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Medicine

인간의 기본 섬유 아세포의 유도를위한 피부 펀치 생검 절편 문화

doi: 10.3791/3779 Published: July 7, 2013

Summary

인간의 피부 펀치 생검에서 섬유 아세포의 절편 배양 프로토콜은 낮은 통로 번호로 만 15-20 세포 은행을위한 4-8 주 이내에 피부 세포를 유도하기 위해 기술적으로 강력하고 간단한 방법입니다.

Abstract

질병을 가진 개인에서 파생 된 조직 및 세포 라인 질병 관련 세포의 표현형을 연구하는 이상적인 소스입니다. 이 프로토콜에서 환자 유래 섬유 아세포가 성공적으로 모델 병 1 유도 만능 줄기 세포의 유도에 사용되었습니다. 이 섬유 아세포의 초기 구절은 특정 질병 경로, 기계 2 및 후속 약물 검사 방식을 연구하기 위해 셀 기반 기능 분석에 사용할 수 있습니다. 효소 절차를 통해 제시된 프로토콜의 장점은 1) 효소 처리를하여 노인 환자, 파킨슨 병, 2에 영향을 예를 들면 환자) 더 도전적인 방법론을 통해 기술적으로 간단한 방법에서 파생 된 조직의 소량의 기술의 재현성 및 3아르 ) 시간 고려 사항 :이 프로토콜은 15 ~ 20 분을 소요하고 생검 도착 후 바로 수행 할 수 있습니다. 효소 처리는 4 시간까지 걸릴와의 문제가있을 수 있습니다세포 생존 제대로 처리하지 세포의 후속 첨부 overdigestion, 감소. 이 프로토콜은 4 mm 인간의 피부 섬유 아세포 문화 유도를위한 생검의 해부 및 준비를 설명하고 환자 파생 된 조직 샘플을 다룰 때 중요한 매우 높은 성공률을 가지고 있습니다. 이 문화에서는, 각질이 준비 후 첫 일주일 이내에 생검 조직에서 마이그레이션 할 수 있습니다. 섬유 아 세포는 각질의 첫 번째 파생물 후에 7-10 일이 나타납니다. 20 % FBS와 보충 DMEM 높은 포도당 미디어 각질 섬유 아세포에 섬유 아세포의 성장 각질을 자랄 것입니다 하시 더군요. 이 구절 후 각질 섬유 아세포 마커 SERPINH1 (HSP-47)를 표현 비교적 균질 한 섬유 아세포 배양 결과 중 희석되었다. 이 방법을 사용하여 15-20000000 섬유 아세포는 세포 은행을위한 4-8 주 얻을 수 있습니다. 피부 절개는 15 ~ 20 분 소요, 세포는 다음 하루에 한 번 모니터링하는현미경, 미디어 2-3 일마다 부착과 세포의 파생물 후 변경됩니다.

Protocol

펀치 생검이 표준 절차 3 (예를 들어, 4mm 라운드 Visipunch 계기로 얻은)를 사용하여 얻은 피부는 얼음에 완전한 DMEM 20 % FBS 매체에 보관해야합니다. 일단 샘플을 실험실에 도착, 가능한 한 빨리 조직 검사를 처리합니다.

1. 피부 펀치 생검의 준비

단계 1.1-1.3는 생명 공학 안전성 캐비닛 내부 수행해야 할

  1. 사전 준비 : 6 잘 플레이트의 각 웰에 젤라틴 0.1 %의 1 ML을 추가합니다. 30-60 분 동안 옆에 접시를 설정합니다. 젤라틴 용액을 흡입하고 각 well에 완료 DMEM/20 % FBS 매체 800 μl를 추가합니다. 잘의 전체 표면은 매체와 적용되어 있는지 확인합니다.
  2. 멸균 10cm 조직 문화 접시의 뚜껑을 반전하고 뚜껑의 중앙에 1.5 DMEM의 ML / 20 % FBS 미디어를 추가하고 혈청 피펫 팁 용지 드롭을 확산.
  3. 멸균 집게를 사용하여, 장소 t그는 피부 접시에 미디어 조각을 생검.

2. 피부 펀치 생검의 해부

9 2.1-2.2 단계는 수평 층류 후드 안쪽에 수행해야 할

  1. 거꾸로 뚜껑에 10cm 접시의 바닥 부분을 놓고, 피부가 층류 후드 해부 현미경 조직 검사 전송할 수 있습니다.
  2. 장소에 생검을 보유하는 하나의 메스를 사용하여 한 방향으로 회전 운동으로 잘라 두 번째 메스 같은 반에서 조각을 절단하여 날카로운 모서리를 가진 12-15 균등하게 크기의 조각으로 4 mm 라운드 피부 생검을 해부하다. 비정형 가장자리와 조각이 좋지 첨부 / 세포 부산물에 기여한다.

