Kromatin Interaktion Analys med parade-End Tag sekvensering (CHIA-PET) för kartläggning kromatin Interaktioner och förstå transkriptionsreglering

Summary

Kromatin Interaction Analysis genom parvisa sluttagg sekvensering (CHIA-PET) är en metod för

Abstract

Genomen är organiserade i tre-dimensionella strukturer, anta högre ordning konformationer inuti micron stora nukleära utrymmen ^{7, 2, 12.} Sådana arkitekturer är inte slumpmässiga och omfatta samspel mellan genpromotorer och reglerande element ^13. Bindningen av transkriptionsfaktorer till specifika regulatoriska sekvenser åstadkommer ett nätverk av transkriptionsreglering och samordning ^{1, 14.}

Kromatin Interaction Analysis genom parade-End Tag sekvensering (CHIA-PET) har utvecklats för att identifiera dessa högre ordningens kromatin strukturer ^5,6. Cellerna fixeras och samverkande loci fångas upp av kovalenta DNA-protein tvärbindningar. För att minimera icke-specifik brus och minska komplexiteten, samt att öka specificiteten av kromatin interaktionen analys är kromatin immunoprecipitation (chip) som används mot specifika proteiner faktorer för att berika kromatin fragment av intresse innan närhet ligering. Ligering där halva linkers bildar därefter kovalenta bindningar mellan par av DNA-fragment bundna tillsammans inom enskilda kromatin komplex. De flankerande MmeI restriktionsenzymställen i halv-linkers tillåta extraktion av parade end tagg-linkerkombination-tagg konstruktioner (PET) vid MmeI digerering. Som halv-linkers är biotinylerade, dessa PET konstruktioner renas med streptavidin-magnetiska pärlor. De renade teknik ligeras med nästa generations sekvensering adaptrar och en katalog av samverkande fragment genereras via nästa generations sequencers som Illumina Genome Analyzer. Kartläggning och bioinformatik analys utförs därefter för att identifiera Chip-berikade bindande platser och Chip-berikade kromatin interaktioner ^8.

Vi har tagit fram en video för att visa kritiska aspekter av Chia-PET-protokollet, särskilt utarbetandet av chip som kvaliteten på ChIP spelar en viktig roll i resultatet av en CHIA-PET bibliotek. Såsom protokollenmycket lång, bara de kritiska stegen som visas i videon.

Protocol

A. Kromatin Immunoutfällning (chip) (se figur 1)

1. Dubbel Tvärbindning av kromatin proteiner och cellskördning

(Vid 02:10 i videon)

Kromatin immunoutfällning (chip) är det första kritiska steget involverade vid konstruktion av en CHIA-PET-bibliotek. Detta steg är viktigt för att minska graden av komplexitet, bakgrundsljud och lägga specificitet. Framställningen av chipet kommer att behöva optimeras för celltyp och faktorer av intresse. Detta protokoll är baserad på RNA-polymeras II CHIA-PET-bibliotek framställt från MCF-7 celler ⁹ är konstruerade i vårt laboratorium. För att säkerställa att den resulterande biblioteket är av tillräcklig komplexitet, rekommenderar vi 1 x 10 ^8-celler för att framställa spånmaterial. Beroende på målet och cellinjen kan utbytet erhölls vara mellan 100 ng till 300 ng. Vi rekommenderar att minst 100 ng ChIP bör användas för att samarbetanstruct en CHIA-PET bibliotek med färre än 20 PCR-cykler för att minimera redundans under sekvensering. Högre mängder av spånmaterial möjliggör ytterligare minskning av redundans, att förbättra kvaliteten av biblioteken.

1. Tvätta 1 X 10 ⁸ MCF-7-celler (ekvivalent med fem 500 cm ² fyrkantiga plattor med 2 x 10 ^7-celler) två gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) förvärmd vid 37 ° C.
2. Tvärbindningar MCF-7-celler med 1,5 mM nyberedd etylglykol bis (succinimidylsuccinat) (EGS)) under 45 minuter vid rumstemperatur (22 ° C) med rotation i en kemisk draghuv.
3. Tillsätt 37% formaldehyd till en slutlig koncentration av 1% under 20 minuter vid rumstemperatur (22 ° C) med rotation i en kemisk draghuv.

4. Släcka de tvärbindningsmedel genom tillsats av 2 M glycin till en slutkoncentration av 200 mM. Inkubera under 10 minuter vid rumstemperatur(22 ° C) med rotation.

5. Kassera kylda tvärbindningsmedel i en papperskorg kolv och tvätta cellerna två gånger med kall PBS.
6. Kassera PBS och celler skörd genom skrapning. Håll skördade cellerna på is. Skölj plattan med 5 ml PBS (med proteashämmare ("+ PI") tillsätts enligt tillverkarens anvisningar) för att maximera samling celler.
7. Pelletera cellerna vid 1800 x g (3000 rpm) under 10 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten och fortsätt till cell-lys. Alternativt, lagra pelleten vid -80 ° C.

2. Cellys

(Vid 04:15 i videon)

1. Återsuspendera pelleten i 15 ml 0,1% SDS lysbuffert (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100 och 0,1% natriumdeoxikolat, 0,1% SDS + PI) grundligt genom pipettering. Rotera under 15 minuter vid 4 ° C.
2. Pellet lyseras cellerna vid 800 xg (2000 rpm) under 10 minuter vid 4 ° C.
3. Kassera supernatant och upprepa cellys gång per steg 2,1 och 2,2.
4. Den isolerade nukleära pelleten är klar för nukleär lys. Alternativt lagrar pellet vid -80 ° C.

3. Nukleär Lys

(Vid 05:00 i videon)

Nuclear lys görs för att frigöra tvärbunden kromatin innan kromatin fragmentering. I avsaknad av nukleära membranet, kan det tvärbundna kromatinet att sonikeras med mildare förhållanden. Ibland kan ultraljudsbehandling styrka inte vara tillräcklig för att bryta upp den nukleära membranet i vilket fall kommer mindre kromatin erhålls på grund av det intakta kärnorna kommer att kasseras efter centrifugering. Emellertid kan olika celltyper kräver olika betingelser.

