glacé à deux reprises et remettre en suspension dans 20 culot d'ADN tampon TE ul.
   2. Quantifier "entrée" d'ADN (de l'étape 5.1.3) et de l'ADN par ChIP PicoGreen dosage ^10.
   3. Effectuer un contrôle d'enrichissement par l'intermédiaire PCR qualitative (qPCR).

B. Analyse Interaction chromatine en utilisant Tag Paired-End de séquençage (Chia-PET)

La seconde moitié de la vidéo mettra en évidence les principales étapes de la construction d'une bibliothèque Chia-PET.

1. Fin-émoussement de fragments d'ADN ChIP

Ce chapitre de la vidéo met en évidence deux mpoints de Ain, une procédure étape par étape de lavage de billes magnétiques pour enlever les enzymes et sel tampon de la réaction précédente (étape 1.1, 12:22-12:54 de la vidéo) et la procédure de mise en place de réactions enzymatiques impliquant des billes magnétiques dans le mélange réactionnel (étape 1.2, 12h54-13h25 de la vidéo).

1. Lavez-ChIP enrichis perles une fois avec du tampon glacé TE. Cette lavages et futurs impliquant des billes magnétiques se composent des étapes suivantes.
   • Centrifuger à 6100 xg (800 rpm) pendant 1 minute à 4 ° C.
   • Reclaim perles en utilisant un concentrateur de particules magnétiques.
   • Rejeter le surnageant.
   • Ajouter un tampon à billes.
   • Mélanger perles avec un tampon en tapotant l'action.
   • Centrifuger à 6100 xg (800 rpm) pendant 1 minute à 4 ° C.
   • Reclaim perles en utilisant un concentrateur de particules magnétiques.
   • Rejeter le surnageant.
2. Pour combler en soniqué overhaNGS, préparer un Master-Mix avec 70 pi x 10 tampon pour l'ADN polymérase T4, 7 pi 10 mM de dNTPs et 615,8 pi d'eau sans nucléase. Mélanger soigneusement et remettre en suspension billes lavées avec le maître-mix. Ajouter 7,2 ul 9,7 U / ul ADN polymérase T4 pour un volume final de 700 pl. Mélanger et laisser incuber pendant 40 minutes à 37 ° C avec rotation (en utilisant Palico Biotech Intelli-Mixer RM-2L, F8, 30 tours par minute, U = 50, u = 60). Effectuer toutes les réactions ultérieures enzymatiques avec les étapes suivantes.
   • Diluer tampons de réaction avec une eau sans nucléase.
   • Ajouter tous les autres réactifs (à l'exception des enzymes) à la mémoire tampon dilué.
   • Mélanger soigneusement. Remettre en suspension billes / pellets avec un mélange de réaction.
   • Ajouter enzyme billes en suspension / Pellet (Gardez enzymes sur glacière de table à tout moment pour assurer le maximum de l'activité enzymatique).
   • Scellez le tube avec du parafilm.
   • Veiller à ce que les perles sont bien mélangés dans le incubatio ensemblen.
3. Jeter mélange réactionnel et laver sels tampons résiduels et des enzymes trois fois avec du tampon de lavage glacé (10 mM Tris-Cl pH 7,5, EDTA 1 mM, NaCl 500 mM).

2. La ligature de biotinylés demi-Linkers à l'ADN ChIP

Ce chapitre de la vidéo met en évidence les caractéristiques des oligonucléotides demi-éditeur de liens utilisées dans la construction de Chia-PET et de l'utilisation de la composition nucléotidique code à barres de distinguer entre les produits de ligature non-spécifiques et spécifiques (13h28-14h24) de la vidéo). Le chapitre présente également la procédure étape par étape de la mise en place une réaction de ligature demi-linker (étape 2.2, 14h24-15h54 de la vidéo).

Deux types de biotinylés demi-linkers sont introduits dans ce protocole et sont conçus avec un code à barres interne de quatre nucléotides (TAAG ou ATGT) et un site de reconnaissance pour le type IIS enzyme de restriction MmeI (TCCAAC). Après ChIP enrichirment, soniqué fragments de chromatine sont également réparties en deux aliquotes sont d'abord et ligaturé avec un excès de l'une des demi-lieur A ou B demi-lieur ^5,9.