3. 해부 피부의 전송 조직 배양 플레이트에 조각 생검

단계 3.1-3.6 생명 공학 안전성 캐비닛 내부 수행해야 할

  1. 10cm 조직 문화 접시의 바닥 부분을 배치거꾸로 뚜껑 및 전송 접시 위에 다시 생물 안전 캐비닛에에.
  2. 마른 우물에 800 μL 및하지를 포함하는 준비된 6 잘 플레이트의 각 웰에 뾰족한 집게, 장소 2-3 생검 조각을 사용. 조각이 잘 하단에 부착 얻기 위해 운동을 도청하거나 슬라이딩을 사용합니다. 메스 집게에서 모든 생검 조각을 제거하는 데 유용합니다.
  3. 37 ° C 배양기에서 6 잘 플레이트를 놓습니다. 어떤 증발 매체를 대체하는 매 2 일 1 ~ 200 μl를 추가, 미디어 코팅 첫 주에 대한 우물의 바닥의 영화가 있는지 확인하기 위해 매일 모니터링합니다.
  4. 일주일이 지난 뒤, 전체 DMEM/20 % FBS 및 변경 매체 2-3 일마다 2 ㎖에 미디어의 양을 증가시킵니다.
  5. 일단 섬유 아세포는 섬유 아 세포 2X T75 플라스크 (통로 1)에 잘 trypsinize 및 통로 6 잘 플레이트의 가장자리에 도달하는 시점에 각 우물에 합류한다. 조직의 조각뿐만 아니라 전송할 수 있습니다. 그들은 (을)를 부착하지 않으며 세척 할 수다음 미디어의 변화 동안 유타.
  6. 일단 섬유 아 세포가 합류하다, 배 T175 플라스크 (통과 2) 완전한 DMEM 매체 동결 플러스 1X10 6 세포 / 유리 병 ml 당 10 %의 DMSO로 전송할 수 있습니다.

4. 면역 염색을 통해 특성화 섬유 아세포를

  1. 8 잘 챔버 슬라이드 문화 섬유 아 세포는 젤라틴으로 코팅.
  2. 세포가 자랄 때 80 %에있을 때, 각 우물에서 매체를 대기음.
  3. 상온에서 십분 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정합니다.
  4. 1X PBS로 우물 3 번 씻으십시오.
  5. 0.3 %의 150 μL와 세포를 Permeabilize 트리톤 실온에서 5 분간 X-100 (PBS)입니다.
  6. 1X PBS로 우물 3 번 씻으십시오.
  7. 실온에서 1 시간 동안 200 μL 차단 솔루션 (PBS + 5 % 정상 염소 혈청 (벡터, S-1000))를 추가합니다.
  8. 솔루션을 차단하는 안티 SERPHIN-1 (안티 - 토끼, 단클론 항체, 시그마, S5950-200 μL)를 1:250 희석을 준비합니다.
  9. 차단 솔루션을 spirate 및 AntiSERPINH-1의 1:250 희석 150 μl를 추가합니다. 실온에서 1-2 시간을 품다, 4 ° C에서 하룻밤.
  10. 1X PBS로 우물 3 번 씻으십시오.
  11. 솔루션을 차단에 1:200 염소 안티 - 토끼 단클론 항체 (알렉사 플 루어 염소 안티 - 토끼 IgG의 (H + L), Invitrogen의, A11008)를 준비합니다.
  12. 각 well에 1:200 염소 안티 - 토끼 단클론 항체의 150 μl를 추가합니다. 상온에서, 어둠 속에서 1 시간 동안 배양한다.
  13. 1XPBS 한 번 우물을 씻으십시오.
  14. PBS를 대기음,주의 깊게 그냥 슬라이드를 나타 내기 위해 챔버를 들어 올립니다.
  15. DAPI (벡터, H-1200)를 포함하는 설치 매체의 2 ~ 3 방울 슬라이드를 장착합니다.
  16. 형광 현미경 슬라이드를 분석합니다.