1. Återsuspendera isolerade kärnor pelleten i 15 ml 1% SDS lysbuffert (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,1% natrium Deoxycholate, 1% SDS + PI). Överföra kärnor suspensionen till en hög hastighet-centrifugrör (Oak Ridge centrifugrör (Polypropylen)) och rotera under 15 minuter vid 4 ° C.
2. Pelleten lyserades kärnor pellet vid 47.810 x g (20.000 rpm) under 30 minuter vid 4 ° C.
3. Dekantera supernatanten och brytning pellet med en P1000 pipettspets.
4. Tvätta pellet med 30 ml 0,1% SDS lysbuffert (+ PI).
5. Rotera under 15 minuter vid 4 ° C.
6. Pelleten kromatin vid 47.810 x g (20.000 rpm) under 30 minuter vid 4 ° C.
7. Kassera supernatanten och upprepa tvätta en gång per steg från 3,4 till 3,6 innan man kromatin fragmentering. Alternativt, lagra kromatin pellet vid -80 ° C.

4. Fragmentering av kromatin

(Vid 07:03 i videon)

1. Överföring kromatin pelleten i ett 14 ml polystyren med rund botten provrör.
2. Tillsätt 1 ml 0,1% SDS lysbuffert (+ PI) till kromatin pellet. Se till att inga bubblor i blandningen eftersom detta kommer att påverka ultraljudsbehandling effektivitet.
3. Shear kromatin-DNA till en storlek av 200 till 600 baspar med en Branson digital Sonifer Cell Disrupter (amplitud 35%, 9 minuter (30 sekunder på 30 sekunder av)) och hålla prover kallt hela tiden för att förhindra överhettning genom att utföra sonikering i ett kallt rum (se figur 2).
4. Omvänd tvärbinds en alikvot av kromatin och kontrollera fragmentering effektivitet med följande steg. (Följande steg visas inte i videon).
   • Alikvotera 10 pl kromatin efter ultraljudsbehandling.
   • Centrifug sonikerades kromatin vid 16.110 x g (13.200 rpm) under 5 minuter vid 4 ° C.
   • Överför supernatanten till ett nytt rör och tillsätt 2 pl proteinas K-lösning.
   • Inkubera under 30 minuter vid 50 ° C.
   • Lös vända-tvärbunden kromatin på en 1,5% agarosgel.
   • Repeat ultraljudsbehandling om storleken på DNA är större än väntat.
5. Centrifugera återstående lysatet vid 16.110 x g (13.200 rpm) under 30 minuter vid 4 ° C och överföring sonikerades kromatin (supernatanten) i ett nytt rör före preclearing med magnetiska kulor. Alternativt sonikerades butiken kromatin vid -80 ° C tills tillräcklig kromatin samlas för att starta ett chip.

5. Tvättning Preclearing och Beläggning av antikropp till pärlor

(Vid 08:17 i videon)

1. Preclearing av kromatin
   1. Användning 300 pl magnetiska pärlor protein G för en IP.
   2. Tvätta pärlorna tre gånger med 5 ml pärlor tvättbuffert (PBS, 0,1% Triton X-100). Denna och framtida tvättar där magnetiska protein G pärlor består av följande steg. Se till magnetiska kulor inte torkar ut.
      • Återvinna pärlor med användning av en magnetisk partikelkoncentrator.
      • Discard supernatanten.
      • Återsuspendera pärlorna med buffert.
      • Rotera i 5 minuter vid 4 ° C.
      • Centrifugera vid 129 x g (800 rpm) under 1 minut vid 4 ° C.
      • Återvinna pärlor med användning av en magnetisk partikelkoncentrator.
      • Kassera supernatant.
   3. Kombinera sonikerad kromatin med tvättade pärlor, för att ta bort bakgrunden bindning av kromatin till pärlor.
      • Håll 10 pl sonikerad kromatin som "input" för senare anrikning kontroll genom kvantitativ PCR (qPCR). Lagra vid 4 ° C.
   4. Rotera över natten vid 4 ° C.
   5. Centrifug sonikerades kromatin vid 129 x g (800 rpm) under 1 minut vid 4 ° C.
   6. Placera röret på den magnetiska partikelkoncentrator.
2. Beläggningen Antikropp till magnetiska pärlor
   1. Alikvot 300 | il av magnetiska pärlor protein G till ett nytt rör.
   2. Tvätta pärlorna tre gånger med 5 ml pärlor tvättbuffert (PBS, 0,1% Triton X-100).
   3. Lägg till en motsvarande volym (som steg 5.1.3) i pärlor tvättbuffert.
   4. Tillsätt 35 | ig av RNA-polymeras II (8WG16) monoklonal antikropp.
   5. Rotera över natten vid 4 ° C.
   6. Tvätta antikropp-belagda pärlor två gånger med 5 ml pärlor tvättbuffert.
   7. Återvinna antikropp-belagda pärlor med användning av en magnetisk partikelkoncentrator.

6. Kromatin Immunoutfällning

(Vid 10:03 i videon)

För att minska nivån av komplexitet och bakgrundsljud är antikroppar mot specifika protein faktorer som används för att berika vissa kromatin fragment av intresse innan närhet ligering ^6.

Här har vi använt en mus-RNA-polymeras II-monoklonalantikropp (8WG16) som kände igen den inledande formen av proteinet. Genom att berika DNA-fragment som är förknippade med RNA-polymeras II, specificitet biblioteket kan ökas, så att identifiering av långsiktiga kromatin interaktioner mellan aktiva promotorer och deras motsvarande regulatoriska regioner ^9.

1. Kassera tvättbuffert från antikropp-belagda pärlor med hjälp av en magnetisk partikelkoncentrator.
2. Överföring sonikerades kromatin (supernatanten från steg 5.1.6) med hjälp av magnetisk partikelkoncentrator till antikropp-belagda pärlor (från steg 5.2.7).
3. Rotera över natten vid 4 ° C.

