Summary
بروتوكول ثقافة يزدرع الخلايا الليفية من الخزعات لكمة جلد الإنسان هو وسيلة قوية من الناحية الفنية وبسيطة لاستخلاص خلايا الجلد في غضون 4-8 أسابيع للأعمال المصرفية من حوالي 15-20 مليون خلية في عدد مرور منخفض.
Abstract
الأنسجة وخطوط الخلايا المشتقة من الفرد مع المرض هي مصادر المثالي لدراسة الظواهر الخلوية المرتبطة بتلك الأمراض. الخلايا الليفية المريض المستمدة في هذا البروتوكول قد استخدمت بنجاح في اشتقاق الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها المرض إلى نموذج 1. ويمكن أيضا الممرات في وقت مبكر من هذه الخلايا الليفية أن تستخدم لالمقايسات الفنية المستندة إلى الخلايا لدراسة مسارات محددة المرض، وآليات 2 والنهج فحص المخدرات لاحقة. الاستفادة من بروتوكول المعروضة على الإجراءات الأنزيمية هي 1) استنساخ هذه التقنية من كميات صغيرة من الأنسجة المستمدة من المرضى من كبار السن، مثل المرضى المصابين يعانون من مرض باركنسون، 2) نهج بسيط من الناحية الفنية على منهجيات أكثر تحديا باستخدام العلاجات الأنزيمية، و3 ) النظر الوقت: هذا البروتوكول يأخذ 15-20 دقيقة ويمكن القيام بها على الفور بعد وصول الخزعة. العلاجات الأنزيمية يمكن أن يستغرق فترة تصل الى 4 ساعات ولها مشاكلoverdigestion، والحد من بقاء الخلية والمرفقات اللاحقة من الخلايا عندما لم يتم التعامل معها بشكل صحيح. يصف هذا البروتوكول تشريح وإعداد الجلد البشري 4 ملم خزعة لاشتقاق ثقافة الخلايا الليفية، ولها نسبة نجاح عالية جدا وهو أمر مهم عند التعامل مع عينات الأنسجة المشتقة من المريض. في هذه الثقافة، الكيراتينية تهاجر من الأنسجة خزعة خلال الأسبوع الأول بعد إعداد. الخلايا الليفية تظهر بعد 7-10 أيام ثمرة أول من الخلايا الكيراتينية. DMEM وسائل الإعلام ارتفاع نسبة الجلوكوز تستكمل مع FBS 20٪ تفضل ونمو الخلايا الليفية أكثر من الخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية اكتسى الخلايا الكيراتينية. بعد 2 الممرات وقد تضعف الخلايا الكيراتينية خارج مما أدى إلى الثقافات الليفية متجانسة نسبيا والذي يعبر عن الخلايا الليفية SERPINH1 علامة (HSP-47). باستخدام هذا النهج، يمكن أن تستمد 15-20000000 الخلايا الليفية في 4-8 أسابيع للأعمال المصرفية الخلية. تشريح الجلد يستغرق حوالي 15-20 دقيقة، ثم يتم رصد خلايا مرة واحدة في اليومتحت المجهر، وسائل الإعلام يتم تغيير بعد كل 2-3 أيام المرفقات وثمرة من الخلايا.
Protocol
يجب أن تبقى على الجلد التي تم الحصول عليها لكمة خزعة باستخدام الإجراء القياسي 3 (على سبيل المثال تم الحصول عليها مع 4MM صك Visipunch جولة) في كامل DMEM 20٪ FBS وسائل الاعلام على الجليد. مرة واحدة قد وصلت العينة في المختبر، معالجة خزعة في أقرب وقت ممكن.
1. إعداد الجلد لكمة خزعة
الخطوات 1،1-1،3 التي يتعين القيام بها داخل مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية
- إعداد مقدما: إضافة 1 مل من 0.1٪ الجيلاتين إلى كل بئر من لوحة 6 جيدا. تعيين لوحة جانبا لمدة 30-60 دقيقة. نضح الحل الجيلاتين وإضافة 800 ميكرولتر من اكتمال DMEM/20٪ FBS وسائل الإعلام إلى كل بئر. ضمان كامل سطح البئر مغطاة مع وسائل الإعلام.
- عكس غطاء العقيمة 10 سم صحن زراعة الأنسجة وإضافة 1.5 مل من DMEM / 20٪ FBS وسائل الاعلام الى منتصف الغطاء وانتشرت في إسقاط وسائل الإعلام مع غيض من ماصة المصلية.
- باستخدام ملقط معقم، مكان رانه الجلد خزعة قطعة في وسائل الإعلام على طبق.
2. تشريح من الجلد لكمة خزعة
الخطوات من 9 2.1-2.2 التي يتعين القيام بها داخل الأفقية الرقائقي غطاء تدفق
- وضع الجزء السفلي من صحن 10 سم على غطاء المقلوب، ونقل الجلد خزعة إلى مجهر تشريح في تدفق الصفحي هود.
