Summary
ヒト皮膚パンチ生検からの線維芽細胞移植片培養プロトコルは、低継代数で約15〜20万人の細胞バンキングのため4-8週間以内に皮膚細胞を導出するために、技術的に堅牢かつ簡単な方法です。
Abstract
疾患を有する個体由来の組織および細胞株は、疾患関連細胞表現型を研究するための理想的な供給源である。このプロトコルにおける患者由来の線維芽細胞を正常にモデル疾患1に人工多能性幹細胞の誘導に用いられてきた。これらの線維芽細胞の初期の通路はまた、特定の疾患経路、機構2およびそれに続く薬剤スクリーニング手法を研究するために、細胞ベースの機能アッセイに使用することができる。酵素手続き上提示プロトコルの利点は、1）酵素処理を用いた高齢患者、パーキンソン病、2に罹患例えば患者）より挑戦的な方法論の上に技術的に簡単なアプローチから派生した組織の少量からの技術の再現性、および3ですの）時間を考慮：このプロトコルは、15〜20分かかりますし、生検到着した直後に行うことができます。酵素処理は、4時間までかかるとの問題を抱えていることができます過剰消化、細胞の生存と正しく処理されていない細胞のその後のアタッチメントの削減。このプロトコルは、4mmのヒト皮膚線維芽細胞培養物の誘導のための生検の切開及び調製を記載し、患者由来の組織サンプルを扱うときに重要である、非常に高い成功率を有している。この文化では、ケラチノサイトは、調製後最初の一週間以内に生検組織の外に移行します。線維芽細胞は7-10日ケラチノサイトの最初の伸長後に表示されます。 20％FBSを添加したDMEM高グルコース培地はケラチノサイトおよび線維芽細胞上の線維芽細胞の成長がケラチノサイトの過剰増殖します好む。 2継代後ケラチノサイトは線維芽細胞マーカーSERPINH1（HSP-47）を発現する、比較的均質な線維芽細胞培養の結果から希釈されています。このアプローチを使用して、15から20000000線維芽細胞は、細胞バンキングのため4-8週間のうちに誘導することができる。皮膚切開は15-20分ほどかかり、その後、細胞を一日一回監視され顕微鏡下で、メディアは2〜3日ごとに細胞の付着と伸長した後に変更されます。
Protocol
標準手順3（ 例えば 4ミリメートルラウンドVisipunch器で得られた）を使用して得皮膚パンチ生検は、氷の上で完全DMEM 20％FBS培地で保たれるべきである。いったんサンプルは実験室に到着した、できるだけ早く生検を処理する。
1。皮膚パンチ生検の準備
STEPS 1.1から1.3には、バイオセーフティキャビネット内で実行されるべきである
- 予め調製：6ウェルプレートの各ウェルに0.1％ゼラチンを1 mlを加える。 30-60分間脇にプレートを設定します。ゼラチン溶液を吸引除去し、各ウェルに完全DMEM/20％FBS培地800μlのを追加します。ウェルの表面全体がメディアで覆われていることを確認してください。
- 滅菌10センチ組織培養皿の蓋を反転し、蓋の中央にDMEM / 20％FBS培地1.5mlのを追加し、血清ピペットの先端とメディアドロップを広げる。
- 滅菌ピンセットを使用して、場所T彼は皮膚皿にメディアで作品を生検。
2。皮膚パンチ生検の解剖
STEPS 9 2.1から2.2、水平層流フード内で実行されるべきである
- 反転した蓋の上に10センチ皿の底の部分を置き、層流フード内解剖顕微鏡に皮膚生検を転送します。
- 場所で生検を保持するために、1メスを使用し、一つの方向に転動でカットすることが第二のメス等分にピースをカットして、シャープなエッジを持つ12-15均等なサイズの部分に4ミリラウンド皮膚生検を解剖。不規則なエッジを持つ個貧しいアタッチメント/細胞伸長に貢献しています。
3。組織培養プレートに解剖皮膚生検個の譲渡
STEPSは、3.1から3.6バイオセーフティキャビネット内で実行されるべきである
- 10センチ組織培養皿の底部を配置する反転蓋の上に、とバイオセーフティキャビネットにに戻っ皿を移す。
- ドライウェルに800μlのではなく、を含む調製された6ウェルプレートの各ウェルに尖った鉗子、場所2-3生検部分を使用して。井戸の底に付着する部分を取得するにはタップまたはスライドモーションを使用してください。メスは、鉗子からの生の部分を除去するのに有用である。
- 37℃のインキュベーター内で6ウェルプレートを置きます。メディアコーティングのフィルムは最初の週のために井戸の底があることを確認するために、毎日監視し、任意の蒸発メディアを交換するには2日ごとに〜200μLを加える。
- 1週間後、2〜3日ごとに完全なDMEM/20％FBS 2mlのにメディアの量を増加させ、メディアを変更してください。