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Representative Results

각질 박리 후 48 시간 자마자 생검 조각의 성장. 처음으로 섬유 아세포의 파생물은 주일 정도 처리 한 후 관찰 할 수있다. 우물 confluency에 도달하면, 섬유 아세포는 세 150cm 플라스크 (T150)에 도달하기 위해 두 개 더 구절에 대한 계대하고 세포를 냉동 보존됩니다. 우리는이 방법 15-20000000 세포를 생성합니다. 섬유 아세포는 소포체로 번역 콜라겐 특정 분자 보호자입니다 안티 SERPINH1 (또한 HSP-47라고도 함) (그림 1)에 대한 긍정적이다. HSP47은 피부 섬유 아세포의 콜라겐 생합성 (구로다, 외, 2004)에서 중요한 역할을한다.

타임 라인

하루 기대
3 일 - 7 일 각질의 부착 및 파생물 7 일 - 14 일째 섬유 아세포의 파생물
하루 25 - 35 일 섬유 아세포는 6 잘 플레이트를 커버해야하고 150cm 플라스크에 75cm 플라스크 통과 번째 시간으로 계대를 위해해야​​한다
일 30 일 50 완전한 DMEM 미디어 플러스 10 % DMSO에 15-20 미오 셀에 대한 1Mio 세포 / 유리 병으로 아래로 동결


그림 1. DAPI의 counterstaining 환자 유래 섬유 아세포 문화의 안티 SERPHIN1 면역.

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Discussion

이 프로토콜을 통해 피부 섬유 아세포 상대적으로 순수 배양을 얻을 수 있습니다. 섬유 아세포는 타원형 세포 핵에 둥근 길쭉한, 스핀들 같은 세포 기관의 특성을 형태 학적 특징을 가지고 때 합류 섬유 아세포는 정렬 및 번들에서 성장. 매체는 섬유 아세포의 성장 예를 들어, 각질 추가 보충 및 성장 인자를 필요로하거나 세포 분열 덜 활성화되어 다른 세포 집단 반면이 상대적으로 순수한 섬유 아세포 배양을 허용을 지원합니다.

섬유 아세포는 이후 1:5 비율 1:3 트립신으로 계대 있습니다. 문화 4-8 주 이내에 섬유 아세포의 원하는 양 (15 ~ 20 백만)으로 확장됩니다.

이 기술을 사용하여, 우리의 실험이 성공적으로 70 섬유 아세포 회선을 통해 도출 하였다. 우리는 마이코 플라스마 오염 모든 라인을 테스트하고 다른 세균 오염을 방지하기 위해 성장 매체에 항생제를 추가했다. 나에 대한nitial explant의 문화는 우리가 미디어 20 % FBS 나중에 10 % FBS를 통로에서, 그러나 성장을 지원하는 것으로 충분합니다. 때때로, 우리는 피부 각질을 포함하는 표피의 제거의 절단 각도 아마도 때문에 피부 조각에서 섬유 아세포의 직접적인 부산물을 준수하십시오.

피부 조각을 누르고 coverslip을 사용하여 유사한 기술은 우리의 손 4 덜 효과적이었다. 내 coverslip에의 이동으로 인해 문화 접시, 심지어으로 처리 할 때 신중-피부 조각이 제대로 연결되지 않았다.

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Disclosures

저자는 공개 아무것도 없어.

Acknowledgments

이 프로토콜의 개발은 재생 의료에 대한 캘리포니아 연구소 (CIRM, TR1-01246)와 파킨슨 연합에 의해 투자되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissecting microscope Leica S6E
10 cm Tissue Culture Petri dish VWR 25382-166
6-well Tissue Culture plate VWR 73520-906
Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex VWR 21909-660
Sterile pointed-tip forceps
50 mL Conical tubes VWR 21008-940
2 mL Serological Pipettes VWR 89130-894
5 mL Serological Pipettes VWR 89130-896
10 mL Serological Pipettes VWR 89130-898
Pasteur Pipettes VWR 14672-380

Table A. Table of specific reagents and equipments.

1X DMEM: High Glucose Invitrogen/Gibco 11960-069
20% Fetal Bovine Serum Invitrogen/Gibco 26140-079
1X L-Glutamine Invitrogen/Gibco 25030-164
1X MEM Non-essential Amino Acids Invitrogen/Gibco 11140-076
1X Penicillin/Streptomycin Invitrogen/Gibco 15140-163

Table B. Reagents.

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References

  1. Nguyen, H. N., et al. LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).
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  5. Kuroda, K., Tajima, S. HSP47 is a useful marker for skin fibroblasts in formalin-fixed, paraffin embedded tissue specimens. J. Cutan. Pathol. 241-246 (2004).
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Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schüle, B. Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts. J. Vis. Exp. (77), e3779, doi:10.3791/3779 (2013).More

Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schüle, B. Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts. J. Vis. Exp. (77), e3779, doi:10.3791/3779 (2013).

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