1. Diviser ChIP-enrichis perles en deux aliquotes pour l'ADN demi-lieur ligature par biotinylés demi-lieurs A ou demi-linkers B respectivement. Ces deux demi-linkers ont les mêmes séquences de nucléotides, à l'exception de quatre nucléotides dans le milieu qui servent (demi-lieur A avec TAAG; demi-lieur B avec ATGT) que les codes à barres de nucléotides. Lorsqu'il est combiné pendant la ligature de proximité, aléatoire et non-spécifiques ligatures entre les deux complexes puce différente peuvent être identifiés à partir de la population de séquences avec des linkers AB hétérodimère, par rapport à la ligature des particuliers qui peuvent être identifiés de la population de séquences avec homodimère AA ou BB linkers .
2. Ligate ChIP-enrichis perles avec 140 pi 5 x ADN ligase T4 avec un tampon PEG, 3,5 pl 200 ng / ul biotinylés demi-lieurs A ou B, 553,5 ul-nucléaseeau libre et 3 pi 30 U / ul ADN ligase T4 (Gardez l'ADN ligase T4 sur une glacière de table en tout temps comme ligases sont instables, même sur de la glace). Scellez le tube avec du parafilm et incuber une nuit à 16 ° C avec une rotation.

3. Élution et ligature proximité de fragments d'ADN ChIP

Ce chapitre de la vidéo explique le rôle de tampon EB, le SDS et le Triton X-100 au cours de l'élution de complexes chromatiniens de perles et montre également la procédure étape par étape de la mise en place d'une réaction de circularisation (Étape 3.9, 15:54 à 17:10 de la vidéo).

Après la ligature des linkers demi-aux fragments de chromatine, les deux fractions sont réunies et élue au large des perles. Des fragments d'ADN qui interagissent ensuite être relié par une séquence complète de liaison pendant la ligature de proximité.

Utilisation de la composition nucléotidique code à barres, les séquences peuvent être classés en trois catégories, à savoir des séquences wie hétérodimère linkers AB (code à barres ATGT / TAAG) et des séquences avec homodimère AA ou BB linkers (code à barres TAAG / TAAG ou ATGT / ATGT) pour distinguer les produits de ligature non-spécifiques et spécifiques respectivement ^9.

Par conséquent, l'utilisation de deux demi-linkers avec différents codes à barres nucléotidiques permet de spécifier différentes expériences ou de répétitions, ainsi que de la surveillance de la non-spécifique taux de ligature chimérique entre les complexes de puces différentes ^5.

1. Laver demi-linker-ligaturés perles trois fois avec le tampon de lavage glacé (10 mM Tris-Cl pH 7,5, EDTA 1 mM, NaCl 500 mM).
2. Combiner les deux tubes de demi-lieur-ligaturés billes de la manière suivante.
   • Récupérer un des tubes de demi-lieur-ligaturés billes utilisant un concentrateur de particules magnétiques ("tube A").
   • Maintenir le tube d'autre demi-lieur-ligaturés billes sur la glace ("tube B").
   • Jeter le tampon de lavage (de l'étape 3.2.1) fTube rom A et transférer la moitié-linker-ligaturés perles (de l'étape 3.2.2) du tube B dans le tube A. tandis que le tube A est toujours sur le collecteur de particules magnétiques
   • Ajouter 700 pi de tampon de lavage glacé à B Tube pour collecter les résidus demi-linker-ligaturés perles et s'assurer que les deux tubes de demi-linker-ligaturés perles sont combinés correctement. Transférer le tampon de lavage dans A. Tube Jeter le tube vide B.
3. Phosphorylent demi-linker-ligaturés perles avec 70 pi 10 x T4 ADN ligase tampon (ONÉ), 616 ul d'eau sans nucléase et 14 pl 10 U / l de l'ADN T4 polynucléotide kinase. Incuber pendant 50 minutes à 37 ° C avec une rotation.
4. Reclaim phosphorylées demi-linker-ligaturés perles en utilisant un concentrateur de particules magnétiques et jeter mélange réactionnel.
5. Éluer demi-linker-ligaturé chromatine complexe ADN avec 200 ul tampon d'élution fraîchement préparé (TE Buffer, 1% SDS). Incuber pendant 30 minutes à température ambiante (22 °C) avec la rotation.
6. Transfert éluat dans un nouveau tube et rincez perles avec 900 pi de tampon EB. Transférer le surnageant dans le même tube de combiner les élutions.
7. Transfert éluat recueilli les tasses filtres de deux filtres à tube à centrifuger et centrifuger à 16 110 xg (13.200 rpm) pendant 1 minute à température ambiante (22 ° C).
8. Séquestrer le SDS en ajoutant 90 pi à 20% de Triton X-100 et inverser pour bien mélanger. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C.
9. Circularisation est réalisée sous des conditions extrêmement diluée afin de favoriser les événements au sein de la ligature des individuels complexes chromatiniens réticulés, tout en minimisant les événements de ligature entre les complexes de chromatine différentes qui donnent lieu à des molécules d'ADN chimériques indésirables. De travail sur la glace, de transférer éluat trempé dans un tube Falcon de 50 ml et ajouter 7776 ul d'eau sans nucléase, 1000 pi 10 x T4 ADN ligase tampon (ONE) et 33,33 pi 30 U / ul ADN ligase de T4. Incuber une nuit à 16° C