- 一度線維芽細胞は線維芽細胞が2X T75フラスコ（継代1）に入っても、トリプシン処理及び通路6ウェルプレートの縁に達している点に、各ウェルに合流されています。組織片も同様に転送することができる。彼らは、Oを添付せず、洗浄することが次のメディア変更時UT。
- 一度線維芽細胞がコンフルエントあり、バイアルあたり1×10 6細胞/ mlで完全DMEM培地プラス10％のDMSOで凍結、3X T175フラスコ（通路2）に転送します。
4。免疫染色を通してキャラ線維芽細胞を
- 8ウェルチャンバースライドでの培養線維芽細胞は、ゼラチンでコーティング。
- 細胞が80％コンフルエントにあるとき、各ウェルから培地を吸引。
- 室温で10分間4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定する。
- 1X PBSでウェルを3回洗浄します。
- 0.3％150μlのトリトンX-100、室温で5分間（PBS中）で細胞を透過性。
- 1X PBSでウェルを3回洗浄します。
- 室温で1時間、200μlのブロッキング溶液（PBS + 5％正常ヤギ血清（ベクター、S-1000））を加える。
- ブロッキング溶液でアンチSERPHIN-1（抗ウサギ、MAB、シグマ、S5950-200μL）の1:250希釈を準備します。
- Aブロッキング溶液をspirate、とAntiSERPINH-1の1:250希釈150μlのを追加します。室温で1〜2時間でインキュベートする、または4℃で一晩。
- 1X PBSでウェルを3回洗浄します。
- ブロッキング溶液で1:200ヤギ抗ウサギモノクローナル抗体（Alexaの弗素ヤギ抗ウサギIgG（H + L）、Invitrogen社、A11008）を準備する。
- 各ウェルに1:200ヤギ抗ウサギモノクローナル抗体150μlのを追加します。室温で1時間、暗所で、インキュベートする。
- 1xPBSで一回井戸を洗浄します。
- PBSを吸引し、慎重にだけスライドを明らかにするためにチャンバーを持ち上げ。
- DAPI（ベクター、H-1200）を含む培地を取り付ける2-3滴でスライドをマウントします。
- 蛍光顕微鏡下でスライドを分析します。
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Representative Results
ケラチノサイトは解剖後の48時間とすぐに生検片の外に成長しています。最初の線維芽細胞の伸長は、処理後1週間程度を観察することができる。井戸がコンフルエントに達した後3 150センチメートルフラスコ（T150）と細胞に到達するには、2つ以上の通路は凍結保存されているため、線維芽細胞を継代する。我々はこの方法で15から20000000までのセルを生成します。線維芽細胞は、小胞体に局在コラーゲン特異的分子シャペロンである抗SERPINH1（また、HSP-47として知られています）（ 図1）、のために陽性である。 HSP47は皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン生合成（クロダら 、2004）において重要な役割を果たしている。
タイムライン
| デイ | 期待 | ||
| 3日目 - 第7日 | ケラチノサイトのアタッチメントと伸長 | 7日目 - 14日目 | 線維芽細胞の伸長 |
| 日25 35日 | 線維芽細胞は、6ウェルプレートをカバーする必要がありますし、通路を二回150センチメートルフラスコに、75センチメートルフラスコに継代のためでなければなりません | ||
| 50日30日 | 完全DMEM培地に加え、10％DMSOに15-20澪セルに関する1Mio細胞/バイアルとしてダウンフリーズ |
図1のDAPI対比患者由来の線維芽細胞培養の抗SERPHIN1免疫組織化学。
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Discussion
このプロトコルを使用して、皮膚線維芽細胞の比較的純粋な培養物を得ることができる。線維芽細胞は楕円形の細胞核へのラウンド細長い紡錘状細胞体の特徴的な形態学的特徴を持っており、線維芽細胞が整列し、バンドル時合流で育つ。他の細胞集団などのケラチノサイトが追加料金と成長因子を必要とするか、有糸分裂活性が低いのに対し、メディアは線維芽細胞の成長をサポートしています、これは比較的純粋な線維芽細胞培養を可能にします。
線維芽細胞は、その後、1:5比1:3でトリプシンで継代する。文化は4-8週間以内に、線維芽細胞の所望の量（15〜20万円）に展開されます。
この技法を使用して、我々の研究室では、正常線維芽細胞70回線で派生しています。私たちは、マイコプラズマ汚染のために、すべての行をテストし、他の細菌汚染を避けるために、増殖培地に抗生物質を追加しました。 iについてnitial植文化は我々はメディアでは20％FBS、後で10％FBSを通路には、しかし、成長をサポートしていることがわかっただけで十分です。時折、我々は、皮膚やケラチノサイトが含まれている表皮の除去の切断角度におそらく起因する皮膚片からの線維芽細胞の直接伸長を観察します。
