Insan derisi punch biyopsi gelen fibroblast eksplant kültür protokolü düşük bir geçit numaradan milyon 15-20 hücre bankacılığı için 4-8 hafta içinde cilt hücrelerini elde etmek teknik olarak sağlam ve basit bir yoludur.
Hastalığı olan bir bireyden elde edilen dokular ve hücre çizgileri, hastalıkla ilişkili hücre fenotipleri çalışma yapmak için ideal kaynaklarıdır. Bu protokolde Hasta elde edilen fibroblast başarılı modeli hastalığı 1 ile uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetme kullanılmaktadır. Bu fibroblastlar erken geçişleri de belirli bir hastalık yolları mekanizmaları 2 ve daha sonraki ilaç tarama yaklaşımı incelemek için hücre bazlı fonksiyonel deneyleri için de kullanılabilir. Enzimatik prosedürler üzerinde Sunulan protokol avantajı 1) enzimatik tedaviler kullanarak yaşlı hastalar, Parkinson hastalığı, 2 ile etkilenen hastalarda) daha zor metodolojileri fazla teknik olarak basit bir yaklaşım türetilen doku küçük miktarlarda tekniğinin yeniden üretimde kıtlık ve 3 vardır ) zaman göz: Bu protokol 15-20 dakika sürer ve biyopsi geldikten sonra hemen yapılabilir. Enzimatik tedaviler 4 saat kadar sürebilir ve sorunları olabilirhücre canlılığı ve doğru kullanılmadığında hücrelerin sonraki ekin Overdigestion, azaltılması. Bu protokol, 4 mm insan derisi bir fibroblast kültür türetme için biyopsi diseksiyon ve hazırlık açıklar ve hasta kaynaklı doku örnekleri ile uğraşırken önemli olan çok yüksek başarı oranına sahiptir. Bu kültürde, keratinositler hazırlandıktan sonra ilk hafta içinde biyopsi doku dışına göç. Fibroblast keratinositlerin ilk akıbet sonra 7-10 gün görünür. % 20 FBS ile takviye DMEM yüksek glukoz medya keratinositlerin ve fibroblastların üzerinde fibroblast büyüme keratinositleri büyümek olacak yanadır. 2 pasajlar sonra keratinositler fibroblast işaretleyici SERPINH1 (HSP-47) ifade nispeten homojen fibroblast kültürlerinde neden dışarı seyreltilmiş edilmiştir. Bu yaklaşımı kullanarak, da 15-20 milyon fibroblast hücre bankacılığı için 4-8 hafta içinde elde edilebilir. Cilt diseksiyonu 15-20 dakika sürer, hücreler daha sonra günde bir kez izlenirmikroskop altında, ve medya 2-3 günde bağlanma ve hücre akıbet sonra değiştirilir.
Bu protokol ile, deri fibroblast nispeten saf kültürleri elde edilebilir. Fibroblastlar oval hücre çekirdekleri yuvarlak uzun, iğ gibi hücre gövdeleri, karakteristik morfolojik özelliklere sahip, ve ne zaman birleşik fibroblast uyumlu ve demetleri büyür. Medya fibroblast büyüme örneğin keratinositler ilaveler ve büyüme faktörleri gerekir, ya da mitotik daha az aktif olan diğer hücre popülasyonlarının ise, bu nispeten saf fibroblast kültürleri sağlar destekler.
<p class="jove_conten…The authors have nothing to disclose.
Bu protokolün geliştirilmesi Rejeneratif Tıp California Institute (CIRM, TR1-01246) ve Parkinson Alliance tarafından finanse edildi.
Name of Equipment | Company | Catalogue Number |
Dissecting microscope | Leica | S6E |
10 cm Tissue Culture Petri dish | VWR | 25382-166 |
6-well Tissue Culture plate | VWR | 73520-906 |
Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex | VWR | 21909-660 |
Sterile pointed-tip forceps | ||
50 mL Conical tubes | VWR | 21008-940 |
2 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-894 |
5 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-896 |
10 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-898 |
Pasteur Pipettes | VWR | 14672-380 |
Table A. Table of specific reagents and equipments.
Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
1X DMEM: High Glucose | Invitrogen/Gibco | 11960-069 |
20% Fetal Bovine Serum | Invitrogen/Gibco | 26140-079 |
1X L-Glutamine | Invitrogen/Gibco | 25030-164 |
1X MEM Non-essential Amino Acids | Invitrogen/Gibco | 11140-076 |
1X Penicillin/Streptomycin | Invitrogen/Gibco | 15140-163 |
Table B. Reagents.