4. Reverse-réticulation et de l'ADN Purification

Ce chapitre de la vidéo montre la procédure étape par étape de phénol: extraction au chloroforme (Étape 4.3, 17h11-17h59) et le close-up de l'ADN granulés après centrifugation à l'étape 4.4.

1. Reverse-réticulation et des protéines se dégradent par l'ajout de 100 ul de 20 mg / ml de protéinase K solution. Incuber pendant 2 heures à 50 ° C.
2. Transfert ADN de la chromatine dans un 50 ml haute densité MaXtract et ajouter 9ml sans nucléase l'eau pour obtenir un volume final de 19 ml.
3. Ajouter 19 ml d'alcool 25:24:1 pH au phénol-chloroforme-Isoamyl 7,9 à le tube dans une hotte et inverser pour bien mélanger. Faites tourner les tubes pendant 5 minutes à 1800 xg (3.000 rpm) à température ambiante.
4. Transfert supérieure phase aqueuse à un des tubes de 50 ml à centrifuger Oak Ridge (Téflon FEP) et de l'ADN précipité la chromatine avec 1,9 ml pH 3 M acétate de sodium 5,5, 19 ml isopropanol et 5 Glycoblue ul. Glycoblue est ajouté pour améliorer la visibilité de la pastille.
5. Incuber à 80 ° C pendant au moins une heure. Laisser la solution congelée à décongeler avant centrifugation à 38720 xg (18.000 tpm) pendant 30 minutes à 4 ° C.
6. Après la centrifugation d'ADN précipité l'isopropanol, laver culot d'ADN avec 75% éthanol glacé à deux reprises et remettre en suspension dans 34 culot d'ADN EB pi de tampon. Transférer le mélange d'ADN dans un tube de 1,7 ml d'ADN LoBind.
7. Resuspendre culot d'ADN dans 34 pi de tampon EB.
8. (Traitement à la RNase est facultatif en ce lavage ultérieur et des étapes de purification dans le protocole Chia-PET servent à éliminer la contamination de l'ARN et des inspections manuelles des séquences Chia-PET à partir de nos propres bibliothèques ont affiché aucune trace de contaminant l'ARN).
   • Effectuer digestion par la RNase par addition de 10 pl RNase ONE 10 x tampon de réaction, 55 pl d'eau sans nucléase et 1 pi 10 U / ul RNase ONE ribonucléase. Incuber à 37° C pendant une heure.
   • Transfert ADN de la chromatine dans un 2 ml à haute densité MaXtract. Ajouter 100 ul 25:24:1 pH alcool au phénol-chloroforme-Isoamyl 7,9 à le tube dans une hotte et inverser pour bien mélanger. Spin le tube pendant 5 minutes à 16110 xg (13.200 rpm) à température ambiante (22 ° C).
   • Transfert supérieure phase aqueuse dans un nouveau tube et précipité inverse réticulé ADN avec 10 pi 3 M pH 5,5 acétate de sodium et 100 ml d'isopropanol. Incuber à -80 ° C pendant 30 minutes et le culot d'ADN pendant 30 minutes à 16110 xg (13.200 rpm) à 4 ° C.
   • Après la centrifugation d'ADN précipité l'isopropanol, laver le culot d'ADN avec 75% éthanol glacé à deux reprises et remettre en suspension dans 34 culot d'ADN EB pi de tampon.