7. Tvättning och eluering av immunfällt DNA-proteinkomplex

(Vid 11:13 i videon)

1. Tvätta kromatin-immunutfällda pärlor tre gånger med 5 ml 0,1% SDS lysbuffert.
2. Tvätta pärlorna gång med 5 ml Hög Salt tvättbuffert (50 mM HEPES pH 7,5, 350 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,1% natriumdeoxicholat, 0,1% SDS).
3. Tvätta pärlorna gång med 5 ml Litiumklorid tvättbuffert (10 mM Tris, pH 8,0, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,5% Nonidet P-40, 0,5% natriumdeoxikolat).
4. Kasta tvättbuffert och slamma tvättade pärlor med 1 ml TE-buffert.
5. Rotera i 5 minuter vid 4 ° C. Provet är färdigt för kvantifiering och ChIP anrikning kontroll. När väl tillräckligt spånmaterial har uppsamlats, provet är färdigt för att byggas in i en CHIA-PET-bibliotek. Detta steg är kritisk, och måste göras för att säkerställa ett framgångsrikt CHIA-PET-biblioteket konstruktion. Chip-berikade pärlor kan förvaras upp till 2 veckor vid 4 ° C under genomgår kvantifiering, CHIP kontroller anrikning och ackumulering av tillräckligt material.
   1. Eluera och omvänd-tvärbindning "input" DNA och Chip-berikade pärlor med följande steg. (Följande steg visas inte i videon.)
      • Eluera 20% av chip-anrikade pärlor med 200 | il ChIP elueringsbuffert (50 mM Tris, pH 8,0, 10 mM EDTA, 1% SDS). Rotera under 30 minuter vid 37 ° C. Centrifugera eluerade pärlor vid 6100 x g (800 rpm) under 1 minut vid 4 ° C. Överföra eluerade CHIP komplex (supernatant) till ett nytt rör med hjälp av magnetisk partikelkoncentrator.
      • Omvänd tvärbindning "input" och eluerades CHIP komplex med 2 | il Proteinas K (slutlig koncentration av 0,2 g / ml) under 2 timmar vid 50 ° C.
      • Överföra omvänd-tvärbunden "ingång"-DNA och eluerade ChIP DNA i en 2 ml MaXtract hög densitet (respektive). Tillsätt 200 pl 25:24:1 fenol-kloroform-isoamylalkohol pH 7,9 till rören i en kemisk draghuv och invertera att blanda väl. Snurra rören under 5 min vid 16.110 x g (13.200 rpm) vid rumstemperatur.
      • Överföra övre vattenfasen till ett nytt rör och utfälla vända tvärbunden DNA with 20 ^ il 3 M natriumacetat, pH 5,5, 200 | il iso-propanol och 1 | il 15 mg / ml Glycoblue. Inkubera vid -80 ° C under 30 minuter och pelleten DNA i 30 minuter vid 16.110 x g (13.200 rpm) vid 4 ° C.
      • Efter centrifugering av isopropanol utfällda DNA, tvätta DNA-pelleten med 75% iskall etanol två gånger och återsuspendera DNA-pelleten i 20 pl TE-buffert.
   2. Kvantifiera "input" DNA (från steg 5.1.3) och ChIP DNA genom PicoGreen analys ^10.
   3. Gör en anrikning kontroll via kvalitativa PCR (qPCR).

B. Chromatin Interaction Analysis med parade sluttagg sekvensering (CHIA-PET)

Den andra halvan av videon kommer att belysa de viktigaste stegen i konstruktionen av en CHIA-PET bibliotek.

1. Ände-avtrubbning av chip DNA-fragment

I detta kapitel av videon belyser två main poäng, en steg-för-steg förfarande att tvätta magnetiska pärlor för att ta bort enzymer och buffring salt den tidigare reaktionen (steg 1,1, från 12:22 till 12:54 i videon) och förfarandet för att inrätta enzymatiska reaktioner där magnetiska pärlor i reaktionsblandningen (Steg 1,2, 12:54 till 13:25 av video).

1. Tvätta Chip-berikade pärlor gång med iskall TE-buffert. Denna och framtida tvättar där magnetiska pärlor består av följande steg.
   • Centrifugera vid 6100 x g (800 rpm) under 1 minut vid 4 ° C.
   • Återvinna pärlor med användning av en magnetisk partikelkoncentrator.
   • Kassera supernatant.
   • Tillsätt-buffert till pärlorna.
   • Blanda pärlor med buffert genom att slå handling.
   • Centrifugera vid 6100 x g (800 rpm) under 1 minut vid 4 ° C.
   • Återvinna pärlor med användning av en magnetisk partikelkoncentrator.
   • Kassera supernatant.
2. Att fylla i sonikerade overhaNGS, förbereda en master-mix med 70 pl 10 x buffert för T4 DNA-polymeras, 7 pl 10 dNTPs mm och 615,8 ni nukleas-fritt vatten. Blanda väl och resuspendera tvättade pärlor med master-mix. Tillsätt 7,2 pl 9,7 U / fil T4-DNA-polymeras till en slutlig volym av 700 pl. Blanda och inkubera under 40 minuter vid 37 ° C med rotation (med användning av Palico Biotech Intelligent mixer RM-2L, F8, 30 rpm, U = 50, u = 60). Utför alla efterföljande enzymatiska reaktioner med följande steg.
   • Späd reaktions buffertar med nukleas-fritt vatten.
   • Lägg till alla andra reagenser (utom enzymer) till utspädd buffert.
   • Blanda ordentligt. Resuspendera pärlor / pellet med reaktionsblandningen.
   • Lägg enzymet återsuspenderas pärlor / pellet (Håll enzymer bänk kylbox alltid för att säkerställa maximal enzymatisk aktivitet).
   • Försegla röret med parafilm.
   • Säkerställa att pärlorna är väl blandade under hela incubation.
3. Kassera reaktionsblandningen och tvätta bort kvarvarande buffertsalter och enzymer tre gånger med iskall tvättbuffert (10 mM Tris-Cl pH 7,5, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl).