皮の部分を押したままにカバースリップを使用した同様の技術は我々の手の4はあまり効果的であった。カバースリップの動きに起因する培養皿であっても、偉大で処理するとき内ケア皮膚片が適切に添付しませんでした。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
このプロトコルの開発は再生医療のためのカリフォルニア工科大学（CIRM、TR1-01246）とパーキンソンアライアンスによって資金を供給された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting microscope | Leica | S6E | |
| 10 cm Tissue Culture Petri dish | VWR | 25382-166 | |
| 6-well Tissue Culture plate | VWR | 73520-906 | |
| Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex | VWR | 21909-660 | |
| Sterile pointed-tip forceps | |||
| 50 mL Conical tubes | VWR | 21008-940 | |
| 2 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-894 | |
| 5 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-896 | |
| 10 mL Serological Pipettes | VWR | 89130-898 | |
| Pasteur Pipettes | VWR | 14672-380 | |
Table A. Table of specific reagents and equipments. |
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| 1X DMEM: High Glucose | Invitrogen/Gibco | 11960-069 | |
| 20% Fetal Bovine Serum | Invitrogen/Gibco | 26140-079 | |
| 1X L-Glutamine | Invitrogen/Gibco | 25030-164 | |
| 1X MEM Non-essential Amino Acids | Invitrogen/Gibco | 11140-076 | |
| 1X Penicillin/Streptomycin | Invitrogen/Gibco | 15140-163 | |
Table B. Reagents. |
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References
- Nguyen, H. N., et al. LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).
- Mak, S. K., Tewari, D., Tetrud, J. W., Langston, J. W., Schule, B. Mitochondrial dysfunction in skin fibroblasts from a Parkinson's disease patient with an alpha-synuclein triplication. Journal of Parkinson's Disease. 1, 175-183 (2011).
- Punch Zuber, T. J. biopsy of the skin. Am. Fam. Physician. 65, 1155-1164 (2002).
- Takashima, A. Establishment of fibroblast cultures. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 2, Unit 2, 1 (2001).
- Kuroda, K., Tajima, S. HSP47 is a useful marker for skin fibroblasts in formalin-fixed, paraffin embedded tissue specimens. J. Cutan. Pathol. , 241-246 (2004).