5. Immobilisation de Chia-PET ADN pour des billes de streptavidine

L'introduction de cette chapitre traite de la présencedu site de reconnaissance et le MmeI T biotinylé présent dans les oligonucléotides demi-lieur de faciliter l'extraction de mot-clé-lieur-tag constructions ("PET", 18:02-19:10 de la vidéo). En outre, ce chapitre de la vidéo donne également une vue générale rapide de l'étape 5.2, la procédure étape par étape de la mise en place d'une réaction PCR (étape 6.1, 19h10-20h00 de la vidéo) et exciser un succès Chia-PET ADN (étape 6.9, 20h00-20h30).

Demi-lieurs A et B contiennent des sites de reconnaissance d'accompagnement MmeI, permettant à cette enzyme de restriction de type IIS pour couper paires de bases 18/20 en aval de leurs sites cibles contraignantes pour générer à court de "tags" du fragment de la chromatine, la production de paires de tag-linker-tag constructions («PET»).

Pour permettre la purification de constructions PET par revêtues de streptavidine des billes magnétiques, des deux demi-lieur A et B sont modifiés avec de la biotine, permettant la capture et la purification des constructions chia-PET.

1. Communiqué captured Chia-PET ADN en ajoutant 5 pi 10 x NEBuffer 4, 5 pi fraîchement préparé 500 um (10 x) S-adénosylméthionine (SAM) et 1 pi 2 U / ul MmeI à l'ADN remis en suspension. Quench MmeI excès en ajoutant 5 pi non-biotinylés demi-linkers de mélange réactionnel pour MmeI peut être auto-inhibitrice en excès. Incuber pendant 2 heures à 37 ° C.
2. Pour capturer libérés Chia-PET 50 pi d'ADN de transfert, de remises en suspension des billes de streptavidine M-280 à un tube LoBind ADN. Laver deux fois avec des perles 2 x de reliure et de tampon de lavage (2 x B & W: 10 mM Tris-HCl pH 7,5, EDTA 1 mM, 2 M de NaCl). Remettre les billes dans 50 pl 2 x B & W Buffer et transférer 50 ul du mélange de digestion (de l'étape 5.1) dans le même tube. Bien mélanger et incuber pendant 45 minutes à température ambiante avec une rotation.
3. Reclaim perles en utilisant un concentrateur de particules magnétiques et éliminer le surnageant. Laver deux fois avec 150 perles ul 1 x tampon de lavage de reliure et de (1 x B & W: 5 mM Tris-HCl pH 7,5, EDTA 0,5 mM, NaCl 1 M).
4. Reclaim perles en utilisant un concentrateur de particules magnétiques et éliminer le surnageant. Laver trois fois avec des perles 150 pi 1 x B & W Buffer.
5. Nick traduire Chia-PET ADN avec 5 pi 10 x NEBuffer 2, 2,5 pi 10 mM de dNTPs, 38,5 pi d'eau sans nucléase et 4 pi 10 U / ul Escherichia coli ADN polymérase I. Incuber une nuit àla température ambiante (22 ° C) avec la rotation.
6. Reclaim perles en utilisant un concentrateur de particules magnétiques et éliminer le surnageant. Laver trois fois avec des perles 150 pi 1 x B & W Buffer.
7. Remettre en suspension avec 50 perles EB pi de tampon.

6. L'amplification de l'ADN Chia-PET

1. Mettre en place des réactions de PCR avec 2 perles de suspension ul, 21 ul nucléase eau gratuites, 1 pl 10 pM Illumina 1-454 amorces, 1 pl 10 pM Illumina 2-454 amorces et 25 Phusion ul High Fidelity Master Mix.
2. Pour déterminer le nombre de cycles nécessaires pour générer suffisamment de produits de PCR pour le séquençage, mis en place trois tests réactions de PCR avec des cycles de 16, 18 et 20. Ne pas dépasser 20 cycles que nous avons constaté que faire des résultats afin de la complexité de bibliothèque très faible.