2. Ligering av biotinylerade Halva linkers till ChIP DNA

I detta kapitel av videon belyser egenskaperna hos de halv-linker oligonukleotider som används vid konstruktion av chia-PET och användning av nukleotid streckkod sammansättning att skilja mellan icke-specifika och specifika ligeringsprodukterna (13:28 till 14:24) av video). Kapitlet visar också steg-för-steg att inrätta en halv linkerligering reaktion (steg 2,2, från 14:24 till 15:54 i videon).

Två typer av biotinylerade halva linkers införs i detta protokoll och är utformade med en intern streckkod av fyra nukleotider (TAAG eller ATGT) och ett igenkänningsställe för den typ IIS restriktionsenzymet MmeI (TCCAAC). Efter ChIP berikaning, sonikerades kromatin fragment delas lika i två alikvoter och ligeras först med ett överskott av antingen halv-linker A eller halv-linker B ^5,9.

1. Fördela Chip-berikade pärlor i två portioner för DNA halv-linkerligering av biotinylerad halva linkers A eller halva linkers B respektive. Dessa två halva linkers har samma nukleotidsekvenser, förutom fyra nukleotider i mitten, vilka tjänar (Half-linker A med TAAG; halv-linker B med ATGT) som nukleo streckkoder. När de kombineras under närhet ligering, slumpmässiga och icke-specifika ligeringar mellan två olika CHIP komplex kan identifieras från populationen av sekvenser med heterodimerkomplex AB linkers, jämfört med specifika ligeringar som kan identifieras från populationen av sekvenser med homodimer AA eller BB linkers .
2. Ligatet Chip-anrikade pärlor med 140 | il 5 x T4 DNA-ligas-buffert med PEG, 3,5 pl 200 ng / | il biotinylerad halva linkers A eller B, 553,5 | il nukleas-fritt vatten och 3 pl 30 U / ^ il T4 DNA-ligas (Se T4 DNA-ligas på en bänk kylbox vid alla tidpunkter som ligaser är instabila till och med på is). Försegla röret med parafilm och inkuberas över natten vid 16 ° C med rotation.

3. Eluering och närhet Ligering av chip DNA-fragment

I detta kapitel av videon förklarar roll Buffer EB, SDS och Triton X-100 under elueringen av kromatin komplex från pärlor och visar även steg-för-steg att inrätta en cirkularisering reaktion (steg 3,9, 15:54 för att 17:10 av video).

Efter ligering av halva linkers till de kromatin fragment, båda fraktionerna sammanslogs och eluerades från pärlorna. Samverkande DNA-fragment kommer sedan att kopplas med en komplett linkersekvens under närhet ligering.

Använda nukleotid streckkoden sammansättningen kan sekvenserna delas in i tre kategorier, nämligen sekvenser wite heterodimer AB-linkers (streckkod ATGT / TAAG) och sekvenser med homodimer AA eller BB-linkers (streckkod TAAG / TAAG eller ATGT / ATGT) för att skilja icke-specifika och specifika ligeringsprodukter respektive ^9.

Följaktligen medger användning av två halv-linkers med olika nukleotidsekvenser streckkoder specificering av olika experiment eller replikat, såväl som att övervaka icke-specifik chimära ligering hastighet mellan olika CHIP komplex ^5.

1. Tvätta halv-linker-ligerade pärlor tre gånger med iskall tvättbuffert (10 mM Tris-Cl pH 7,5, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl).
2. Kombinera båda rören hos halv-linker-ligerade pärlor på följande sätt.
   • Återvinna en av rören i halv-linker-ligerade pärlor med användning av en magnetisk partikelkoncentrator ("Rör A").
   • Hålla den andra röret av halv-linker-ligerade pärlor på is ("Rör B").
   • Kasta Tvättbuffert (från steg 3.2.1) from Tube A och överför halv-linker-ligerade pärlor (från steg 3.2.2) från rör B i Tube ett tag Tube A fortfarande på den magnetiska partiklar samlare.
   • Lägg 700 ul iskall tvättbuffert Tube B för att samla in eventuella kvarvarande halv-linker-ligerade pärlor och se båda rören av halva-linker-ligerade pärlor kombineras på rätt sätt. Överför tvättbufferten i röret A. Kasta den tomma tuben B.
3. Fosforylerar halv-linker-ligerade pärlor med 70 | il 10 x T4 DNA-ligas (NEB), 616 | il nukleas-fritt vatten och 14 | il 10 U / fil T4-DNA-polynukleotidkinas. Inkubera under 50 min vid 37 ° C med rotation.
4. Återvinna fosforylerade halv-linker-ligerade pärlor med användning av en magnetisk partikelkoncentrator och kassera reaktionsblandning.
5. Eluera halv-linker-ligerade kromatin-DNA-komplexet med 200 | il färskt framställd elueringsbuffert (TE-buffert, 1% SDS). Inkubera under 30 minuter vid rumstemperatur (22 °C) med rotation.
6. Överföra eluat till ett nytt rör och sköljning pärlor med 900 | il buffert EB. Överför supernatanten till samma rör att kombinera elueringar.
7. Överföra uppsamlade eluatet till filtret koppar två filter centrifugrör och centrifugeras vid 16.110 x g (13.200 rpm) i 1 minut vid rumstemperatur (22 ° C).
8. Sekvestrera SDS genom tillsats 90 pl 20% Triton X-100 och invertera att blanda väl. Inkubera under 1 timme vid 37 ° C.
9. Cirkularisering utförs under extremt utspädda förhållanden för att gynna ligeringsprodukter händelser inom enskilda tvärbunden kromatin komplex och samtidigt minimera ligeringsprodukter händelser mellan olika kromatin komplex som skulle ge upphov till oönskade chimära DNA-molekyler. Arbetar på is, överför kylda eluat till en 50 ml Falcon-rör och tillsätt 7776 pl nukleas-fritt vatten, 1000 ^ il 10 x T4 DNA-ligas (NEB) och 33,33 | il 30 U / ^ il T4 DNA-ligas. Inkubera över natten vid 16C.