- تشريح الجلد الجولة 4 ملم خزعة إلى 12-15 قطعة بحجم بالتساوي مع حواف حادة عن طريق قطع قطعة في متساويين باستخدام مشرط واحدة لاجراء خزعة في المكان ومشرط الثانية لخفض مع تحريك المتداول في اتجاه واحد. القطع مع حواف خشنة يسهم في ضعف التعلق / خلية ثمرة.
3. نقل الجلد تشريح خزعة القطع في لوحات زراعة الأنسجة
الخطوات هي 3،1-3،6 التي يتعين القيام بها داخل مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية
- وضع الجزء السفلي من صحن سم زراعة الأنسجة 10على الجزء العلوي من الغطاء المقلوب، وطبق نقل مرة أخرى إلى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية.
- باستخدام ملقط مدبب، مكان 2-3 قطعة خزعة في كل بئر من لوحة 6 جيدا استعدادا تحتوي على 800 ميكرولتر وليس على الآبار الجافة. استخدام التنصت أو حركة انزلاق للحصول على قطعة لنعلق على الجزء السفلي من البئر. A مشرط هو مفيد لإزالة أي قطع خزعة من الملقط.
- وضع لوحة 6 جيدا في الحاضنة 37 درجة مئوية. رصد يومي للتأكد من هناك هو فيلم من الطلاء وسائل الإعلام في قاع البئر للأسبوع الأول، ويضاف 200 ميكرولتر ~ كل يوم 2 ليحل محل أي وسيلة إعلامية تبخرت.
- بعد أسبوع واحد، وزيادة كمية وسائل الإعلام إلى 2 مل من اكتمال FBS DMEM/20٪ وسائل الإعلام تغيير كل 2-3 أيام.
- مرة واحدة الخلايا الليفية هي متكدسة في كل بئر إلى النقطة حيث الخلايا الليفية يتم الوصول إلى حواف البئر، ويعرض للتريبسين مرور لوحة 6 جيدا إلى 2X T75 قوارير (مرور 1). يمكن نقل قطعة نسيج كذلك. فإنها لن نعلق وغسلها سUT خلال تغيير الوسائط التالية.
- مرة واحدة الخلايا الليفية هي متكدسة، نقلها إلى 3X T175 قوارير (مرور 2)، وتجميد في كامل وسائل الاعلام DMEM زائد DMSO 10٪ في الخلايا 1x10 6 / مل في القارورة.
4. توصيف الخلايا الليفية من خلال المناعية
- الخلايا الليفية الثقافة في 8 جيدا غرفة الشرائح المغلفة مع الجيلاتين.
- عندما تكون الخلايا في 80٪ confluency، نضح المتوسطة من كل بئر.
- إصلاح الخلايا في امتصاص العرق 4٪ لمدة عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- غسل الآبار 3 مرات مع 1X PBS.
- Permeabilize الخلايا مع 150 ميكرولتر من 0.3٪ تريتون X-100 (في برنامج تلفزيوني) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- غسل الآبار 3 مرات مع 1X PBS.
- إضافة 200 ميكرولتر حل حجب (PBS + 5٪ مصل الماعز العادي (المتجهات، S-1000)) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد التخفيف 1:250 الألغام المضادة للSERPHIN-1 (المضادة للأرنب، MAB، سيغما، S5950-200 ميكرولتر) في عرقلة الحل.
- Aspirate عرقلة الحل، وإضافة 150 ميكرولتر من التخفيف 1:250 من AntiSERPINH-1. احتضان عند 1-2 ساعة في درجة حرارة الغرفة، أو في 4 درجات مئوية خلال الليل.
- غسل الآبار 3 مرات مع 1X PBS.
- إعداد الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الماعز المضادة للأرنب 1:200 (اليكسا فلور الماعز المضادة للأرنب مفتش (H + L)، إينفيتروجن، A11008) في عرقلة الحل.
- إضافة 150 ميكرولتر من 1:200 الماعز المضادة للأرنب الأجسام المضادة وحيدة النسيلة إلى كل بئر. احتضان لمدة 1 ساعة، في الظلام، في درجة حرارة الغرفة.
- يغسل مرة واحدة مع الآبار 1XPBS.
- نضح في برنامج تلفزيوني، ورفع بعناية الدوائر قبالة لتكشف فقط الشريحة.
- تركيب الشريحة مع 2-3 قطرات من تصاعد المتوسطة التي تحتوي على دابي (المتجهات، H-1200).
- تحليل الشريحة تحت المجهر الفلورسنت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الكيراتينية نابتا من القطع الخزعة في أقرب وقت 48 ساعة بعد تشريح. ويمكن ملاحظة الخلايا الليفية أول ثمرة بعد حوالي أسبوع واحد من المعالجة. مرة واحدة وصلت إلى الآبار confluency، و passaged الخلايا الليفية لمدة أكثر الممرات لتصل إلى ثلاث قوارير 150 سم (T150) وcryopreserved الخلايا. نحن تولد مع هذا الأسلوب 15-20000000 الخلايا. الخلايا الليفية هي إيجابية لمكافحة SERPINH1 (المعروف أيضا باسم HSP-47) (الشكل 1)، وهو كوصي الجزيئية الكولاجين الخاصة المترجمة في الشبكة الإندوبلازمية. HSP47 يلعب دورا أساسيا في تخليق الكولاجين في الجلد الخلايا الليفية (كورودا، وآخرون، 2004).