Etape initiale	30 secondes	98 ° C	(Dénaturation)
18 à 25 cycles	10 secondes	98 ° C	(Dénaturation)
	30 secondes	65 ° C	(Recuit)
	30 secondes	72 ° C	(Extension)
Étape finale	5 minutes	72 ° C	(Extension finale)

3. Déterminer le nombre le plus bas possible du cycle en cours d'exécution par les réactions de PCR sur un gel TBE gradient 4-20% et coloration au SYBR Green I, assurer la présence d'une bande de 223 paires de bases, qui est la longueur de l'ADN chia-PET.
4. Amplifier le reste des perles Chia-PET streptavidine liée à l'ADN dans un PCR à grande échelle avec aussi peu de cycles de PCR que possible tout en obtenant un rendement suffisant pour le séquençage.
5. Réperles de demande de toutes les réactions PCR en utilisant un concentrateur de particules magnétiques et une piscine surnageant à deux tubes LoBind frais d'ADN. Précipiter chaque tube de surnageant en ajoutant 60 pl acétate de sodium 3 M, 2 GlycoBlue ul et 600 ul d'isopropanol à des réactions mises en commun.
6. Incuber à -80 ° C pendant 30 minutes. Centrifuger à 16110 xg (13.200 tpm) pendant 30 minutes à 4 ° C.
7. Après la centrifugation d'ADN précipité l'isopropanol, de lavage culot d'ADN avec 75% éthanol glacé à deux reprises et remettre en suspension l'ADN extrait concentré dans 100 pi de tampon TE et 5 pi 6 x colorant de charge.
8. Distribuer des produits de PCR uniformément dans les puits d'un gel TBE 6%. Exécutez le gel dans 1 x tampon TBE à 200 V pendant 35 minutes et la tache avec SYBR Green I. Visualisez le gel avec un lecteur Transilluminateur foncé.
9. Soigneusement d'accise de 223 pb bande à partir du gel et d'effectuer "l'écrasement de gel" protocole d'extraction d'ADN comme suit:
   • Placez fragments de gel excisées dans 0,6 ml MicroCTubes entrifuge qui ont été percées au fond avec une aiguille G 21-.
   • Placer chaque tube intérieur d'un tube de 1,5 ml bouchon à vis et centrifuger à 16 110 xg (13.200 tpm) pendant 5 minutes à 4 ° C.
   • Ajouter 200 ul de tampon TE pH 8,0 à chaque tube et s'assurer que les morceaux de gel sont totalement immergés dans la mémoire tampon.
   • Congeler à -80 ° C pendant une heure et incuber à 37 ° C pendant la nuit.
   • Transfert des morceaux de gel avec le tampon dans chaque tube pour la Coupe du filtre d'un filtre tube à centrifuger et centrifuger à 16 110 xg (13.200 tpm) pendant 10 minutes à 4 ° C.
   • Rincer chaque tube de 1,5 ml avec 200 ul de tampon TE pH 8,0 et de transfert de tampon de rinçage à chaque unité de filtre à la fin de la première rotation.
   • Piscine filtre à travers et précipité avec de l'isopropanol.
   • Resuspendre culot d'ADN avec 15 pi de tampon TE.