4. Omvänd Tvärbindning och DNA Rening

Detta kapitel video visar steg-för-steg förfarande av fenol: kloroformextraktion (steg 4,3, från 17:11 till 17:59) och närbild av det pelleterade DNA efter centrifugering i steg 4,4.

1. Omvänd tvärbindning och försämra proteinet genom tillsats av 100 | il 20 mg / ml proteinas K-lösning. Inkubera under 2 timmar vid 50 ° C.
2. Överföra kromatin-DNA in i en 50 ml MaXtract högtäthets och tillsätt 9 ml nukleas-fritt vatten för att erhålla en slutlig volym av 19 ml.
3. Tillsätt 19 ml 25:24:1 fenol-kloroform-isoamylalkohol pH 7,9 till röret i en kemisk draghuv och invertera att blanda väl. Snurra rören under 5 min vid 1800 x g (3000 rpm) vid rumstemperatur.
4. Överföra övre vattenhaltiga fasen till ett 50 ml Oak Ridge rör centrifug (Teflon FEP) och fällningen kromatin-DNA med 1,9 ml 3 M natriumacetat, pH 5,5, 19 ml isopropanol och 5 pl Glycoblue. Glycoblue tillsätts för att öka synligheten av pelleten.
5. Inkubera vid -80 ° C under minst en timme. Tillåta den frysta lösningen för att tina före centrifugering vid 38.720 x g (18.000 varv per minut) under 30 minuter vid 4 ° C.
6. Efter centrifugering av isopropanol utfällda DNA, tvätta DNA-pelleten med 75% iskall etanol två gånger och återsuspendera DNA-pelleten i 34 pl buffert EB. Överföra DNA blandningen till en 1,7 ml DNA-LoBind röret.
7. Återsuspendera DNA pelleten i 34 ul buffert EB.
8. (RNas behandling är frivillig när det efterföljande tvätt-och reningssteg i CHIA-PET-protokollet syftar till att avlägsna kontaminerande RNA och manuella kontroller av Chia-PET-sekvenser från våra interna biblioteken har visat några spår av förorenande RNA).
   • Utföra RNas-digerering genom tillsats av 10 | il RNas ETTA 10 Buffert X Reaction 55 pl nukleas-fritt vatten och 1 pl 10 U / ^ il RNas ETT Ribonukleas. Inkubera vid 37° C under en timme.
   • Överföra kromatin-DNA in i en 2 ml MaXtract hög densitet. Tillsätt 100 pl 25:24:1 fenol-kloroform-isoamylalkohol pH 7,9 till röret i en kemisk draghuv och invertera att blanda väl. Snurra röret under 5 minuter vid 16.110 x g (13.200 rpm) vid rumstemperatur (22 ° C).
   • Överföra övre vattenfasen till ett nytt rör och fällningen omvänd-tvärbunden DNA med 10 | il 3 M natriumacetat, pH 5,5 och 100 pl isopropanol. Inkubera vid -80 ° C under 30 minuter och pelleten DNA i 30 minuter vid 16.110 x g (13.200 rpm) vid 4 ° C.
   • Efter centrifugering av isopropanol utfällda DNA, tvätta DNA-pelleten med 75% iskall etanol två gånger och återsuspendera DNA-pelleten i 34 pl buffert EB.

5. Immobilisering av chia-PET-DNA till streptavidinpärloma

Införandet av detta kapitel talar om förekomstenav MmeI igenkänningsstället och biotinylerade T finns i de halv-linker oligonukleotider för att underlätta utvinning av tagg-linker-tagg-konstruktioner ("Pets", från 18:02 till 19:10 i videon). Dessutom ger detta kapitel av videon också en snabb överblick över steg 5,2, steg-för-steg att inrätta en PCR-reaktion (steg 6,1, från 19:10 till 20:00 i videon) och skära ut en framgångsrik CHIA-PET DNA (steg 6,9, från 20:00 till 20:30).

Halva linkers A och B innehåller flankerande MmeI igenkänningsställen, vilket tillåter denna restriktionsenzym typ Ils för att skära 18/20 baspar nedströms om deras mål-bindningsställen för att generera korta-taggarna i kromatin-fragmentet, producera parade tagg-linkerkombination-påhängsadaptrar konstruktioner ("PET").

För att möjliggöra rening av PET-konstruktioner av streptavidin-beskiktade magnetiska pärlor, både halv-linker A och B är modifierade med biotin, vilket möjliggör infångning och rening av Chia-PET-konstruktioner.

1. Frisättning captured CHIA-PET-DNA genom tillsats av 5 jil 10 x NEBuffer 4, 5 il nyframställd 500 pM (10 x) S-adenosylmetionin (SAM) och 1 | il 2 U / ^ il MmeI till återsuspenderade DNA. Släckning av överskott av MmeI genom att tillsätta 5 ^ il icke-biotinylerade halva linkers till reaktionsblandningen för MmeI kan vara själv-inhiberande i överskott. Inkubera under 2 timmar vid 37 ° C.
2. För att fånga frigörs CHIA-PET DNA, överföring 50 ^ av återsuspenderad M-280 streptavidin pärlor till ett DNA LoBind rör. Tvätta pärlorna två gånger med 2 x bindnings-och tvättningsbuffert (2 x svartvita: 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl). Återsuspendera pärlor i 50 | il 2 x B & W buffert och överför 50 | il av digerering blandning (från steg 5,1) till samma rör. Blanda väl och inkubera under 45 minuter vid rumstemperatur med rotering.
3. Återvinna pärlor med användning av en magnetisk partikelkoncentrator och kasta supernatanten. Tvätta pärlorna två gånger med 150 pl 1 x bindnings-och tvättningsbuffert (1 x svartvita: 5 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl).
4. Återvinna pärlor med användning av en magnetisk partikelkoncentrator och kasta supernatanten. Tvätta pärlor tre gånger med 150 pl 1 x B & W Buffer.
5. Nick translate CHIA-PET-DNA med 5 pl 10 x NEBuffer 2, 2,5 | il 10 mM dNTP, 38,5 | il nukleas-fritt vatten och 4 | il 10 U / ^ il Escherichia coli-DNA-polymeras I. Inkubera över natten vidrumstemperatur (22 ° C) med rotation.
6. Återvinna pärlor med användning av en magnetisk partikelkoncentrator och kasta supernatanten. Tvätta pärlor tre gånger med 150 pl 1 x B & W Buffer.
7. Återsuspendera pärlorna med 50 | il buffert EB.