خط الزمن
| يوم | توقع | ||
| يوم 3 - يوم 7 | المرفقات وثمرة من الخلايا الكيراتينية | يوم 7 - 14 يوم | ثمرة من الخلايا الليفية |
| يوم 25 يوم 35 | وينبغي أن تغطي الخلايا الليفية لوحة 6 جيدا وينبغي أن يكون لpassaged إلى قوارير 75CM، مرور للمرة الثانية في قوارير 150CM | ||
| يوم 30 يوم 50 | تجميد منصبه كرئيس 1Mio خلية / قارورة حوالي 15-20 خلايا ميو في وسائل الاعلام DMEM كاملة بالإضافة إلى 10٪ DMSO |
الشكل 1. المناعية المضادة للSERPHIN1 الثقافة الليفية المريض المستمدة مع دابي counterstaining.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مع هذا البروتوكول، ويمكن الحصول على الثقافات نقي نسبيا من الخلايا الليفية الجلد. الخلايا الليفية لها سمات شكلية متميزة من ممدود، أجسام الخلايا مثل مغزل، وجولة لنوى الخلايا البيضاوي، والخلايا الليفية تنمو في الانحياز وحزم عندما متموجة. تدعم وسائل الإعلام نمو الخلايا الليفية في حين السكان الخلية الأخرى مثل الخلايا الكيراتينية تحتاج ملاحق إضافية وعوامل النمو، أو هي ميتوتيكلي أقل نشاطا، وهذا يسمح للثقافات الليفية نقية نسبيا.
و passaged الخلايا الليفية في وقت لاحق مع التربسين في 01:03 إلى نسبة 01:05. يتم توسيع الثقافة لكمية المطلوب من الخلايا الليفية (15-20 مليون) في غضون 4-8 أسابيع.
باستخدام هذه التقنية، وقد استمدت المختبر لدينا أكثر من 70 خطوط الخلايا الليفية بنجاح. اختبرناها كل خط للتلوث الميكوبلازما وإضافة المضادات الحيوية إلى وسائل الإعلام لتجنب النمو الأخرى التلوث الجرثومي. لطثقافة يزدرع nitial وجدنا أن 20٪ FBS في وسائل الإعلام تدعم نمو، ومع ذلك، في وقت لاحق الممرات FBS 10٪ لا يكفي. في بعض الأحيان، نلاحظ ثمرة مباشرة من الخلايا الليفية من قطعة الجلد يفترض أن يعود إلى زاوية قطع من الجلد وإزالة البشرة الذي يحتوي على الخلايا الكيراتينية.
كان هناك تقنية مماثلة باستخدام ساترة إلى الاستمرار على قطعة الجلد أقل فعالية في أيدينا 4. ويرجع ذلك إلى حركة ساترة داخل الثقافة طبق، حتى عندما تعالج مع عظيم الرعاية من لم قطعة الجلد لا نعلق بشكل صحيح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وقد تم تمويل تطوير هذا البروتوكول من قبل معهد كاليفورنيا للطب التجديدي (CIRM، TR1-01246) وباركنسون التحالف.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting microscope | Leica | S6E | |
| 10 cm Tissue Culture Petri dish | VWR | 25382-166 | |
| 6-well Tissue Culture plate | VWR | 73520-906 | |
| Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex | VWR | 21909-660 | |
| Sterile pointed-tip forceps | |||
| 50 mL Conical tubes | VWR | 21008-940 | |
| 2 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-894 | |
| 5 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-896 | |
| 10 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-898 | |
| Pasteur Pipettes | VWR | 14672-380 | |
Table A. Table of specific reagents and equipments. |
|||
| 1X DMEM: High Glucose | Invitrogen/Gibco | 11960-069 | |
| 20% Fetal Bovine Serum | Invitrogen/Gibco | 26140-079 | |
| 1X L-Glutamine | Invitrogen/Gibco | 25030-164 | |
| 1X MEM Non-essential Amino Acids | Invitrogen/Gibco | 11140-076 | |
| 1X Penicillin/Streptomycin | Invitrogen/Gibco | 15140-163 | |
Table B. Reagents. |
|||
References
- Nguyen, H. N., et al. LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).
- Mak, S. K., Tewari, D., Tetrud, J. W., Langston, J. W., Schule, B. Mitochondrial dysfunction in skin fibroblasts from a Parkinson's disease patient with an alpha-synuclein triplication. Journal of Parkinson's Disease. 1, 175-183 (2011).
- Punch Zuber, T. J. biopsy of the skin. Am. Fam. Physician. 65, 1155-1164 (2002).
- Takashima, A. Establishment of fibroblast cultures. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 2, Unit 2, 1 (2001).
- Kuroda, K., Tajima, S. HSP47 is a useful marker for skin fibroblasts in formalin-fixed, paraffin embedded tissue specimens. J. Cutan. Pathol. , 241-246 (2004).