7. Qualité Vérifier unAmplification d de Chia-PET ADN

1. Procéder à la vérification de la qualité en utilisant DNA 1000 Assay Agilent Agilent ou test ADN de haut de sensibilité sur Agilent Bioanalyzer 2100.
2. L'électrophorégramme du test ADN Agilent devrait afficher un seul pic avec une base plane avant de procéder à Illumina Genome Analyzer IIx séquençage.
3. Avant de séquençage Illumina Genome Analyzer IIx, Chia-PET ADN devraient idéalement avoir une concentration minimale de 10 nM. Effectuer un 4-point de la PCR quantitative en fonction de Illumina qPCR Guide du protocole de quantification afin de déterminer la quantité d'échantillon à charger sur la cellule de flux. Sinon, effectuer un point de la PCR quantitative comme suit:
   • Diluer le modèle de contrôle à 100 pM, 22 heures et 13 heures. Comme décrit dans le protocole de quantification du Illumina qPCR, un modèle de contrôle est défini comme n'importe quelle bibliothèque préparée pour le séquençage sur la plate-forme Illumina et il devrait être aussi proche que possible en termes detaille du modèle, la teneur en GC et le type de bibliothèque.
   • Diluer l'ADN Chia-PET à 22 heures.
   • Mettre en place PCR triplicata de chaque dilution de 0,1 Primer qPCR ul 1.1, 0.1 Primer qPCR ul 2.1, 5 pi LightCycler480 ADN SYBR Green I Master Mix, 3,8 pi d'eau sans nucléase et 1 ul de modèle avec Roche Applied Sciences LightCycler 480 Real-Time Système PCR. Inclure deux contrôles négatifs en utilisant 1 pl de l'eau sans nucléase en tant que modèle.
     • Dénaturation initiale
       • 95 ° C à 5 minutes 4,8 ° C / s
     • Amplification
       • 95 ° C 10 secondes 4,8 ° C / s
       • 60 ° C une minute à 2,5 ° C / s
       • 72 ° C 30 secondes 4,8 ° C/ S
     • Courbe de fusion
       • 95 ° C 5 secondes 4,8 ° C / s
       • 65 ° C une minute à 2,5 ° C / s
       • 95 ° C 5 ° C par des acquisitions
     • Refroidissement
       • 40 ° C de 10 secondes 2,0 ° C / s
   • Veiller à ce que les contrôles négatifs ne montrent aucune amplification et que l'écart type pour les valeurs de Ct est inférieure à 0,1 avant de calculer la concentration des modèles de bibliothèque sur la base de la courbe standard générée à partir des dilutions modèle de contrôle.
4. Générer des grappes sur la surface de cellules d'écoulement Illumina en chargeant int 13:05o Système de Génération Illumina cbot Cluster conformément aux instructions affichées à l'écran.
5. Passez à la séquence de Chia-PET ADN sur Illumina Genome Analyzer IIx en utilisant une amorce de séquençage Illumina Illumina 3-454 et l'amorce de séquençage 4-454 sur une seule voie pour voir la qualité de la bibliothèque. Stocker en restant Chia-PET ADN à -20 ° C. Si la bibliothèque a de bonnes données, préparation de l'échantillon pour des tirages supplémentaires de 4 à 8 voies en fonction des besoins sur la base des résultats de voies d'échantillons afin d'obtenir de 18 à 20.000.000 lectures unique.
   • Le montant de Chia-PET ADN chargé sur les cellules d'écoulement dépend fortement de la version du logiciel d'analyse des données de séquençage, Studio Illumina contrôle de séquençage. Pour la version 2.9, les plages de concentration de chargement d'un tiers à la moitié de la capacité maximale de chaque carreau, ce qui équivaut à environ 21 millions filtré passe lit avec environ 9,5 millions de lectures de la vie privée.
   • Charge réduite est nécessaire pour assurer une bonne base d'appel fou les séquences de codes à barres des lieurs. Cette erreur se produit quand un grand nombre de nucléotides similaires sont séquencées, comme c'est le cas si le linker est séquencé, pour obtenir des informations codes à barres. Si le codage à barres de l'information n'est pas désiré, et les linkers ne sont pas lus, alors la concentration en pleine charge peuvent être utilisés.
6. Les fichiers convertis qSeq par l'appelant de base hors ligne peuvent être analysés plus en utilisant l'outil Chia-PET, selon le manuel Chia-PET outil d'installation (Version 4.1) ^8.

C. Représentant Chia-PET Résultats

Nous avons réussi à construire Chia-PET bibliothèques utilisant l'ARN polymérase II d'anticorps (8WG16) en cellules MCF-7 (CHM160 et CHM163) ⁹ 672 ng en utilisant du matériel ChIP comme décrit plus haut. Le gel diagnostic initial de fonctionner de cette bibliothèque amplifié par PCR, tel que mentionné à l'étape 6.2 du protocole Chia-PET, affiché une bande brillante et bien définie àla taille attendue de 223 paires de bases pour tous les vélo PCR utilisé (voir Figure 4).

16 cycles de PCR a été utilisée pour amplifier la bibliothèque Chia-PET et un rendement total de 17,1 ng a été obtenu. Un seul, le pic électrophérogramme intense a été observée à la taille attendue de 223 paires de bases par l'intermédiaire d'Agilent DNA 1000 analyse tel que mentionné à l'étape 7.1 du Protocole de Chia-PET (voir Figure 5).

Figure 1. Aperçu ChIP. Cellules MCF-7 sont à double réticulés avec éthylglycol bis (succinimidylsuccinate (EGS) et le formaldéhyde séquentiellement, ce qui entraîne des liaisons covalentes entre chromatine spatialement adjacentes. Le chromatine réticulé a été obtenue à partir des fixes cellules MCF-7 par lyse cellulaire et la lyse nucléaire. La chromatine a ensuite été soumis à une fragmentation à une gamme de taille de 200-600 paires de bases. Après une pré-compensation de la chromatine soniqué avec Protein perles G magnétique pour éliminer non spécifique d'ADN, la chromatine pré-autorisé a été immunoprécipité nuit avec un anticorps de billes revêtues de capturer la chromatine d'intérêt.