6. Förstärkning av CHIA-PET DNA

1. Ställ in PCR-reaktioner med 2 pl pärlor suspension, 21 ul nukleasfritt vatten, 1 pl 10 M Illumina 1-454 primer, 1 pl 10 M Illumina 2-454 primer och 25 pl Phusion High Fidelity Master Mix.
2. För att bestämma antalet cykler som krävs för att generera tillräckligt med PCR-produkter för sekvensering, inrättat tre tester PCR-reaktioner med 16, 18 och 20 cykler. Överskrid inte 20 cykler som vi har funnit att göra så resulterar i mycket låg biblioteket komplexitet.

Första steg	30 sekunder	98 ° C	(Denaturering)
18 till 25 cykler	10 sekunder	98 ° C	(Denaturering)
	30 sekunder	65 ° C	(Hybridisering)
	30 sekunder	72 ° C	(Förlängning)
Sista steg	5 minuter	72 ° C	(Slutlig förlängning)

3. Bestämma den lägsta möjliga antalet cykler genom att köra PCR-reaktioner på en 4-20% gradient-TBE-gel och färgning med SYBR Green I, säkerställer närvaron av ett band av 223 baspar, vilket är längden av Chia-PET-DNA.
4. Amplifiera resten av Chia-PET-DNA-bundna streptavidinpärloma i en storskalig PCR med så få PCR-cykler som möjligt samtidigt som man fortfarande erhåller tillräcklig sträckgräns för sekvensering.
5. Reanspråk pärlorna från alla PCR-reaktioner med användning av en magnetisk partikelkoncentrator och poolen supernatanten till två nya rör DNA LoBind. Utfälla varje rör av supernatanten genom tillsats av 60 | il 3 M natriumacetat, 2 | il GlycoBlue och 600 | il isopropanol för att poolade reaktioner.
6. Inkubera vid -80 ° C under 30 minuter. Centrifugera vid 16.110 x g (13.200 rpm) under 30 minuter vid 4 ° C.
7. Efter centrifugering av isopropanol utfällda DNA, tvätta DNA-pelleten med 75% iskall etanol två gånger och återsuspendera DNA-pelleten i 100 | il TE-buffert och 5 pl 6 x laddningsfärg.
8. Distribuera PCR-produkter jämnt in i brunnarna i en 6% TBE-gel. Kör gelen i 1 x TBE-buffert vid 200 V i 35 minuter och färgas med SYBR Green I. Visualisera gelen med en mörk Reader transilluminator.
9. Försiktigt skära ut 223 bp bandet från gelén och utföra "gel krossa" protokoll DNA-extraktion enligt följande:
   • Placera utskurna gelfragment i 0,6 ml microcentrifuge rör som ha hål i botten med en 21 G-nål.
   • Placera varje rör inuti ett 1,5 ml skruvlock rör och centrifugera vid 16.110 x g (13.200 rpm) under 5 minuter vid 4 ° C.
   • Tillsätt 200 | il TE-buffert, pH 8,0 till varje rör och säkra de gelstycken helt nedsänkt i buffert.
   • Frysa vid -80 ° C under en timme och inkubera vid 37 ° C över natten.
   • Överföra gelstycken tillsammans med buffert i varje rör till filtret kopp ett centrifugrör filter och centrifugera vid 16.110 x g (13.200 rpm) under 10 minuter vid 4 ° C.
   • Skölj varje 1,5 ml rör med 200 | il TE-buffert, pH 8,0 och överföring sköljning buffert till varje filterenhet vid fullbordande av det första omgång.
   • Pool filtret genom och fällningen med isopropanol.
   • Återsuspendera DNA-tabletten med 15 pl TE buffert.

