بروتوكول ثقافة يزدرع الخلايا الليفية من الخزعات لكمة جلد الإنسان هو وسيلة قوية من الناحية الفنية وبسيطة لاستخلاص خلايا الجلد في غضون 4-8 أسابيع للأعمال المصرفية من حوالي 15-20 مليون خلية في عدد مرور منخفض.
Abstract
الأنسجة وخطوط الخلايا المشتقة من الفرد مع المرض هي مصادر المثالي لدراسة الظواهر الخلوية المرتبطة بتلك الأمراض. الخلايا الليفية المريض المستمدة في هذا البروتوكول قد استخدمت بنجاح في اشتقاق الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها المرض إلى نموذج 1. ويمكن أيضا الممرات في وقت مبكر من هذه الخلايا الليفية أن تستخدم لالمقايسات الفنية المستندة إلى الخلايا لدراسة مسارات محددة المرض، وآليات 2 والنهج فحص المخدرات لاحقة. الاستفادة من بروتوكول المعروضة على الإجراءات الأنزيمية هي 1) استنساخ هذه التقنية من كميات صغيرة من الأنسجة المستمدة من المرضى من كبار السن، مثل المرضى المصابين يعانون من مرض باركنسون، 2) نهج بسيط من الناحية الفنية على منهجيات أكثر تحديا باستخدام العلاجات الأنزيمية، و3 ) النظر الوقت: هذا البروتوكول يأخذ 15-20 دقيقة ويمكن القيام بها على الفور بعد وصول الخزعة. العلاجات الأنزيمية يمكن أن يستغرق فترة تصل الى 4 ساعات ولها مشاكلoverdigestion، والحد من بقاء الخلية والمرفقات اللاحقة من الخلايا عندما لم يتم التعامل معها بشكل صحيح. يصف هذا البروتوكول تشريح وإعداد الجلد البشري 4 ملم خزعة لاشتقاق ثقافة الخلايا الليفية، ولها نسبة نجاح عالية جدا وهو أمر مهم عند التعامل مع عينات الأنسجة المشتقة من المريض. في هذه الثقافة، الكيراتينية تهاجر من الأنسجة خزعة خلال الأسبوع الأول بعد إعداد. الخلايا الليفية تظهر بعد 7-10 أيام ثمرة أول من الخلايا الكيراتينية. DMEM وسائل الإعلام ارتفاع نسبة الجلوكوز تستكمل مع FBS 20٪ تفضل ونمو الخلايا الليفية أكثر من الخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية اكتسى الخلايا الكيراتينية. بعد 2 الممرات وقد تضعف الخلايا الكيراتينية خارج مما أدى إلى الثقافات الليفية متجانسة نسبيا والذي يعبر عن الخلايا الليفية SERPINH1 علامة (HSP-47). باستخدام هذا النهج، يمكن أن تستمد 15-20000000 الخلايا الليفية في 4-8 أسابيع للأعمال المصرفية الخلية. تشريح الجلد يستغرق حوالي 15-20 دقيقة، ثم يتم رصد خلايا مرة واحدة في اليومتحت المجهر، وسائل الإعلام يتم تغيير بعد كل 2-3 أيام المرفقات وثمرة من الخلايا.
Protocol
يجب أن تبقى على الجلد التي تم الحصول عليها لكمة خزعة باستخدام الإجراء القياسي 3 (على سبيل المثال تم الحصول عليها مع 4MM صك Visipunch جولة) في كامل DMEM 20٪ FBS وسائل الاعلام على الجليد. مرة واحدة قد وصلت العينة في المختبر، معالجة خزعة في أقرب وقت ممكن. <p class="jove_title" style="…
Representative Results
الكيراتينية نابتا من القطع الخزعة في أقرب وقت 48 ساعة بعد تشريح. ويمكن ملاحظة الخلايا الليفية أول ثمرة بعد حوالي أسبوع واحد من المعالجة. مرة واحدة وصلت إلى الآبار confluency، و passaged الخلايا الليفية لمدة أكثر الممرات لتصل إلى ثلاث قوارير 150 سم (T150) وcryopreserved الخلايا. نحن تولد م…
Discussion
مع هذا البروتوكول، ويمكن الحصول على الثقافات نقي نسبيا من الخلايا الليفية الجلد. الخلايا الليفية لها سمات شكلية متميزة من ممدود، أجسام الخلايا مثل مغزل، وجولة لنوى الخلايا البيضاوي، والخلايا الليفية تنمو في الانحياز وحزم عندما متموجة. تدعم وسائل الإعلام نمو الخلاي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل تطوير هذا البروتوكول من قبل معهد كاليفورنيا للطب التجديدي (CIRM، TR1-01246) وباركنسون التحالف.
Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schüle, B. Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts. J. Vis. Exp. (77), e3779, doi:10.3791/3779 (2013).