Figure 2. L'analyse sur gel des fragments de chromatine soniqués. Une échelle de 100 bp est montré dans la voie première et la dernière à titre de référence de taille. La chromatine soniqué affiché une forte intensité entre 200 et 600 pb qui est idéal pour saisir les interactions à longue portée chromatine.

Figure 3. Chia-PET aperçu. Fragments de chromatine sont fragmentés en fin émoussé et ligaturé à biotinylés demi-linkers contenant des sites de restriction flanquant MmeI. Complexes chromatiniens intacts sont ensuite éluées hors des perles et soumis à la ligature de proximité dans des conditions extrêmement diluée conditions, de telle sorte que des fragments d'ADN qui interagissent sont preferentially ligaturé à l'autre. Après réticulation inverse pour éliminer l'ADN protéines associées, la digestion est effectuée MmeI pour libérer balise-lieur-tag (PET) constructions, qui sont ensuite purifiés par liaison sélective à billes de streptavidine. Les constructions en PET sont ligués avec des adaptateurs pour séquençage à haut débit.

Figure 4. Analyse Gel de Chia-PET après amplification par PCR. Une échelle 25 bp est montré dans le couloir 1 et 5 pour référence de taille. Les pistes 2 à 4 sont des produits de PCR générés après le 16, 18 et 20 cycles d'amplification PCR à partir de 2 pi de modèle de perles immobilisé, respectivement. Il s'agit d'une bibliothèque de succès, comme indiqué par les chambres lumineuses et bien définies des bandes à la taille attendue de 223 pb. Le frottis non spécifique est généré lorsque le nombre de cycles de PCR est augmenté tandis que le plus bas de chaque bande de réaction PCR est constitué de dimères d'amorces.

Figure 5. Agilent 2100 Bioanalyzer analyse des purifié Illumina-454 adaptateur ligaturé Chia-PET. Capture d'écran de électrophérogrammes Agilent Bioanalyzer 2100 profilage d'une bibliothèque de succès, avec un seul pic intense à la taille attendue de 223 pb. Notez que le test Agilent Bioanalyzer rapporte habituellement une taille légèrement plus élevé que prévu, dans ce cas, le pic souhaité est affiché à 237 pb au lieu de 223 pb. Ceci est dans la plage d'erreur 10% du dosage Agilent.

Discussion

Chia-PET est une méthode mise au point pour identifier les interactions à longue portée dans régulation de la transcription. Un des facteurs critiques qui déterminent la qualité d'une bibliothèque Chia-PET est la qualité du matériel ChIP.

Le protocole présenté dans la vidéo incorpore l'utilisation de biens et services environnementaux et de formaldéhyde pour réticuler les cellules. L'utilisation du formaldéhyde combiné avec un deuxième réactif de réticulation portant un bras espaceur plus peut aider à la fixation de protéines qui ne pouvaient pas être liés par le formaldéhyde seul ^3,11,15. Nous avons construit des bibliothèques avec cette méthode, qui ont démontré de solides sites de liaison et à long terme des interactions ^9. Toutefois, la réticulation et les conditions de puce devrait être optimisé pour chaque facteur d'intérêt, et il est important de ne pas trop réticulation comme trop réticulation se traduira par des difficultés dans la fragmentation par ultrasons, et peut éventuellement mener à des interactions parasites chromatine . Interactions chromatineidentifié par Chia-PET doit être validé par une méthode différente, telles que la fluorescence par hybridation in situ ^4.

Nous recommandons un minimum de 100 ng de matériel chromatine. Alors que nous avons construit des bibliothèques de bonne qualité à partir de 50 ng de matériel chromatine, nous avons observé que de grandes quantités de matériau de départ a permis la construction de Chia-PET bibliothèques avec des cycles de PCR de moins de 16, réduisant ainsi au minimum amplicons et la redondance de chaque bibliothèque. Cette baisse de la redondance en corrélation avec plus uniques balises cartographiés et également un pourcentage élevé de données utilisables, ce qui permet une carte plus complète chromatine interaction avec moins de voies de séquençage. Le volume final emballé de perles dans chaque tube devrait être de 50 pi et 100 pi de billes magnétiques et Sépharose respectivement. Si le volume emballé perle est inférieure à celle indiquée, mettre le volume au minimum emballé avec même pré-autorisé vierges billes magnétiques ou Sepharose pour minimiser la perte de l'ADN porteur de billess dans les étapes ultérieures. À canon scié de conseil ou grand-core des conseils devraient être utilisés pour le pipetage des billes de Sépharose.