7. Kvalitet Kontrollera enD-förstärkning över Chia-PET DNA

1. Fortsätt med kvalitetskontroll med Agilent DNA 1000 analys och Agilent Hög känslighet DNA-analys på Agilent Bioanalyzer 2100.
2. Det elektroferogram av Agilent DNA-analysen ska bara visa en topp tillsammans med en plan baslinje innan man Illumina Genome Analyzer IIx sekvensering.
3. Före Illumina Genome Analyzer IIx sekvensering, Chia-PET-DNA bör idealt ha en minsta koncentration av 10 nM. Utföra en 4-punkts kvantitativ PCR enligt Illumina qPCR Kvantifiering protokoll guide för att bestämma mängden av prov för att ladda in i flödescellen. Alternativt, utföra en-punkts kvantitativ PCR enligt följande:
   • Späd den styrmall till 100 pM, 10 pM och 1 pM. Som beskrivs i Illumina qPCR Kvantifiering protokoll är en styrmall definieras som bibliotek förberedda för sekvensering på Illumina plattformen och det ska vara så lika som möjligt i fråga ommallen storlek, GC-innehåll och bibliotek typ.
   • Späd Chia-PET-DNA till 10 pM.
   • Ställ in PCR triplikat av varje spädning med 0,1 pl qPCR Primer 1,1, 0,1 pl qPCR Primer 2,1, 5 pl LightCycler480 DNA SYBR Green I Master Mix, 3,8 pl nukleas-fritt vatten och 1 pl mall med Roche Applied Science LightCycler 480 Real-Time PCR-System. Innefattar två negativa kontroller med användning av 1 | il av nukleas-fritt vatten som mall.
     • Initial denaturering
       • 95 ° C 5 minuter 4,8 ° C / s
     • Amplifiering
       • 95 ° C 10 sekunder 4.8 ° C / s
       • 60 ° C 1 minut 2,5 ° C / s
       • 72 ° C 30 sekunder 4,8 ° C/ S
     • Smältkurva
       • 95 ° C 5 sekunder 4.8 ° C / s
       • 65 ° C 1 minut 2,5 ° C / s
       • 95 ° C 5 förvärv per ° C
     • Kylning
       • 40 ° C 10 sekunder 2,0 ° C / s
   • Säkerställa att de negativa kontrollerna visar ingen amplifiering och att standardavvikelsen för de Ct-värdena är mindre än 0,1 vid beräkningen av den koncentration av biblioteksmallar baserat på den standardkurva som genererats från utspädningarna styrmallen.
4. Generera kluster på ytan av Illumina flödesceller genom laddning 13:05 into Illumina CBOT Cluster Generation System enligt anvisningarna på skärmen.
5. Fortsätt till sekvensen CHIA-PET-DNA på Illumina Genome Analyzer IIx användning Illumina 3-454 sekvenseringsprimer och Illumina 4-454 sekvenseringsprimer i en enda bana för att se kvaliteten av biblioteket. Lagra återstående CHIA-PET-DNA vid -20 ° C. Om biblioteket har goda uppgifter, förbereda provet för ytterligare körningar på 4 till 8 körfält som behövs baserat på prov körfält resultaten för att få 18 till 20.000.000 unika läsningar.
   • Mängden CHIA-PET DNA lastas på flödescellerna beror till stor del på vilken version av sekvensering dataanalys programvara, Illumina s Sekvensering kontroll Studio. För version 2,9, läser lastning koncentrationen varierar från en tredjedel till hälften av den maximala kapaciteten i varje platta, vilket motsvarar cirka 21 miljoner filtreras pass med cirka 9500 tusen läser om teknik.
   • Minskad belastning är nödvändigt för att säkerställa korrekt bas-samtal feller streckkoder sekvenserna av linkers. Detta fel inträffar när ett stort antal liknande nukleotider sekvenseras, såsom är fallet om länkaren sekvenseras för att erhålla streckkodning informationen. Om streckkodning informationen inte är önskvärd, och linkers inte läsa, sedan full belastning koncentration kan användas.
6. De qSeq filer som konverterats med offline basen som ringer kan ytterligare analyseras med hjälp av Chia-PET verktyg enligt Chia-PET Tool installationsmanualen (Version 4.1) ^8.

C. Representativa CHIA-PET-resultat

Konstruerade vi framgångsrikt CHIA-PET bibliotek med användning av RNA-polymeras II-antikropp (8WG16) i MCF-7 celler (CHM160 och CHM163) ⁹ med användning av 672 ng av spånmaterial, såsom beskrivits ovan. Den initiala diagnostiska gelen köra denna PCR-amplifierade bibliotek, som nämns i steg 6,2 av CHIA-PET-protokollet, visas en ljus och väldefinierad band vidden förväntade storleken 223 baspar för alla PCR-cykling (se figur 4).

16 PCR-cykler användes för amplifiering av CHIA-PET-bibliotek och ett totalt utbyte av 17,1 ng erhölls. En enda, intensiv elektroferogram topp observerades vid den förväntade storleken på 223 baspar via Agilent DNA 1000 analys som nämns i steg 7,1 av CHIA-PET-protokollet (se figur 5).

Figur 1. ChIP översikt. MCF-7-celler är dubbla tvärbunden med etylglykol bis (succinimidylsuccinat (EGS) och formaldehyd sekventiellt, vilket resulterar i kovalenta länkar mellan spatialt intilliggande kromatin. Den tvärbundna kromatin erhölls från de fasta MCF-7 celler genom cell-lys och nukleära lys. kromatinet utsattes sedan för fragmentering till ett storleksintervall av 200-600 baspar. Efter för-rensa sonikerade kromatin med Protein G magnetiska pärlor för att avlägsna icke-specifik DNA, före rensas kromatin immunutfälldes över natten med antikropp-belagda pärlor för att fånga kromatin av intresse.

Figur 2. Gelanalys av sonikerade kromatin-fragment. En 100 bp DNA-stege visas i den första och sista spår för storlek referens. Det sonikerade kromatin visas stark intensitet mellan 200 till 600 bp som är idealisk för att fånga långsiktiga kromatin interaktioner.

Figur 3. CHIA-PET översikt. Splittrade kromatin fragment slutet trubbiga och ligerades biotinylerade halva linkers innehåller flankerande ställen MmeI begränsning. Intakta kromatin komplex elueras därefter från pärlorna och utsattes för ligering närhet under mycket utspädd betingelser, sådana att samverkande DNA-fragmentet är preferentially ligerades till varandra. Efter omvänd tvärbindning för att avlägsna DNA-associerade proteiner är MmeI digerering utfördes för att frigöra taggen, linkern-tag (PET)-konstruktioner, vilka sedan renas genom selektiv bindning till streptavidin-pärlor. PET konstruktionerna ligeras med adaptrar för hög genomströmning sekvensering.

Figur 4. Gelanalys av chia-teknik efter PCR-amplifiering. En 25 bp DNA-stege visas i spår 1 och 5 för storlek referens. Banorna 2 till 4 är PCR-produkter genererade efter 16, 18 och 20 cykler av PCR-amplifiering från 2 | il av vulst-immobiliserat mall, respektive. Detta är en framgångsrik bibliotek, såsom indikeras av de ljusa och väldefinierade band vid den förväntade storleken 223 bp. Den icke-specifika utstryk genereras när antalet PCR-cykler ökas medan det lägsta bandet av varje PCR-reaktion består av primerdimerer.

Figur 5. Agilent 2100 Bioanalyzer analys av renat Illumina-454 adaptorligerade CHIA-teknik. Screen fånga Agilent 2100 Bioanalyzer elektroforesdiagram profilering en framgångsrik bibliotek, med en enda intensiv topp vid den förväntade storleken på 223 bp. Observera att Agilent Bioanalyzer analysen oftast rapporterar en något högre än förväntade storleken, i detta fall den önskade toppen som visas vid 237 bp istället för 223 bp. Detta är inom 10% fel räckvidd Agilent analysen.