Les modifications suivantes ont été intégrées à la suite du déjà publié Chia-PET protocole ^5. Tout d'abord, billes magnétiques G ont été utilisés pour minimiser la perte de l'échantillon pendant les lavages. En outre, nous avons identifié bandes non spécifiques avec la taille approximative de 100 pb et 138 pb pour être amplicons de l'auto-ligaturés demi-linkers ou / et des adaptateurs. Par conséquent, nous avons réduit la concentration de biotinylés demi-linkers et 454 GS20 adaptateurs pour minimiser bandes non spécifiques lors de l'amplification PCR. Le volume ligature de proximité a été réduit de 50 ml à 10 ml pour minimiser la perte d'échantillon au cours des étapes ultérieures de purification et aussi économiser sur les coûts des réactifs. Nous avons également augmenté le temps d'incubation pour immobiliser Chia-PET ADN à des billes pour assurer la capture maximale de Chia-PET ADN sur les billes de streptavidine.

Au cours de l'étape de ligation de proximité, la ligature des chimères that ne représentent pas vrai dans les interactions in vivo chromatine sont inévitablement générés d'une manière non-spécifique et aléatoire. Par conséquent, pour évaluer la qualité des données provenant de n'importe quelle expérience Chia-PET, le taux de chimérisme est estimée à partir de l'utilisation de deux différents demi-linkers avec nucléotidique spécifique TAAG codes à barres et ATGT ^5. Après séquençage à haut débit, les séquences Chia-PET sont d'abord analysés pour leur composition code-barres de liaison et des séquences dérivées de produits de ligature et des produits spécifiques ligature non-spécifiques peuvent être distinguées ^8. Le pourcentage de chimères connus (c.-à-hétérodimères linkers AB) présents dans notre propre MCF-7 ARN polymérase II Chia-PET bibliothèques est inférieure à 15%.

Chia-PET séquences sont ensuite classées en deux catégories, à savoir l'auto-ligature animaux de compagnie et inter-ligature ANIMAUX DE COMPAGNIE. Auto-ligature PET sont obtenues à partir d'auto-circularisation ligature des fragments de chromatine tandis entre ligature PET sont dérivées à partir de inter-ligature entre deux fragments d'ADN différents. Ce dernier est alors sous-divisé en trois catégories différentes en fonction de la distance génomique de chaque étiquette sur le même chromosome (intrachromosomiques inter-ligature PET) ou que les deux balises sont mappées à deux chromosomes différents (interchromosomiques inter-ligature PET). Nous avons développé un package Chia-PET outil logiciel pour trier les différentes catégories ^8. Ce sera basé sur des fragments d'ADN qui sont dans la bibliothèque. En règle générale, des fragments plus petits ChIP donnera une résolution plus élevée et la couper pour ces ARN polymérase II Chia-PET bibliothèques est d'environ 4 ko.

En outre, les interactions réelles chromatine peuvent être distingués du bruit aléatoire en comptant le nombre d'inter-ligature vie privée dans un cluster interaction; en d'autres termes, un groupe de comptage PET haute est dit d'avoir une plus grande probabilité d'être une interaction réelle chromatine ⁸ .

Pour filtrer nos faux positifs unepassera de points d'ancrage hautement enrichi qui peuvent former des inter-ligature vie privée par hasard, un cadre d'analyse statistique a également été formulées pour tenir compte de la formation aléatoire de toute vie privée inter-ligature entre deux ancres ^8.

En conclusion, la technique de Chia-PET permet de cartographier les réseaux d'interaction chromatine à l'échelle mondiale. La mise en œuvre de la puce en Chia-PET permet la réduction de la complexité de bibliothèque et le bruit de fond. En outre, ajoute-t-ChIP spécificité des interactions chromatine, permettant l'examen des interactions spécifiques associés à la chromatine facteurs de transcription particuliers ^5.