Discussion

CHIA-PET är en metod utvecklats för att identifiera långsiktiga interaktioner i transkriptionsreglering. En av de kritiska faktorerna som bestämmer kvaliteten hos en CHIA-PET-bibliotek är kvaliteten av spånmaterial.

Protokollet visat i filmen omfattar användningen av EGS och formaldehyd för att tvärbinda cellerna. Användningen av formaldehyd tillsammans med en andra tvärbindande reagens som bär en längre distansarm kan hjälpa till i bindning av proteiner som inte skulle vara bundna av formaldehyd enbart ^3,11,15. Vi har byggt bibliotek med denna metod som har visat robusta bindningsställen och lång räckvidd interaktioner ^9. Emellertid kan tvärbindning och CHIP förhållanden bör optimeras för varje faktor av intresse, och det är viktigt att inte över-tvärbindning för mycket tvärbindning kommer att resultera i svårigheter att fragmentering av ultraljudsbehandling, och eventuellt resultera i felaktiga kromatin interaktioner . Kromatin interaktioneridentifieras av Chia-PET skall valideras genom en annan metod, såsom fluorescens in situ hybridisering ^4.

Vi rekommenderar minst 100 ng kromatin material. Även om vi har konstruerat god kvalitet biblioteken från 50 ng kromatin material, har vi observerat att stora mängder av utgångsmaterial får bygga CHIA-PET bibliotek med mindre än 16 PCR-cykler och därigenom minimera amplikoner och redundans i varje bibliotek. Denna lägre redundans korrelerade med högre mappas unika taggar och också en hög andel av användbara data, vilket möjliggör en mer omfattande karta kromatin interaktion med färre körfält i sekvensering. Den slutliga packad volym av pärlor i varje rör bör vara 50 ^ il och 100 pl för magnetiska och Sepharose-pärlor respektive. Om packade pärlan volymen är mindre än vad som anges, ta den minsta packad volym med liknande förväg rensas tomma magnetiska eller Sepharose pärlor för att minimera förlusten av DNA-bärande pärlas i efterföljande steg. Avsågade spetsar eller stora kärnor tips bör användas för pipettering Sepharose-pärlor.

Följande ändringar har införlivats efter tidigare publicerade CHIA-PET protokoll ^5. För det första var magnetiska G pärlor används för att minimera provförlust under tvättar. Dessutom identifierade vi icke-specifika band med ungefärliga storlekar av 100 bp och 138 bp vara amplikoner av självligerades halva linkers och / eller adaptrar. Således reduceras vi koncentrationen av biotinylerade halva linkers och 454 GS20 adaptorer för att minimera icke-specifika band under PCR-amplifiering. Närheten Ligeringen reducerades från 50 ml till 10 ml för att minimera provförlust under efterföljande reningssteg och även spara på reagens kostnader. Vi ökade också inkubationstiden för att immobilisera CHIA-PET DNA till pärlor för att säkerställa maximal fångst av CHIA-PET DNA på streptavidinpärloma.

Under den närhet ligeringssteget, chimera ligeringar that representerar inte sant in vivo kromatin interaktioner oundvikligen genereras i en icke-specifik och slumpmässigt sätt. Därför, för att utvärdera kvaliteten på de uppgifter från alla CHIA-PET experiment är graden av chimerism beräknas från användningen av två olika halva linkers med särskild nukleotid streckkoder TAAG och ATGT ^5. Efter high-throughput sekvensering är Chia-PET-sekvenser analyseras först för linker streckkod komposition och sekvenser som härrör från specifika ligeringsprodukter produkter och icke-specifika produkter ligeringsprodukter kan urskiljas ^8. Den procentuella andelen kända chimärer (dvs. heterodimerer AB linkers) som förekommer i vår egen MCF-7 RNA-polymeras II CHIA-PET bibliotek är mindre än 15%.

CHIA-PET-sekvenser därefter delas in i två kategorier, nämligen självligering husdjur och inter-ligering husdjur. Självligering teknik erhålls från själva cirkularisering ligering av kromatinet fragmenten, medan inter-ligeringsprodukterna teknik härrör från inter-ligering mellan två olika DNA-fragment. Den senare är då indelad i tre olika kategorier baserat på den genomiska avstånd varje tagg på samma kromosom (intrakromosomal inter-ligeringsprodukterna PET) eller att båda taggarna mappas till två olika kromosomer (interchromosomal inter-ligeringsprodukter PET). Vi har utvecklat en CHIA-PET-paketet verktyg för programvara för att reda ut de olika kategorierna ^8. Detta kommer att baseras på de DNA-fragment som finns i biblioteket. I allmänhet kommer mindre CHIP fragment ger en högre upplösning och avskurna för dessa RNA-polymeras II CHIA-PET bibliotek är ca 4 kb.

Dessutom kan verkliga kromatin interaktioner särskiljas från slumpmässigt brus genom att räkna antalet inter-ligering teknik i en växelverkan kluster, med andra ord ett kluster av hög PET räkna sägs ha en högre sannolikhet att vara en riktig kromatin samspel ⁸ .

Om du vill filtrera våra falska positiva enöka från höganrikat ankare som kan bilda inter-ligeringsprodukterna husdjur genom slumpen har en statistisk analys ramen även tagits fram för att redovisa för slumpmässig bildande av eventuella tillstötande ligeringsprodukterna teknik mellan två ankare ^8.

Sammanfattningsvis kan Chia-PET tekniken kartläggning nät kromatin interaktion på en global skala. Genomförande av ChIP i Chia-PET tillåter reduktion av bibliotekets komplexitet och bakgrundsbrus. Dessutom, tillägger ChIP specificitet till kromatin interaktioner, vilket möjliggör granskning av de särskilda kromatin interaktioner i samband med särskilda transkriptionsfaktorer ^5.